本研究主要探討在帕金森氏症的神經細胞退化過程中，免疫反應 對於神經細胞是否有保護作用或是會加促神經細胞的死亡。並探討細 胞因這些傷害（cytotoxicity）所引發的死亡機制為何。過去已有許多 研究發現 TNF-α或是干擾素-gamma（interferon-γ）及淋巴素-1 beta
（interleukin-1β）等免疫反應與神經細胞死亡或是帕金森氏症有關
（Rousselet et al., 2002；Ferger et al., 2004）。因此本論文使用 MPP+ 引 發 PC-12 細胞的死亡，並加入 TNF-α，作為實驗模式，來研究帕金 森氏症與 TNF-α的關係。
本實驗分別以 MTT Assay、DAPI 及 TUNEL 觀察細胞存活率、細 胞形態以及細胞凋亡情形，並以西方墨點法分析細胞死亡的相關蛋白 質表現。MTT Assay 與細胞形態上觀察到 MPP+ 的處理在 PC-12 上可 引起細胞凋亡，且 TNF-α的存在可以加劇 MPP+ 的細胞毒性。由細胞 形態上的分析發現，TNF-α合併 MPP+ 處理 2 小時後即可觀察到細胞 凋亡的現象，然而 MPP+ 處理在 6 小時後才能看到細胞有凋亡的情 形。這結果表示在 MPP+ 引發 PC-12 細胞的死亡過程中 TNF-α會加速 神經細胞的死亡。過去已有研究指出 TNF-α在神經細胞凋亡過程中 雖有著重要的影響（Soeda et al., 2001）另外，也有學者提出 TNF-α基 因缺損的剔除鼠可以減少 MPTP 引發多巴胺神經元的死亡（Ferger et
al., 2004）。這與本實驗觀察到的結果一致認為 MPP+ 或是 MPTP 引發 的神經毒素中 TNF-α的存在會促使神經細胞的死亡。
目前熟知MPP+ 可藉由改變細胞內酵素（enzyme）的功能而影響 細胞存活（Prezedborski and Vila, 2003），有研究者認為其中JNK為一重 要影響因子（Hunot et al., 2004）。在本論文中，我們以西方點墨法也 同樣觀察到MPP+ 或MPP+ 合併TNF-α的處理可以引發JNK磷酸化及 caspase-3活化的現象，且MPP+ 合併TNF-α時其JNK磷酸化現象較MPP+ 單獨處理時明顯。之前有文獻顯示，JNK磷酸化後可以促使c-Jun磷酸 化，c-Jun磷酸化與細胞的死亡有關（Li et al., 2004），因此，本實驗接 著探討JNK磷酸化是否會引起c-Jun磷酸化，我們同樣以西方點墨法去 偵測c-Jun的磷酸化。實驗結果發現c-Jun的磷酸化並不因為藥物處理而 增加。由實驗結果推測MPP+ 合併TNF-α能引發JNK磷酸化，但是在 此，磷酸化的JNK並未去影響其下游的受質：c-Jun。雖然這可能與一 般JNK磷酸化的作用不相符合，但是亦有學者認為JNK的受質除了 c-Jun外尚有Elk1、ATF2（Sugden and Clerk, 1998）、Bim及Bcl-2家族
（Okuno et al., 2004）。其中c-Jun、Elk1及ATF2被認為與細胞轉錄
（transcription）有關，而c-Jun除了和細胞轉錄有關外，也同樣和Bim 及Bcl-2家族被認為與細胞凋亡及存活有關（Sugden and Clerk, 1998；
Okuno et al., 2004； Waetzig and Herdegen., 2004；Chang and Karin.,
2001）。有研究發現在腦部局部缺血時也會刺激JNK活化而促使中樞神 經細胞死亡，但是卻同樣未引起c-Jun的磷酸化，而是經由BimL去促 使Bax影響粒線體功能而導致凋亡（Okuno et al., 2004）。
接著，我們進一步證明JNK或caspase-3在MPP+ 或MPP+ 合併 TNF-α處理引起細胞的死亡是否有直接關係。於是，實驗中使用了 JNK及caspase抑制劑，並從細胞形態評估細胞凋亡的情形，從細胞形 態結果發現MPP+ 合併TNF-α處理會導致細胞死亡、神經軸萎縮或是 使細胞無法貼附、呈現漂浮的狀態。當給予caspase抑制劑後可以有效 的抑制MPP+ 合併TNF-α處理導致細胞死亡，但是對於MPP+ 合併 TNF-α處理引起細胞漂浮的狀態卻無法明顯改善。然而在給予JNK抑 制劑處理的細胞組別，在西方墨點法雖顯示SP600125能有效減少JNK 磷酸化（data not shown）。但是從細胞形態上來看，卻無法有效緩解 細胞凋亡。於是實驗中進一步以TUNEL方式評估細胞凋亡的比例，從 TUNEL的結果中發現caspase抑制劑可以顯著減少細胞的死亡（圖十 二）。而JNK抑制劑只能輕微緩解MPP+ 合併TNF-α引發的細胞凋亡。
這個實驗結果證明抑制caspase時可以有效的緩解細胞的死亡；但是抑 制JNK只能輕微的減少細胞死亡，表示MPP+ 合併TNF-α處理導致細 胞死亡主要是與caspase-3的路徑有關（caspase-dependent）。
目前熟知的細胞凋亡路徑中，caspase-3是其中一個重要的細胞死
亡訊息。然而，caspase-3可以經由被許多蛋白質直接或是間接活化例 如：caspase-9（Viswanath et al.,2001）、caspase-8與10（Budihardjo et al.,1999）、JNK（Chun et al.,2001）等。在本論文中發現MPP+ 合併 TNF-α會導致細胞的死亡，且引起了 JNK 及 caspase-3 的活化，然而 在此實驗顯示 JNK 活化似乎與 caspase-3 活化的凋亡路徑沒有相關 聯。因此，在後續實驗裡將探討其他可能活化 caspase-3 的細胞訊息，
例如： caspase-9 及 caspase-8。如此才能確認 MPP+ 合併 TNF-α導致 的細胞死亡，是否其他的細胞訊息來活化 caspase-3 而產生細胞的死亡 訊息。