以tau 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 以 tau 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略 Therapeutic strategies targeting tau aggregation for Alzheimer's disease. 研究生：陳炫江 Hsuan-Chiang Chen. 指導教授：李桂楨博士 Guey-Jen Lee-Chen. 中華民國 102 年 7 月.

(2) 目錄目錄............................................................................................................. I 中文摘要 ................................................................................................. IV Abstract..................................................................................................... V 圖表目錄 ................................................................................................. VI. 壹、緒. 論 ...........................................................................................1. 一、阿茲海默氏症..............................................................................1 二、神經病理特徵及生化學 ............................................................. 2 三、病因學 ..........................................................................................4 四、AD 治療策略 ............................................................................................ 6 貳、研究目的 ............................................................................................8. 參、研究材料與方法 ................................................................................9 一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體 ............................... 9 二、細菌電穿孔(electroporation)轉型作用(transformation) ............9 三、質體 DNA 的小量製備 ............................................................. 10 四、質體 DNA 的大量製備及純化 .................................................11 五、細胞株繼代培養........................................................................12 六、基因轉染(transfection) .............................................................. 13 七、即時聚合酶鏈鎖反應分析細胞誘導基因表現 .......................14 I.

(3) 八、利用西方墨點法分析細胞誘導蛋白表現 ............................... 16 九、高通量影像系統分析ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞試驗 ..... 18 十、高通量影像系統分析ΔK280tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞試驗. ............................................................................................................19 肆、結果 ..................................................................................................20 一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體的確認 ...................20 二、Doxycycline 誘導表現 tauRD-DsRed 293 細胞株之建立 ........20 三、tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞誘導表現 ....................................21 四、促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD -DsRed 293 細胞之中草藥及植物萃取物篩選................................................................................22 五、促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD -DsRed 293 細胞之吲哚基喹啉衍生物篩選 ....................................................................................23 六、促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD -DsRed 293 細胞之 GSK-3β 抑制劑類似物篩選............................................................................24 七、促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD -DsRed SH-SY5Y 細胞之 GSK 先導藥物篩選 ....................................................................................25 八、先導藥物處理促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之蛋白表現分析 ......................................................26 伍、討論 ..................................................................................................28 II.

(4) 一、tauRD-DsRed 293 細胞誘導表現 ...............................................28 二、小分子化合物及植物萃取物對蛋白錯誤折疊作用 ...............28 三、Chaperones 對防止蛋白錯誤折疊作用 ...................................30 四、先導藥物對ΔK280 tauRD SH-SY5Y 作用............................... 31 伍、參考文獻 ..........................................................................................33 陸、附錄圖表 ..........................................................................................39. III.

(5) 摘要阿茲海默氏症是一種漸近性的神經退化性疾病，主要病理特徵包括細胞外間質的 Aβ 胜肽堆積，及細胞內高度磷酸化 tau 形成的神經纖維糾結。由於 tau 聚集與阿茲海默氏症進程具相關性，因此透過抑制或消除 tau 聚集或可保護受影響之神經細胞。本研究構築 tau 蛋白微管結合重複區域(tauRD)之野生型(K18)及第 280 位置賴胺酸缺失的促 tau 聚集突變型(ΔK280)與 DsRed 紅螢光蛋白融合之 tauRD-DsRed 基因，來建立誘導表現 tauRD-DsRed 之 Tet-On 293 與 Tet-On SH-SY5Y 細胞，作為藥物篩檢平台，來篩檢可抑制 tauRD 聚集的抑制物，並對這些具聚集抑制性的化合物或中草藥、植物萃取物等，檢測其神經保護機制。在 Tet-On 293 細胞誘導 tauRD-DsRed 蛋白表現後，ΔK280 突變型細胞螢光亮度較野生型細胞顯著減少。以剛果紅(正控制組)處理細胞後，突變型細胞的紅螢光亮度較野生型者更能有效提升。對於 293 促 tau 聚集突變型細胞，在細胞數無顯著影響下，前處理 NC009-1、-2、-3、-6、-7 (吲哚基喹啉化合物 ) 、 NTNU-003 、 -008 (GSK-3β 抑制劑類似物 ) 、 NH021 、 NTNU-043、-057、-059、-224、NTNU-309、-313、-319、-331、-379 (中草藥或植物萃取液)等皆可顯著提升 DsRed 紅螢光亮度。以維他命 A 酸誘導ΔK280 促 tau 聚集突變型 SH-SY5Y 細胞神經分化後，螢光顯微影像分析顯示神經突觸生長性狀(包含總生長及突起數、分支數)較野生型 K18 細胞顯著下降。以 NC009-1、-7 及 NTNU-008 前處理突變型 SH-SY5Y 細胞後，可顯著提升神經突觸總生長性狀，並可提升 HSP27 蛋白(NC009-1、-7)或 GRP 78、HSP27 蛋白(NTNU-008)的表現。關鍵字：阿茲海默氏症、神經退化性疾病、tau 聚集、吲哚基喹啉化合物、GSK-3β抑制劑類似物、神經突觸生長 IV.

(6) Abstract Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder associated with accumulation of extracellular amyloid-β and intracellular tau-associated neurofibrillary tangles (NFTs). The aggregation of tau in AD correlates with the clinical progression of the disease and inhibition or reversal of tau aggregation may protect the affected neurons. In this study wild type (K18) and pro-aggregation mutant (ΔK280) of repeat domain of tau (tauRD) was fused with DsRed (tauRD-DsRed fusion gene) and used to generate Tet-On 293 and SH-SY5Y cell clones as drug screening platforms. Inhibitors that retard or block ∆K280 tau aggregation can be distinguished by increasing fluorescence on Tet-On 293 cells. For those compounds/herbs with putative aggregate inhibitors, mechanisms of neuroprotection were determined. Upon induction with doxycycline, red fluorescence in ΔK280 tauRD-DsRed 293 cells was significantly reduced compared to that in wild type cells. As a positive control, congo red increased red fluorescence more effectively in ΔK280 tauRD-DsRed 293 cells than in wild type cells. Without significantly reducing cell numbers, pretreatment of NC009-1, -2, -3, -6, -7 (indolylquinoline compounds), NTNU-003, -008 (GSK-3 inhibitor-like compounds), NH021, NTNU-043, -057, -059, -224, -309, -313, -319, -331, -379 (herbal extracts) resulted in significant increased fluorescence on ∆K280 tauRD-DsRed cells. For SH-SY5Y cell clones, retinoic acid treatment generated cells resemblance to adult neurons. Fluorescent microscopy examination revealed that neurite outgrowth (including total outgrowth, process and branch) was significantly reduced in ΔK280 tauRD-DsRed cells compared to that in wild type cells. NC009-1, -7 and NTNU-008 significantly increased neurite total outgrowth in ΔK280 SH-SY5Y cells, accompanying with enhanced HSP27 (NC009-1 and -7) or GRP78 and HSP27 (NTNU-008) expression. Keywords: Alzheimer's disease, neurodegenerative disorder, tau aggregation, indolylquinoline, GSK-3 inhibitor-like compounds, neurite outgrowth V.

(7) 圖表目錄圖一、 pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 質體建構………………………………39 圖二、誘導表現 tauRD-DsRed 細胞建立流程圖………………………………40 圖三、 pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體………………………………41 圖四、 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 293 細胞記述……………………………42 圖五、 K18 及∆K280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞記述……………………44 圖六、中草藥及植物萃取物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選………………………………...........................................................46 圖七、吲哚喹啉衍生物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選……………………………………………………………………………………….48 圖八、 GSK-3β 抑制劑類似物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選……………………………………………………………………………………….49 圖九、 GSK-3β 抑制劑類似物及吲哚喹啉衍生物於ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之藥物篩選………………………………50 圖十、 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞處理先導藥物之蛋白檢測………………………………………………………………………………………52. VI.

