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M C
T TM
A C
B D
圖一、TNF-α 合併 MPP+ 處理可加重 MPP+ 的毒性。 PC-12 細胞培 養後分別予下列藥物處理：圖 A：對照組（C）；圖 B：30 ng/ml TNF-α
（T）；圖 C：150μM MPP+ （M）；圖 D：150μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α（TM），經處理 24 小時後，在 400 倍視野下以相位差顯微鏡 觀察細胞形態上改變。圖 A 對照組中白色箭頭所指處為神經軸。當 單獨給予 TNF-α 時細胞在形態上與對照組比較沒有明顯差異，白色 箭號所指處為神經軸（圖 B）。而 MPP+ 處理後，細胞開始出現皺縮、
神經軸退化之現象（圖 C）。當 MPP+ 合併加入 30 ng/ml TNF-α 處理 時，細胞死亡的現象更是明顯 （圖 D 黑色箭號所指處）。白色箭號 所指處為神經軸、黑色箭號所指處為貼附性差、死亡、皺縮的細胞或 是漂浮的細胞碎片（scale bar＝10μM）。
圖二、不同處理時間點引發細胞形態改變。 培養的 PC-12 細胞給予 各種不同藥物（300μM MPP+ ，30 ng/ml TNF-α 或 300μM MPP+ 合 併 30 ng/ml TNF-α）及不同時間點（1，2，6，12 及 24 小時）處理後 以 400 倍相位差顯微鏡觀察細胞形態上改變。右圖中圖 A：對照組處 理 1 小時（C1）；圖 B：TNF-α 處理 1 小時（T1）；圖 C：對照組處 理 24 小時（C24）；圖 D：TNF-α 處理 24 小時（T24）；圖 E：MPP+ 處 理 1 小時（M1）；圖 F：TNF-α 合併 MPP+ 處理 1 小時（TM1）；圖 G：
MPP+ 處理 2 小時（M2）；圖 H：TNF-α 合併 MPP+ 處理 2 小時（TM2）； 圖 I：MPP+ 處理 6 小時（M6）；圖 J：TNF-α 合併 MPP+ 處理 6 小時
（TM6）；圖 K：MPP+ 處理 12 小時（M12）；圖 L：TNF-α 合併 MPP+ 處理 12 小時（TM12）；圖 M：MPP+ 處理 24 小時（M24）；圖 N：TNF-α 合併 MPP+ 處理 24 小時（TM24）。白色箭號所指處為神經軸、黑色 箭號所指處為貼附性差、死亡、皺縮的細胞或是漂浮的細胞碎片（scale bar＝10μM）。
C1 T1
C24 T24
A B
C D
M1
M2
TM1
TM2
E F
G H
M6 TM6
M12 TM12
I J
K L
M24 TM24
M N
0
MPP 0 mM MPP0.075 mM MPP0.15 mM MPP0.3 mM MPP0.6 mM
groups
C M
T
A C
B D
TM
圖四、MPP+ 及 TNF-α 合併 MPP+ 處理引發細胞凋亡。 細胞分別給 予以下藥物處理：圖 A：對照組（C）；圖 B：30 ng/ml TNF-α（T）； 圖 C：150μM MPP+ （M）；圖 D：150μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α（TM），經處理 24 小時後，以 DAPI 染色並在雷射掃描共軛 焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy）觀察細胞凋亡的結果。
在對照組（圖 A）及 TNF-α 處理（圖 B）的細胞，細胞核完整、沒 有核濃縮的情形。在 MPP+ 處理後（圖 C），細胞出現凋亡的特徵，
例如：細胞核斷裂及核濃縮。而在 MPP+ 及 TNF-α 合併 MPP+ 處理的 細胞 （圖 D），其細胞核斷裂或是濃縮的情況更是明顯。箭號所指處 為斷裂或是濃縮的細胞核。
4H 8H M300 M150 M300 M150 cytochrome-c