(8) 壹、緒論. 一、阿茲海默氏症. 阿茲海默氏症(Alzheimer's disease；簡稱 AD)，最早在 1906 年由德國精神科及神經病理學醫生 Alzheimer 所診斷描述，是失智症 (dementia) 中最普遍的一種神經退化疾病 (Berchtold and Cotman, 1998)。雖然大部分的患者診斷年紀在 65 歲以上，但仍有少數早發形式出現(early-onset AD)，其盛行率在未來 20 年將增加一倍，在 2050 年估計約有 1.15 億人受到影響。目前而言，各區域盛行率(prevalence) 存在差異，全球估計在 60 歲以上人口 AD 患者約佔有 3.9%。在發生率(incidence)風險分析顯示，失智症中女性患者大約為男性兩倍，而罹患 AD 風險女性患者是男性三倍(Fratiglioni et al., 1997; Povova et al., 2012)。大部 AD 患者共同症狀是逐漸產生新訊息記憶上困難。在初期時普遍症狀主要對於最近周遭事物不能夠回想而形成新的記憶，例如在學習效率、工作記憶以及心理動作速度(psychomotor speed)認知功能下降。除此之外，部分患者也可能伴隨焦慮不安(agitation)以及急躁易怒(irritability)等現象(Isik, 2010; Siddique et al., 2009)。 AD 患者腦部病理特徵主要在新皮質 (neocortex) 、海馬迴 1.

(9) (hippocampus)、杏仁核(amygdala)以及 Meynert 基底核(nucleus basalis of Meynert)位置，出現細胞損失、老年瘢塊(senile plaques；簡稱 SPs)、神經纖維糾結(neurofibrillary tangles；簡稱 NFTs)等，並有少部分病徵出現於丘腦內側核(medial nucleus of the thalamus)、背側蓋部(dorsal tegmentum)、旁中線網狀核(paramedian reticular area)以及下視丘外側區(the lateral hypothalamic nuclei) (Wenk, 2003)。除了不僅是膽鹼性及麩胺酸性神經元的選擇性細胞損失之外，在此兩種神經細胞中異常的功能表現也是影響 AD 的認知症狀主要因素(Wenk, 2006)。. 二、神經病理特徵及生化學. 在 AD 患者其細胞外 SPs 之沈積物，主要是由類澱粉前驅蛋白 (amyloid precursor protein)裂解後，產生 4 kDa 類澱粉貝他 42 (amyloid β-peptide 42；簡稱 Aβ42)所構成(Glenner and Wong, 1984; Iwatsubo et al., 1994)，而細胞內 NTFs 組成則是高度磷酸化微管結合蛋白 tau 所聚集而成(Lee et al., 1991)。由於蛋白質錯誤折疊造成構型改變，使得疏水區片段曝露在親水環境下，促使分子間進而產生 β-sheet 聚集，使原本可溶性的 oligomers 形成 protofibrils 再聚集成不可溶的 fibrils (Soto, 2003)。據研究指出蛋白質的疏水區曝露於油水介面更易促使其構型改變進造成聚集(Gorbenko and Kinnunen, 2006)。在前人研究顯 2.

(10) 示，Aβ42 中 16 到 20 胺基酸序列 KLVFF motif，其疏水核心對於形成分子間 β-sheet 結構穩定扮演重要角色，而有助於纖維聚集 (Tjernberg et al., 1999)。在修飾後 tau 蛋白所形成聚集之中，有研究指出 tau 所形成 paired helical filaments (簡稱 PHFs)為 α-helix 結構(Sadqi et al., 2002) 。然而，在微管結合區域的兩段六胜肽序列中， 275VQIINK280 以及 306VQIVYK311 仍是主要形成分子間. β-sheet 聚集的. 核心，若將位於 280 的賴胺酸剔除時，將促使胺基酸序列上疏水性支鏈不均勻分布集中在 β-sheet 同一面向，更有助於推疊產生聚集(von Bergen et al., 2001; von Bergen et al., 2000)。根據研究指出，在 tau 蛋白錯誤摺疊經由可溶的 oligomers 進一步形成 pre-fibrile、再聚集成 NFTs 過程中，NFTs 對於神經退化性疾病如 AD 及主要由 tau 蛋白引起之病理(tauopathy)如: Pick’s disease (PiD)、corticobasal degeneration (CBD)、progressive supranuclear palsy (PSP)、familial frontotemporal dementia and Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17)造成神經細胞損失或認知缺失具有相關性。經由透過表現人類 tau P301S 疾病模式小鼠疾病模式中，在 tau 成纖維包含體累積之前，發現海馬迴部位已發生突觸損失及功能缺失現象。表現人類基因 FTPD-17 (P301S 及 G272V)突變小鼠動物模式研究中，顯示在 NFTs 的形成之前已出現 tauopathy 相關病理病徵。因此，對於神經毒性影響，在形成聚集 3.

(11) 過程中的毒性蛋白一些中間產物，在神經退化性疾病上，扮演重要角色(Leroy et al., 2007; Spillantini and Goedert, 1998; Yoshiyama et al., 2007)。. 三、病因學. 大部分 AD 患者發生是偶發性、非遺傳因素，而家族性遺傳因素約佔 5~10%。目前已知風險因子包括：老化、環境毒物如重金屬鋁在腦部累積、過去遭受頭部傷害、發炎、性別、教育程度、病原菌慢性感染等多方面因素(Forsyth and Ritzline, 1998; Martin et al., 2011; Rubio-Perez and Morillas-Ruiz, 2012)。在基因層面上，在造成老年瘢塊的 Aβ 蛋白聚集疾病上，例如唐氏症第 21 號染色體為三倍體，使位於 21 染色體 amyloid precursor protein(簡稱 APP)基因為三份，增加產生 Aβ 的堆積、APP Swedish 突變使得切割 Aβ 片段之 β-secretase 活性增加、APP Flemish/Dutch and Arctic 突變抵抗 Aβ 片段不易被降解、PS1/PS2 基因變異造成 γ-secretase 活性增加，導致 Aβ 過度產生；此外，apolipoprotein E 第四型(簡稱 APOE E4 allele)降低與 Aβ 片段之親和力，使得無法有效清除 Aβ 在腦內推積，增加罹病風險(Sisodia and St George-Hyslop, 2002)。在形成 NFTs 的 tau 蛋白聚集基因突變上，在 1998 年發現第 17 4.

(12) 號染色體聯結額顳葉性失智合併帕金森氏症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17；簡稱 FTDP-17)相關的 tau 基因，其位於第 17 號染色體 q21 上，由 16 exons 所組成，其中 11 個 exons 表現在中樞神經系統，在 pre-mRNA 之 exons 2、3 和 10 的位置選擇性剪接(alternative splicing)，形成 6 種 isoforms 之 tau 蛋白。Tau 的 isoforms 可能是 2N (含 exons 2、3)、1N (僅含 exon 3)和 0N (不含 exons 2、3)；另外，Exon 10 編碼有 31 個胺基酸，是第二個微管結合區域，tau 的 isoforms 可包括 3 個微管結合區域(3R)或 4 個微管結合區域(4R)。3R/4R 的 isoforms 比例與疾病有密切關聯性，在成人腦部大約是 1/1。目前發現 30 個以上 tau 基因變異與 FTDP-17 有關，其中一半突變改變 3R/4R 的 tau 蛋白比例(Wolfe, 2009)。當 tau 蛋白減少與微管之間的作用力時，更易促使自身組裝成不正常纖維聚集。據研究顯示，三個 G272V、P301L、R406W 的錯義突變(missense mutation)，以及單一胺基酸剔除突變(ΔK280)，強烈減少 tau 蛋白促使微管組裝的能力(Hasegawa et al., 1998)。在一位無家族史之晚發型 AD 患者案例中，位於 tau 的 exon 10 位置的ΔK280 剔除基因突變，作者推測其中一項可能病因是，即使在低表現量ΔK280 之 4R-tau 蛋白，亦足夠起始 tau 蛋白堆積聚集(Momeni et al., 2009)。. 5.

(13) 四、AD 藥物治療策略. 對於高度磷酸化 tau 及蛋白錯誤折疊形成聚集，所引起神經性毒性之機制，依舊未清楚明瞭。然而，在造成神經退化性疾病及神經功能不良中所扮演關鍵角色，可作為治療 AD 患者策略。如透過 tau 蛋白過度磷酸化的激酶 GSK-3β 以及 CDK5 抑制，或 tau 去磷酸化酵素 PP2A 的激活也許可作為發展藥物之標的。在 tau 蛋白過度磷酸化過程中，GSK-3β 是一種磷酸化激酶，會對 tau 蛋白上 TP、SP motifs 上之 serine 及 threonine 胺基酸進行磷酸化，過度磷酸化的 tau 蛋白會與微管脫離，進而影響微管穩定及突觸功能，而產生高度磷酸化 tau 蛋白在細胞內又進一步推積聚集造成細胞毒性，如透過 GSK-3β 的抑制劑 lithium 發現可進一步抑制其酵素活性防止 tau 蛋白過度磷酸化，達到治療 AD 患者之效果(Drewes et al., 1993; Forlenza et al., 2012)。另外在抑制或是溶解 tau 聚集的小分子化合物還包括 phenothiazines、 anthraquinones、polyphenols、thiacarbocyaninedyes、N-phenylamines、 thiazolyl- hydrazides、rhodanines、quinoxalines、aminothienopyridazines 等(Hong-Qi et al., 2012)。除了防止 tau 聚集之外，高度磷酸化 tau 蛋白錯誤折疊導致 AD 之病徵，發現透過分子伴蛋白(chaperones)活化，可以適當回復蛋白摺疊，抑制 NFTs 之生成，如活化 hsp90 及 hsp70 6.

(14) 表現，進而促使可溶性 tau 蛋白能再與維管結合並防止聚集(Dou et al., 2003)，而 HSP40 可以將 tau 蛋白泛素化進行降解，或者當 HSP70 與其結合時，則會嘗試將其 client 蛋白在其他 cofactors 參與下進行再摺疊(如：P23、pin1)或降解(如：CHIP)之雙向路徑(Abisambra et al., 2012; Dickey et al., 2007)。透過以上相關路徑了解，以期在未來能夠發展出對於阿茲海默氏症有效之治療策略。前人研究，透過融合螢光蛋白的方式，錯誤摺疊蛋白會對融合蛋白螢光亮度產生干擾。如 Wurth 等人利用 Aβ42-GFP 融合蛋白，使 GFP 螢光亮度降低，來檢視 Aβ42 胜肽變異對螢光亮度影響(Wurth et al., 2002)。之後學者將 Aβ42 蛋白藉一段 linker 連接 GFP，因 GFP 較緩慢摺疊成自然的螢光結構(Cubitt et al., 1995)，故 Aβ42 之錯誤摺疊會藉由 linker 影響 GFP 構形，進而影響 GFP 螢光亮度；若小分子化合物能提升 Aβ42-GFP 螢光亮度，便可能抑制 Aβ42 之錯誤摺疊或聚集(Kim et al., 2006; McKoy et al., 2012)。在 Khlistunova 等人描述Δ K280 tau 蛋白微管結合重複區域聚集特性後 (Khlistunova et al. 2006)，Chun 等人利用裂解式 GFP 互補分析法，驗證ΔK280 促 tau 聚集突變型較野生型蛋白螢光顯著下降(Chun et al., 2007)。故本研究以抑制ΔK280 促 tau 聚集為目標，建立細胞層次之藥物篩選平台，以高通量篩選系統，來進行新穎ΔK280 促 tau 聚集抑制物開發。 7.

(15) 貳、研究目的. 由於高度磷酸化 tau 蛋白不正常摺疊，在神經細胞內產生聚集，是阿茲海默氏症主要病徵之一，本研究欲建立細胞模式之高通量藥物篩選平台，利用具有穩定表現 tauRD-DsRed 之 HEK 293 及 SH-SY5Y 細胞株，開發對於治療阿茲海默症具有潛力之藥物。. 8.

(16) 參、研究材料與方法. 一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體. pcDNA5/FRT/TO/K18 tauRD-DsRed 及 pcDNA5/FRT/TO/ΔK280 tauRD-DsRed 為林志信博士製備。以 human tau cDNA(呂佩蓉博士提供)為模板，利用 PCR 增幅 tauRD 序列，於 5’端引入起始密碼(ATG)，並於兩端分別引入 NotI (GCGGCCGC)、BamHI (GGATCC)限制酶切位，選殖入 pGEM-T Easy 質體並定序確認序列無誤。包含 12 個胺基酸 GSAGSAAGSGEF 的 linker 序列係直接合成，並於兩端分別引入 BamHI 、 EcoRI (GAATTC) 限制酶切位。 DsRed 序列取自 pDsRed-Monomer-C1 質體(已移除 C 端的 MCS)，利用 PCR 於 5’端引入 EcoRI 限制酶切位並移除起始密碼，增幅的 DsRed 序列選殖入 pGEM-T Easy 質體並定序確認序列無誤。最後將 tauRD 序列 (NotI-BamHI 片段)、linker 序列(BamHI-EcoRI 片段)、DsRed 序列 (EcoRI-NotI 片段)一起置入真核表現載體 pcDNA5/FRT/TO 供選殖置入的 NotI 切位(圖一)。. 二、細菌電穿孔(electroporation)轉型作用(transformation). 9.

(17) 將保存於-80℃的大腸桿菌轉型勝任細胞放置於冰上解凍，取 2 μl 完成接合作用(ligation)的重組質體 DNA 與 20 μl 勝任細胞均勻混合，接著以 1.25 kV、25 μF、200 Ω 進行電穿孔(electroporation) (BIO-RAD, GENE PULSER II)，將質體送入細菌內。加入 400 μl LB 培養液並置於 37℃水浴槽中回溫 30 分鐘。最後取適量的菌液塗於含有 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養基上，並置於 37℃培養箱中培養 16 ~ 20 小時。. 三、質體 DNA 的小量製備. 以滅菌牙籤挑出 LB 培養基上之白色單一菌株，畫在含青黴素之培養基上保留菌株，同時以 1.5 ml 離心管加入 1 ml 含有 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養液，培養所挑出的菌株，於 37℃、250 rpm 震盪培養 12 ~ 16 小時。將含菌培養液之 1.5 ml 離心管，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液。加入 70 μl solution I (50 mM glucose - 25 mM Tris-HCl pH8.0 - 10 mM EDTA pH8.0)，並充分震盪使細菌懸浮，再加入 140 μl solution II (1% SDS - 0.2 N NaOH)，溫和地上下翻轉 20 次。接著加入 105 μl solution III (3M potassium acetate)，溫和地下上翻轉 20 次，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，將上清液移到新的 1.5 ml 離心管，加入 270 μl 的異丙醇沉澱質體 DNA，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘。去除上清液後可以見到底部的白色沉澱物，加入 200 μl 的 70%酒精以清 10.

(18) 洗鹽類，13,000 rpm 離心 5 分鐘去除上清液。在室溫下風乾，加入 20 μl 含 10 μg/ml RNase 的二次水。最後取 2 μl 質體 DNA，進行洋菜膠體電泳分析質體 DNA 的大小。挑選出有插入片段的質體，取 100 ng 的質體 DNA，以限制酶切割確認 DNA 片段大小。. 四、質體 DNA 的大量製備及純化. 以滅菌牙籤挑選出於青黴素培養基上保留菌株，加入 1 ml 含有 50 μl/ml 青黴素的 LB 培養液中，於 37℃、250 rpm 震盪培養 2 小時候，再將 1 ml 菌液移置 65 ml 含 50 μl/ml 青黴素的培養液滅菌錐形瓶中，在 37℃培養箱中繼續震盪培養 18 ~ 20 小時隔夜。在 4℃以 8,000 rpm 離心 10 分鐘，倒掉上清液。使用 Geneaid plasmid midi Kit 抽取質體 DNA。沉澱於底部之細菌 pellet 加入 4 ml PM1 溶液，以 vortex 劇烈震盪懸浮細菌 pellet，之後加入 4 ml PM2，溫和地翻轉 20 次後，靜置 2 分鐘，加入 4 ml PM3，溫和地上下翻轉 20 次後，以 4℃、12,000 rpm 離心 20 分鐘。以 5 ml PEQ 潤洗管柱，將離心後的上清液到入管柱中(避免白色沉澱掉入分離管柱中)，待上清液完全通過管柱後，加入 12 ml PW 沖洗，將管柱放於另一乾淨含有 6 ml 異丙醇的 50 ml 離心管上，加入 8 ml PEL 於管住中，將溶液混合均勻使 DNA 析出沉澱，準備 10 個 1.5 ml 的離心管，將析出 DNA 溶液分裝於管中，於 4℃、 11.

(19) 13,000 rpm 離心 20 分鐘，移除上清液後靜置使異丙醇揮發後，分別每管加入 40 μl 的 ddH2O，在 37℃水浴槽中 10 分鐘回溶，之後將溶液合併為一管，加入 20 μl (1/20 體積) 5 M 的 NaCl，並加入 1 ml 的 99.5%的酒精，離心 13,000 rpm、10 分鐘，再加入 500 μl 70%酒精清洗鹽類，離心 13,000 rpm、10 分鐘，在室溫下風乾。最後加入 200 μl 的 Nuclease free water 回溶質體 DNA，以 NanoDrop ND-1000 測量質體 DNA 濃度，並取 100 ng 的 DNA 以 EcoRI 限制酶切割確認後，保存於-20℃冰箱。. 五、細胞株繼代培養. 本研究使用 293 Flp-In 細胞(Invitrogen) (圖二 A)，培養於 37℃、 5% CO2 細胞培養箱，使用含 100 μg/ml zeocin 與 5 μg/ml blasticidin S 之 10%胎牛血清 DMEM 細胞培養液(1 mM sodium pyruvate - 1.5 g/L sodium bicarbonate - 100 U/ml penicillin - 100 U/ml streptomycin pH7.3)。SH-SY5Y Flp-In 細胞(李麗卿博士與林志信博士製備) (圖二 D)，培養於 37℃、5% CO2 細胞培養箱。使用含 200 μg/ml G418 與 5 μg/ml blasticidin S 之 10% 胎牛血清 DMEM/F12 細胞培養液(1 mM sodium pyruvate - 1.5 g/L sodium bicarbonate - 100 U/ml penicillin - 100 U/ml streptomycin，pH7.3)。 12.

(20) 六、基因轉染(transfection). 種 5×105 個細胞於 6 孔細胞培養盤中，待其完全貼附後進行基因轉染。其方法為：準備 250 μl OptiMEM 培養液(Gibco)，加入 5 μl T-Pro 均勻混合。另外再準備 250 μl OptiMEM 培養液後，取重組質體 0.5 μg pcDNA5/FRT/TO/K18 tauRD-DsRed ( 或者 pcDNA5/FRT/TO/ΔK280 tauRD-DsRed)與 4.5 μg pOG44 (圖二 B)，加入其中均勻混合，等待反應 5 到 10 分鐘。將已作用之 T-Pro - OptiMEM 混合液 pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed - pOG44 - OptiMEM 混合液混合並反應 20 分鐘。後將上述 500 μl 的混合液，加到 6 孔細胞培養盤中，再加入 500 μl 不含血清與抗生素之 DMEM (293 細胞)或 DEME/F12 (SH-SY5Y 細胞)培養 8 小時。而後加入不含抗生素之 10% FBS 之 DMEM (293 細胞)或 DEME/F12 (SH-SY5Y 細胞)培養液培養 2 天待細胞恢復。而後使用含篩選之抗生素 100 μg/ml hygromycin B、5 μg/ml blasticidin S 培養液，進行細胞株之篩選。待篩選完成後，將細胞培養在含 10%胎牛血清之 DMEM (293 細胞)或 DEME/F12 (SH-SY5Y 細胞)培養液。由於寄主細胞本身表現 Tetracycline repressor(TetR)會與重組基因上游操縱子結合阻止 tauRD-DsRed 基因表達，加入 doxycycline 後，促使 TetR 構型改變而與操縱子分離，使 CMV promoter 活化 RNA 13.

(21) 聚合酶幫助目標基因轉錄。(圖二 C) 在 Flp-In SH-SY5Y 宿主細胞，帶有 FRT 序列並有抗 neomycin 篩選基因，以及帶有 TetR 序列並有抗 blasticidin 篩選基因，以保持寄主細胞上之 FRT 以及 TetR 基因。(圖二 D). 七、即時聚合酶鏈鎖反應分析細胞誘導基因表現. (一) RNA 萃取接種 5×105 K18 tauRD-DsRed、ΔK280 tauRD-DsRed Flp-In 293 細胞在 1.5 ml 培養液之 12-well 細胞培養盤中。待隔日細胞貼附後，加入 doxycycline (1 μg/ml)誘導蛋白表現，以及不加入 doxycycline 誘導之控制組。在誘導表現兩天後，將細胞吸去培養液後，加入 1 ml TRIzol。細胞在培養盤中沖散溶解呈現黏稠狀後，收集至 1.5 ml 的微量離心管，上下翻轉後置於冰上 5 分鐘，再加入 200 μl 體積的 chloroform 混合，上下翻轉，使之混合均勻呈現乳白狀態，並放置於冰上作用 5 分鐘。接著以 4℃、13,000 rpm 離心 15 分鐘。吸取上清液移至新的 1.5 ml 離心管，並取 0.8 倍體積異丙醇混合均勻，放置於-20℃冰箱作用隔夜，之後以 4℃、13,000 rpm 離心 15 分鐘，沉澱白色 pellet 即為 RNA 的部分。之後小心去除上清液，加入 70%的酒精(DEPC-ddH2O) 500 μl 潤洗，並以 13,000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液後，讓酒精揮發呈 14.

(22) 現至接近快透明時，接著再將半透明的 pellet 回溶於 40 μl 的 DEPC-ddH2O。取 2 μl 的 RNA 稀釋十倍以 NanoDrop ND-1000 測定 RNA 濃度，於-80℃冰箱保存。. (二)反轉錄 PCR (Reverse transcription PCR；簡稱 RT-PCR) 取出 6.25 μg 的 RNA，加入 RNase-free DNase 0.5 U (TaqMan)總體積 25 μl，在 37℃作用 30 分鐘，去除樣品中的 DNA。將去除 DNA 之 RNA 以 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)進行反轉錄，樣品取 2 μg RNA、0.8 μl 25× dNTPs、2 μl 10× random primers 、 2 μl 10× reverse transcription buffer 、 6.5 μl nuclease-free H2O、1 μl MultiScribeTM reverse transcriptase，總體積 20 μl，反應條件：25℃反應 10 分鐘、37℃反應 2 小時、85℃反應 5 分鐘，反應完成後 cDNA 樣品，放置於-20℃冰箱中保存。. (三)即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR；簡稱 qPCR) Real-time PCR 使用 DsRed 的螢光探針(Applied Biosystems)偵測誘導基因的表現量，並使用 Hu HPRT 的螢光探針 4326321E (Applied Biosystems)作為內部等量化控制組，反應溶液配置如下：取 12.5 ng cDNA、7.5 μl 2× master mix、0.75 μl 20× probe、1.75 μl ddH2O，將製備完成之樣品放入 ABI Real-time PCR system (StepOnePlus 7000)，同 15.

(23) 步偵測 PCR 產物。偵測 DsRed 探針與引子序列如下：探針 CAGGACGGCACCTTC、正向引子 GGTGCAGCAGGACTCCT、反向引子 GCCCTTGAACTTCACCTTGTAGAT。. 八、利用西方墨點法分析細胞誘導蛋白表現. (一)細胞培養以及誘導蛋白表現接種 5×105 K18 tauRD-DsRed、ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞在 1.5 ml 之 6-well 細胞培養盤中。待隔日細胞貼附後，加入 doxycycline (1 μg/ml)誘導蛋白表現，以及不加入 doxycycline 誘導之控制組。在誘導蛋白表現兩天後，將細胞離心去除培養液，並以 1 ml PBS 清洗殘留培養液後，冰在-20℃冷凍保存。. (二)蛋白質定量以及電泳將收集下的細胞 pellet 加入 80 µl RIPA lysis 緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 7.4 - 150 mM NaCl - 1 mM PMSF - 1 mM EDTA - 5 μg/ml aprotinin - 5 μg/ml leupeptin - 1% Triton X-100 - 1% sodium deoxycholate - 0.1% SDS)，在冰上以超音波震盪將細胞打破後，取 5 μl 以 Bio-Rad Protein Assay 進行蛋白質定量。加入 6× sample buffer (50 mM Tris pH6.8 - 2% SDS - 10% glycerol - DTT - 0.005% bromophenol blue)，將樣品進行沸水浴 5 分鐘，隨後立即至於冰上，之後進行 10% 16.

(24) SDS-聚丙烯醯胺電泳。. (三)西方免疫轉漬分析電泳結束後將膠體取出，並將膠體緊密貼在 0.45 μm 硝化纖維膜 (nitrocellulose transfer membrane)上後，加入 transfer 緩衝液(25 mM Tris - 0.2 M glycine - 20% methanol)，以 XCell IITM Blot Module (Invitrogen)使用固定電流 200 mA 共 120 分鐘進行轉漬。轉漬完成後取出硝化纖維膜浸泡膜於 blocking buffer (10%脫脂奶粉磷酸緩衝液)，在 4℃冰箱作用到隔天。在 blocking 後，以 1× TBST (10 mM Tris-HCl pH8.0 - 0.05% Tween-20)清洗硝化纖維膜。接著加入一級抗體 anti-DsRed (1:500 稀釋，Santa cruz)、anti-HSP27 (1:500 稀釋，Santa cruz) 、anti-HSPA5(GRP78) (1:200 稀釋，Santa cruz) 、anti-actin(1:5000 稀釋，millipore)，於室溫下靜置作用 2 小時，再以 1× TBST 清洗膜三次，每次約 10 分鐘。接著加入 horseradish peroxidase (HRP) conjugated donkey anti-goat IgG (H&R) (1:5000)，於室溫下靜置作用 2 小時，再以 1× TBST 清洗膜三次，每次約 10 分鐘。轉漬膜以 LAS 4000 冷光儀使用 ECL (Immobilon Western, Millipore)偵測蛋白表現。在完成 DsRed 蛋白表現分析後，再將此膜以上述之方式再進行 rabbit 一級抗體 α-tubulin (1:10000)反應，再以 goat anti-rabbit IgG (1:5000)二級抗 17.

(25) 體辨識。. 九、高通量影像系統分析∆K280 tauRD-DsRed 293 細胞試驗. (一)細胞培養以及誘導蛋白表現接種 2×104 ∆K280 tauRD-DsRed 293 細胞在 96 孔細胞培養盤。待隔日細胞貼附後試驗。. (二)藥物試驗及影像分析加入 congo red (1、10、20 µM)、吲哚喹啉衍生物(indolylquinoline derivatives：NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6、NC009-7，1、 3、10 µM，臺灣師大化學系姚清發老師提供)、GSK-3 抑制劑類似物 (NTNU-001、NTNU-002、NTNU-003、NTNU-008、NTNU-010，1、 3、10 µM，工研院提供)、中草藥水萃取液(NH-008、NH-021，50 ~ 500 µg/ml，順天堂提供)或植物藥酒精萃取液(NTNU-043 ~ NTNU-395，1 ~ 10 µg/ml，工研院提供)至細胞培養液，8 小時後以 doxycycline (1 µg/ml)誘導蛋白表現。在 37℃、5%二氧化碳培養箱培養三天後，以 Hochest 33342 染核 30 分鐘後，以高通量影像分析系統 (ImageXpressMICRO)，分別以 DAPI、TRITC 濾鏡紀錄細胞核數、 DsRed 螢光表現量。最後以 MetaXpress 影像分析軟體，分析細胞所 18.

(26) 表現 DsRed 螢光亮度。. 十、高通量影像系統分析 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞試驗. (一)細胞培養以及誘導蛋白表現接種 1×105 ∆K280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞在 24 孔細胞培養盤，同時以 10 µM retinoic acid 誘導細胞分化。待隔日細胞貼附後，以化合物前處理八小時之後再加入 doxycycline (1 µg/ml)誘導蛋白表現。. (二)藥物試驗及影像分析加入 congo red、indolylquinoline 衍生物、GSK-3 抑制劑類似物等待測試化合物(10 µM)前處理八小時後，以 doxycycline (1 µg/ml)誘導蛋白表現。期間每隔三天更換培養液及待測試化合物。在 37℃、5％二氧化碳培養箱培養八天後，以 Hochest 33342 染核 30 分鐘後，以高通量影像分析系統(ImageXpressMICRO)，分別以 DAPI、TRITC 濾鏡紀錄細胞核、DsRed 螢光表現。最後以 MetaXpress 影像分析軟體，分析細胞所表現 DsRed 螢光之神經突觸總生長。. 19.

(27) 肆、結果. 一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體的確認. 構築的野生型 pcDNA5/FRT/TO/K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型 pcDNA5/FRT/TO/ΔK280 tauRD-DsRed 重組質體，以 EcoRI 限制酶切割後，經由 0.8%洋菜膠體電泳可分別得到包含 tauRD、linker 的 462 bp 片段，及包含 DsRed 的 1.5 kb 片段(圖三 B)。野生型 K18 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD 序列定序結果顯示第 280 位置賴氨酸的密碼子 AAG 剔除(圖三 C)。. 二、Doxycycline 誘導表現 tauRD-DsRed 293 細胞株之建立. 野生型 K18 及促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞透過 hygromycin 抗生素篩選後，以 doxcycline 誘導，利用即時聚合酶鏈鎖反應分析細胞誘導二天後 mRNA 基因表現量。如圖四 A 所示，與內生性的 HPRT1 相較，野生型細胞未誘導、誘導的 tauRD-DsRed mRNA 量約為 HPRT1 mRNA 之 1.0、9.4 倍，促 tau 聚集突變型細胞未誘導、誘導量約為 HPRT1 mRNA 之 0.9、8.4 倍；與未誘導相較，野生型、促 tau 聚集突變型細胞誘導倍率各約為 9.0、9.7 倍，兩者間 20.

(28) 沒有顯著差異(P > 0.05)。圖四 B 為 doxcycline 誘導兩天後蛋白表現量，可偵測到約 43 kDa 的 tauRD-DsRed 融合蛋白表現，野生型、促 tau 聚集突變型細胞間 tauRD-DsRed 蛋白表現量亦沒有顯著差異(100% vs. 90%，P > 0.05)。圖四 C 為螢光顯微影像，DsRed 螢光亮度分析結果顯示，ΔK280 螢光亮度較低，兩者達統計上差異(100% vs. 73%，P = 0.015)。圖四 D 顯示野生型 K18 細胞在以 20 µM congo red 處理後可使螢光亮度顯著提升(126%，P = 0.045)，促 tau 聚集突變型 ΔK280 細胞則以 10、20 µM congo red 處理後，螢光亮度皆顯著提升(126%，P = 0.029 及 146%，P = 0.008)。. 三、tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞誘導表現. 野生型 K18 及促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞透過 hygromycin 抗生素篩選後，以 doxcycline 誘導，利用即時聚合酶鏈鎖反應分析細胞誘導一、二天後 mRNA 基因表現。如圖五 A 所示，與內生性的 HPRT1 相較，野生型細胞未誘導、誘導一、二天的 tauRD-DsRed mRNA 量約為 HPRT1 mRNA 之 2.0、18.5、20.9 倍，促 tau 聚集突變型細胞未誘導、誘導一、二天的量約為 HPRT1 mRNA 之 0.6、5.4、5.5 倍；與未誘導相較，野生型、促 tau 聚集突變型細胞誘導一至二天的倍率各約為 9.4 ~ 10.6、9.6 ~ 9.9 倍，兩者間沒有顯著 21.

(29) 差異(P > 0.05)。圖五 B 為 doxcycline 誘導兩天後蛋白表現量，可偵測到約 43 kDa 的 tauRD-DsRed 融合蛋白表現，野生型、促 tau 聚集突變型細胞間 tauRD-DsRed 蛋白表現量有顯著差異(100% vs. 49%，P = 0.009)。以 10 µM RA 處理七天誘導神經分化的神經性狀分析結果顯示，兩者在總突觸生長(total outgrowth) (21.1 vs. 13.9 µm，P = 0.004)、分支數(branches) (1.5 vs. 1.0，P = 0.041)及突起數(process) (2.5 vs. 1.8，P = 0.025)上達到統計上差異(圖五 C)。. 四、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之中草藥及植物萃取物篩選. 利用高通量影像分析 tauRD-DsRed 螢光亮度，來檢測中草藥及植物萃取物抑制 ΔK280 聚集情形。藥物篩檢流程顯示於圖六 A，ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞以剛果紅或待檢測中草藥及植物萃取物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現，3 天後以 Hochest 33342 染核，經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。如圖六 B 所示，以未處理者之紅色螢光亮度為 100%，做為正控制組的剛果紅(Congo red)於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢光亮度分別為 109% (P = 0.004)、118% (P = 0.017)。順天堂水萃取之中草藥 NH-021 於 500 µg/ml 濃度前處理後，DsRed 螢光亮度為 116% 22.

(30) (P = 0.035)。工研院酒精萃取之植物藥 NTNU-043、NTNU-057、 NTNU-059 於 10 µg/ml 濃度前處理後，DsRed 螢光亮度為 106% (P = 0.032)、106% (P = 0.044)、105% (P = 0.044)。圖六 C 顯示另一批的工研院酒精萃取之植物藥檢驗結果，剛果紅於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢光亮度分別為 108% (P = 0.038)、113% (P = 0.015)， NTNU-224 (1、3、10 µg/ml)、NTNU-309 (10 µg/ml)、NTNU-313 (10 µg/ml)、NTNU-319 (10 µg/ml)、NTNU-331 (10 µg/ml)、NTNU-379 (3、10 µg/ml)前處理後，DsRed 螢光亮度分別為 102 ~ 109% (P = 0.017 ~ 0.005)、114% (P = 0.011)、120% (P = 0.021)、107% (P = 0.011)、 110% (P = 0.009)、104 ~ 114% (P = 0.023 ~ 0.006)。上述有顯著增加 DsRed 螢光亮度的中草藥及植物萃取物處理，以 Hochest 33342 染核計數活細胞後，細胞存活率皆有 80%以上。. 五、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之吲哚基喹啉衍生物篩選. 利用高通量影像分析 tauRD-DsRed 螢光亮度，來檢測吲哚基喹啉衍生物抑制 ΔK280 聚集情形。藥物篩檢流程顯示於圖七 A，ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞以剛果紅或待檢測吲哚基喹啉衍生物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現，3 天後 23.

(31) 以 Hochest 33342 染核，經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。如圖七 B 所示，以未處理者之紅色螢光亮度為 100%，做為正控制組的剛果紅(Congo red)於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢光亮度分別為 109% (P = 0.004)、118% (P = 0.017)。台灣師大化學系姚清發老師提供之吲哚基喹啉衍生物 NC009-1 (3、10 µM)、NC009-2 (10 µM)、 NC009-3 (10 µM)、NC009-6 (10 µM)及 NC009-7 (10 µM)前處理後， DsRed 螢光亮度分別為 108 ~ 116% (P = 0.041 ~ 0.038)、113% (P = 0.020)、109% (P = 0.020)、107% (P = 0.022)、106% (P = 0.018)。上述有顯著增加 DsRed 螢光亮度的吲哚基喹啉衍生物處理，以 Hochest 33342 染核計數活細胞後，除 NC009-1、NC009-2、NC009-3 的 10 µM 處理後細胞存活率分別為 60%、73%、79%外，其餘皆有 80%以上。. 六、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之 GSK-3β 抑制劑類似物篩選. 利用高通量影像分析 tauRD-DsRed 螢光亮度，來檢測 GSK-3β 抑制劑類似物抑制 ΔK280 聚集情形。藥物篩檢流程顯示於圖八 A， ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞以剛果紅或待檢測 GSK-3β 抑制劑類似物前處理 8 小時後，加入 doxycycline 誘導 ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表 24.

(32) 現，3 天後以 Hochest 33342 染核，經高通量活細胞影像儀分析細胞螢光亮度。如圖八 B 所示，以未處理者之紅色螢光亮度為 100%，做為正控制組的剛果紅於 10 µM、20 µM 前處理後，DsRed 螢光亮度分別為 109% (P = 0.004)、118% (P = 0.017)。工研院提供之 GSK-3β 抑制劑類似物 NTNU-001、NTNU-003、NTNU-008 (10 µM)前處理後， DsRed 螢光亮度分別為 118% (P = 0.020)、107% (P = 0.010)、111% (P = 0.025)。上述有顯著增加 DsRed 螢光亮度的 GSK-3β 抑制劑類似物處理，以 Hochest 33342 染核計數活細胞後，細胞存活率分別為 38%、 77%、94%。. 七、促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之先導藥物篩選. 將剛果紅、GSK-3β 抑制劑類似物(NTNU-003、NTNU-008)及吲哚喹啉衍生物(NC009-1 ~ NC009-7)進一步處理 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 神經細胞，以檢測其是否改善神經突觸總生長性狀。 SH-SY5Y 細胞檢測流程顯示於圖九 A，細胞以 10 µM RA 誘導神經分化後，第二天加入剛果紅、GSK-3β 抑制劑類似物或吲哚喹啉衍生物(10 µM)前處理 8 小時，再誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現。七天後分析 ΔK280 tauRD-DsRed 細胞之神經突觸總生長。圖九 B 顯示 25.

(33) 剛果紅、NTNU-008、NC009-7 前處理及未前處理者的神經突觸生長情形。如圖九 C 的量化圖所示，以未處理化合物之神經突觸總生長為 100%，正控制組的剛果紅前處理後，神經突觸總生長為 110% (P = 0.026)，NTNU-008、NC009-1、NC009-7 前處理後神經突觸總生長分別為 139% (P = 0.006)、115% (P = 0.020)及 124% (P = 0.002)。. 八、先導藥物處理促 tau 聚集突變型 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之蛋白表現分析. 如上述般以剛果紅、 GSK-3β 抑制劑類似物 (NTNU-003 、 NTNU-008) 及吲哚喹啉衍生物 (NC009-1 ~ NC009-7) 處理 ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 神經細胞，七天後分析ΔK280 tauRD-DsRed、 HSP27 或 GRP 78 蛋白表現情形。如圖十所示，以誘導後之ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現量為 100% (+ Dox)，前處理 NTNU-008、NC009-1 及 NC009-7 後，ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現量分別顯著提升至 246% (P = 0.026)、157% (P = 0.044)及 257% (P = 0.004)。以未誘導Δ K280 tauRD-DsRed 蛋白表現(- Dox)之 HSP27 之蛋白表現為 100%，誘導ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現七天後，HSP27 蛋白表現量並無顯著變化(100% ~ 115%，P > 0.05)，但 NTNU-008、NC009-1 及 NC009-7 前處理導致 HSP27 之蛋白表現量分別顯著提升至 189% (P = 0.046)、 26.

(34) 124% (P = 0.020)及 130% (P = 0.016)。以未誘導ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現 (- Dox) 之 GRP78 之蛋白表現為 100% ，誘導 Δ K280 tauRD-DsRed 蛋白表現七天後，GRP78 蛋白表現量並無顯著變化 (96%，P > 0.05)，但前處理 NTNU-008 導致 GRP78 之蛋白表現量顯著提升 174% (P = 0.027)。作為正控制組的剛果紅並未影響ΔK280 tauRD-DsRed、HSP27 或 GRP 78 蛋白表現。. 27.

(35) 伍、討論. 一、tauRD-DsRed 293 細胞誘導表現. 經由 Flp 重組酵素辨識 FRT 序列，以位置專一性重組(site specific recombination)將野生型 K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed 基因重組入宿主細胞染色體上後，透過 hygromycin B 抗生素篩選，得到 tauRD-DsRed 及ΔK280 tauRD-DsRed 之 293 細胞株。此兩細胞株以 doxcycline 誘導表現 K18、ΔK280 tauRD-DsRed 後，雖皆可在螢光顯微鏡下觀察到融合的紅螢光表現，但 Δ K280 tauRD-DsRed 細胞紅螢光量顯著低於 K18 tauRD-DsRed 細胞，且正控制組的 congo red 在較低 10 µM 濃度即顯著提升 DsRed 紅螢光亮度(圖四)，故以ΔK280 tauRD-DsRed 細胞作為藥物篩選平台。. 二、小分子化合物及植物萃取物對蛋白錯誤折疊作用. 在正常狀態下，蛋白質自然摺疊，位於蛋白疏水區部位會包覆在內部。在構型改變為速率決定步驟的過程中，由於錯誤折疊的中間體其輸水區暴露在親水環境下，進一步聚集使得蛋白分子間更加穩定，形成低聚物 β-sheet 結構。在此過程中可透過一些化合物，幫助穩定 28.

(36) 蛋白自然摺疊，或對於錯誤折疊 β-sheet 結構進行抑制或者反轉，或防止錯誤折疊蛋白進一步聚合，或透過誘發細胞本身的清除機制清除錯誤摺疊蛋白聚合物等，來幫助減緩蛋白質錯誤摺疊(Soto, 2003)。例如剛果紅可嵌合至 Aβ42 胜肽的 β-sheet 上，來抑制或干擾 Aβ 聚集產生(Carter and Chou, 1998; Taniguchi et al., 2005)。除剛果紅外，一些 phenothiazines、polyphenols 及 porphyrin ferric dehydroporphyrin IX 等亦有抑制 tau 聚集的效果(Carter and Chou, 1998; Taniguchi et al., 2005)。本研究中，所檢測的中草藥水萃取物 NH021 或植物酒精萃取物 NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-224、 NTNU-309、NTNU-313、NTNU-319、NTNU-331、NTNU-379 等，皆可顯著提升ΔK280 tauRD-DsRed 紅螢光亮度(圖六)，其中 NTNU-319 含具有抑制 GSK-3 活性的 falcarindiol (Yoshida et al., 2013) ， NTNU-331 含 Kaempferol 及 quercetin 黃酮類，可增加 3T3-L1 細胞對葡萄糖的吸收(Fang et al., 2008)，NTNU-379 含 flemicoumarin、黃酮類成分(Fu et al., 2013)等。前人研究發現植物之黃酮類化合物可抑制 tau 聚集(Taniguchi et al., 2005)。由於植物萃取物成分多樣且複雜，在細胞內可能藉不同於幫助蛋白摺疊機制，來提升 DsRed 紅螢光亮度。在小分子化合物部分，由臺師大化學系姚清發老師所合成的吲哚基喹啉為骨架之衍生物，是透過實驗室建立試管外 Trx-His-Aβ 結合 29.

(37) Thioflavin T 螢光分析試驗，所篩選出具有抑制 Aβ42 胜肽聚集的化合物(黃鉦翔, 2013)。前人研究亦指出吲哚衍生物可抑制澱粉樣纖維化作用(Cohen et al., 2006; Morshedi et al., 2007)。另外，在喹啉衍生物方面發現具有抑制 tau 聚集效果(Navarrete et al., 2012)。本研究以細胞模式檢測吲哚基喹啉衍生物，亦發現 NC009-1、NC009-2、NC009-3、 NC009-6、NC009-7 可顯著提升ΔK280 tauRD-DsRed 紅螢光亮度(圖七)。. 三、Chaperones 對防止蛋白錯誤折疊作用. 先前研究顯示，熱休克蛋白(heat shock proteins)可藉蛋白酶體 (proteasome)選擇性清除磷酸化及錯誤摺疊的 tau 蛋白(Dickey et al., 2006)。Sahara 等人依據 Braak NFT staging 來分析人腦中不同程度的神經纖維糾結病理，發現可溶性蛋白質的量與 HSP90、HSP40、 HSP27、α-crystallin 及 CHIP 之間具有正相關性，熱休克蛋白的量並與顆粒狀 tau 寡聚物(granular tau oligomer)呈負相關，推論熱休克蛋白可調節可溶性 tau 蛋白的量，故在形成早期神經纖維糾結病徵過程中，熱休克蛋白在神經退化性疾病的保護作用上扮演重要的角色 (Sahara et al., 2007)。熱休克蛋白 HSC70 (HSPA8)可與 tau 蛋白的微管結合區域結合，此 HSC70 結合位具 tau 聚集生成的 β-sheet 結構，故 30.

(38) HSC70 的結合可抑制 tau 聚集產生(Sarkar et al., 2008)。前人研究顯示，GSK3β 抑制劑 lithium 可以提升 HSP70 (HSPA1A)的表現(Bijur and Jope, 2000)。根據前人研究中發現，在阿茲海氏症及亨丁頓舞蹈症所引起腦部疾病，GRP78 (HSPA5)蛋白對內質網壓力及未摺疊蛋白反應具有保護、修補細胞作用(Avila et al., 2013)。在阿茲海默氏症病患中，可觀察到 HSP27 熱休克蛋白表現量的上升，對神經細胞具有保護性的作用，並防止磷酸化 tau 蛋白聚集、細胞凋亡(Abisambra et al., 2011) 。. 四、先導藥物對ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 的作用. 在正常成熟神經細胞，tau 蛋白主要分佈於軸突上，然而在阿茲海默氏症主要病理特徵中，tau 蛋白聚集錯誤分布於細胞體-樹突 (somatodendritic)，並與初期突觸損失有關聯(Li et al., 2011)。本研究亦建立誘導表現野生型 K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed 之 SH-SY5Y 細胞。加入 doxcycline 誘導 tauRD-DsRed 表現後，K18 野生型及ΔK280 促 tau 聚集突變型之 tauRD-DsRed mRNA 表現量沒有顯著差異，但西方轉漬分析 tauRD-DsRed 融合蛋白時，野生型、促 tau 聚集突變型細胞間呈現顯著差異，而此差異並未見於 K18、ΔK280 tauRD-DsRed 的 293 細胞。推測可能因為在 SH-SY5Y 31.

(39) 細胞中ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白的溶解度較差，導致抗體雜合訊號降低。野生型 K18 tauRD-DsRed 及促 tau 聚集突變型ΔK280 tauRD-DsRed 之 SH-SY5Y 細胞，以 10 µM RA 處理七天誘導神經分化的總突觸生長、分支數、突起數等神經性狀分析結果顯示，野生型細胞顯著優於促 tau 聚集突變型細胞，故可以此作為檢測先導藥物的參數。本實驗中，透過ΔK280 SH-SY5Y 細胞株，以 retinoic acid 促使其分化後，再處理經由ΔK280 293 細胞已篩選出之候選化合物，其中 congo red、NTNU-008、NC 009-1 及 NC009-7 可使得ΔK280 tauRD-DsRed 紅色螢光之神經突觸總生長增加(圖九)。進一步分析先導藥物處理後的蛋白表現，發現 GSK-3β 抑制劑類似物 NTNU-008 可提升 GRP 78、 HSP27 蛋白表現，吲哚喹啉衍生物 NC009-1、NC009-7 可提升 HSP27 蛋白表現，且三者皆可提升ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白的抗體雜合訊號(圖十)。未來可進一步評估三者在 SH-SY5Y 細胞中是否可有效增加ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白的溶解度。. 32.

(40) 伍、參考文獻 Abisambra, J.F., Jinwal, U.K., Jones, J.R., Blair, L.J., Koren, J., 3rd, and Dickey, C.A. (2011). Exploiting the diversity of the heat-shock protein family for primary and secondary tauopathy therapeutics. Curr Neuropharmacol 9, 623-631. Abisambra, J.F., Jinwal, U.K., Suntharalingam, A., Arulselvam, K., Brady, S., Cockman, M., Jin, Y., Zhang, B., and Dickey, C.A. (2012). DnaJA1 antagonizes constitutive Hsp70-mediated stabilization of tau. J Mol Biol 421, 653-661. Avila, M.F., Cabezas, R., Torrente, D., Gonzalez, J., Morales, L., Alvarez, L., Capani, F., and Barreto, G.E. (2013). Novel interactions of GRP78: UPR and estrogen responses in the brain. Cell Biol Int 37, 521-532. Berchtold, N.C., and Cotman, C.W. (1998). Evolution in the conceptualization of dementia and Alzheimer's disease: Greco-Roman period to the 1960s. Neurobiol Aging 19, 173-189. Bijur, G.N., and Jope, R.S. (2000). Opposing actions of phosphatidylinositol 3-kinase and glycogen synthase kinase-3beta in the regulation of HSF-1 activity. J Neurochem 75, 2401-2408. Carter, D.B., and Chou, K.C. (1998). A model for structure-dependent binding of Congo red to Alzheimer beta-amyloid fibrils. Neurobiol Aging 19, 37-40. Cohen, T., Frydman-Marom, A., Rechter, M., and Gazit, E. (2006). Inhibition of amyloid fibril formation and cytotoxicity by hydroxyindole derivatives. Biochemistry 45, 4727-4735. Dickey, C.A., Dunmore, J., Lu, B., Wang, J.W., Lee, W.C., Kamal, A., Burrows, F., Eckman, C., Hutton, M., and Petrucelli, L. (2006). HSP induction mediates selective clearance of tau phosphorylated at proline-directed Ser/Thr sites but not KXGS (MARK) sites. FASEB J 20, 753-755.. 33.

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(46) 附錄圖表. 圖一、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 質體建構。(A) tauRD 序列以 linker 連接 DsRed 螢光蛋白之建構。(B)人類神經系統中最長 tau441 蛋白及第 280 個賴胺酸缺失的促 tau 聚集突變(∆K280) (Khlistunova et al., 2006)。(C)真核表現載體 pcDNA5/FRT/TO 及以 tauRD-DsRed 片段接合入的 NotI 切位。. 39.

(47) 圖二、誘導表現 tauRD-DsRed 細胞建立流程圖 (Flp-In™ T-REx™ System, Invitrogen)。(A) Flp-In 293 宿主細胞帶有 FRT 序列、Tet repressor (TetR)基因及抗 Zeocin、抗 blasticidin S 抗生素篩選基因。(B) 共轉 pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed、pOG44 質體入宿主細胞。(C)以 hygromycin 篩選重組後之細胞，使用 doxycycline 誘導 tauRD-DsRed 表現。(D) Flp-In SH-SY5Y 宿主細胞，帶有 FRT 序列及抗 neomycin 篩選基因。. 40.

(48) 圖三、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 重組質體。(A) pcDNA5/FRT/TO 載體、pcDNA5/FRT/TO/tauRD-DsRed 質體輿圖及標示出的 EcoRI 限制酵素切位。(B) pcDNA5/FRT/TO 載體(Vec)、pDsRed-Monomer-C1 質體 (DsRed) 、 pcDNA5/FRT/TO/K18 tauRD-DsRed 重組質體、 pcDNA5/FRT/TO/∆K280 tauRD-DsRed 重組質體以 EcoRI 切割(+)後的 0.8%洋菜膠體電泳照片，lane M 包含片段大小標記。(C) 野生型 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 重組質體定序結果。. 41.

(49) 圖四、K18 及∆K280 tauRD-DsRed 293 細胞記述。(A)即時定量 PCR 分析 doxcycline 誘導二天後 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 之 mRNA 表現量 42.

(50) (左)與誘導倍率(右)。(B)西方轉漬分析 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現(左)及定量(右)。(C) Hoechst 染核(藍色)後以高通量影像分析 DsRed 紅色螢光亮度(上)及定量(左下)。(D)以剛果紅(Congo red， 1、10、20 µM)前處理野生型(K18)及促 tau 聚集突變型(∆K280)細胞 8 小時後，以 doxcycline 誘導 tauRD-DsRed 融合蛋白表現三天後的 DsRed 紅螢光亮度分析，未處理前剛果紅者為 100%。P < 0.05 具有統計上的顯著差異。. 43.

(51) 圖五、K18 及∆K280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞記述。(A)即時定量 PCR 分析 doxcycline 誘導一至二天後 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 之 44.

(52) mRNA 表現量(左)與誘導倍率(右)。(B)西方轉漬分析 K18 及∆K280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現(左)及定量(右)。(C)野生型(K18)及促 tau 聚集突變型(∆K280)細胞以 retinoic acid (10 µM)誘導神經分化，第二天加入 doxcycline 誘導 tauRD-DsRed 表現七天後的神經突觸生長性狀 (包含總突觸生長及突起數、分支數)。P < 0.05 具有統計上的顯著差異。. 45.

(53) 圖六、中草藥及植物萃取物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選。(A)實驗流程圖。接種 2×104 ∆K280 細胞於 96 孔盤，於 24 小時後加入中草藥或植物萃取物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導ΔK280 46.

(54) tauRD-DsRed 融合蛋白表現。三天後進行高通量分析。(B-C)篩選具有潛力的中草藥及植物萃取物。未處理者之紅色螢光亮度為 100%，以剛果紅(Congo red，1、10、20 µM)為正控制組。NH-008、NH-021 (順天堂水萃取之中草藥)濃度為 50、500 µg/ml，NTNU-043 ~ NTNU-395 (工研院酒精萃取之植物藥)濃度為 1 ~ 10 µg/ml。以 Hoechst 33342 染核(藍色)計數細胞數目，紅線表示 80%存活率。*為 P < 0.05；**為 P < 0.01。. 47.

(55) 圖七、吲哚喹啉衍生物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選。 (A)實驗流程圖。接種 2×104 ∆K280 細胞於 96 孔盤，於 24 小時後加入吲哚喹啉衍生物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現。三天後進行高通量分析。(B)篩選具有潛力的吲哚喹啉衍生物。未處理者之紅色螢光亮度為 100%，以剛果紅(Congo red， 1、10、20 µM)為正控制組。NC009-1 ~ NC009-7 (臺灣師大化學系姚清發老師提供)濃度為 1、3、10 µM。以 Hoechst 染核(藍色)計數細胞數目，紅線表示 80%存活率。*為 P < 0.05；**為 P < 0.01。. 48.

(56) 圖八、GSK-3β 抑制劑類似物於ΔK280 tauRD-DsRed 293 細胞之藥物篩選。(A)實驗流程圖。接種 2×104 ∆K280 細胞於 96 孔盤，於 24 小時後加入 GSK-3β 抑制劑類似物，再於 8 小時後加入 Dox 誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現。三天後進行高通量分析。(B)篩選具有潛力的 GSK-3β 抑制劑類似物。未處理者之紅色螢光亮度為 100%，以剛果紅(Congo red，1、10、20 µM)為正控制組。NTNU-001 ~ NTNU-010 (工研院提供)濃度為 1、3、10 µM。以 Hoechst 染核(藍色)計數細胞數目，紅線表示 80%存活率。*為 P < 0.05；**為 P < 0.01。. 49.

(57) 圖九、GSK-3β 抑制劑類似物及吲哚喹啉衍生物於ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞之藥物篩選。(A)實驗流程圖。第一天接種 1×105 ∆K280 細胞於 24 孔盤，培養液含 10 µM RA 以誘導神經分化。24 小時後(第二天)加入 GSK-3β 抑制劑類似物(NTNU-003、NTNU-008，10 µM)或吲哚喹啉衍生物(NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6、NC009-7， 50.

(58) 10 µM)，再於 8 小時後加入 Dox (1 µg/ml)誘導ΔK280 tauRD-DsRed 融合蛋白表現，並於第四、七天更換含 Dox、RA、待檢測化合物的培養液，第八天進行高通量分析。(B)促 tau 聚集突變型(∆K280)細胞及以剛果紅 (Congo red) 、 NTNU-008 、 NC009-7 處理後及未處理者 (Untreated)之神經突觸生長性狀代表圖。(C)以未處理化合物之神經突觸總生長為 100% (Untr.) ，剛果紅 (Congo red) 、 NTNU-003 、 NTNU-008、NC009-1、NC009-2、NC009-3、NC009-6、NC009-7 之神經突觸生長性狀定量圖。*為 P < 0.05；**為 P < 0.01。. 51.

(59) 圖十、ΔK280 tauRD-DsRed SH-SY5Y 細胞處理先導藥物之蛋白檢測。 (A) 剛果紅 (Congo red) 及 GSK-3β 抑制劑類似物 (NTNU-003 、 NTNU-008)前處理後之 GRP78、HSP27、ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現與定量分析，以- Dox 組(GRP78、HSP27)或+ Dox 組(ΔK280 tauRD-DsRed)為 100%。(B)吲哚喹啉衍生物(NC009-1、NC009-2、 52.

(60) NC009-3、NC009-6、NC009-7)前處理後之 HSP27、ΔK280 tauRD-DsRed 蛋白表現與定量分析，以 - Dox 組 (HSP27) 或 + Dox 組 ( Δ K280 tauRD-DsRed)為 100%。. 53.

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