β-actin
圖五、MPP+ 處理可引發 cytochrome-
c
的釋放。 上圖係以西方墨點 法偵測 MPP+ 處理後 cytochrome-c
的表現量。實驗結果顯示 150μM MPP+ 可引發 cytochrome-c
的釋放，且 8 小時 cytochrome-c
的表現量多 於 4 小時的表現量。在 300μM MPP+ 處理也看見同樣的趨勢。顯示 MPP+ 的處理可引發 cytochrome-c
的釋放，此一現象與 Viswanath等人 的實驗結果一致（Viswanath et al., 2001）。M300＝300μM MPP+ ；M150＝150μM MPP+ ；4H＝藥物處理 4 小時；8H＝藥物處理 8 小時。
β-actin
C T1 T2 T24 M2 M6 M12 M24 TM2 TM6 TM12 TM24
32 kD
17 kD
Caspase-3 (cleaved form) Caspase-3
圖六、MPP+ 及MPP+ 合併TNF-α處理可導致caspase-3活化。 PC-12 細胞分別給予藥物處理（30 ng/ml TNF-α、300μM MPP+ 或是給予 30 ng/ml TNF-α合併300μM MPP+ 或對照組）至特定時間點後，收取 細胞蛋白質，以西方墨點法偵測caspase-3的表現量。圖中cleaved caspase-3（17kD）代表活化的caspase-3。實驗顯示TNF-α單獨處理的 細胞並未引起caspase-3活化。而MPP+ 處理的細胞在6小時後，活化的 caspase-3表現量即增加（M6），但此一增加的現象與處理時間的增長 並無明顯關係（M12及M24）。而在TNF-α加MPP+（TM）處理組別，
活化的caspase-3表現量高於MPP+ 單獨處理組別。但是，TM組的cleaved caspase-3的表現量也並未隨著處理時間增加而增加（n＝3）。C：對照 組處理24小時；T1：TNF-α處理1小時；T2：TNF-α處理2小時；T24：
TNF-α處理24小時；M2：MPP+ 處理2小時；M6：MPP+ 處理6小時；
M12：MPP+ 處理12小時；M24：MPP+ 處理24小時；TM2：TNF-α合 併MPP+ 處理2小時；TM6：TNF-α合併MPP+ 處理6小時；TM12：TNF-α
C T1 T24 M1 M2 M6 M12 M24 TM1 TM2 TM6 TM12 TM24
JNK
p-JNK
β-actin
圖七、MPP+ 及MPP+ 合併TNF-α處理可導致JNK磷酸化。 PC-12細胞 分別給予不同藥物處理（30 ng/ml TNF-α、300μM MPP+ 或是給予 30 ng/ml TNF-α 合併 300μM MPP+ 或對照組）至不同時間點（1、2、
6、12、24 小時） 後收取細胞蛋白質，並且以西方墨點法偵測 JNK 及磷酸化 JNK（p-JNK）的表現量。圖中顯示 4 次實驗中的一次結果，
JNK、p-JNK 與β-actin 的表現量。由實驗結果顯示，JNK 磷酸化的表 現量，在 TNF-α合併 MPP+ 處理組別（TM1、TM2、TM6、TM12 及 TM24）有增加傾向（n＝4）。C：對照組處理 24 小時；T1：TNF-α 處 理 1 小時；T24：TNF-α 處理 24 小時；M1：MPP+ 處理 1 小時；M2：
MPP+ 處理 2 小時；M6：MPP+ 處理 6 小時；M12：MPP+ 處理 12 小時；
M24：MPP+ 處理 24 小時；TM1：TNF-α 合併 MPP+ 處理 1 小時；TM2：
TNF-α 合併 MPP+ 處理 2 小時；TM6：TNF-α 合併 MPP+ 處理 6 小時；
TM12：TNF-α 合併 MPP+ 處理 12 小時；TM24：TNF-α 合併 MPP+ 處 理 24 小時。箭號所指處為 JNK 或 p-JNK 所在之分子量（54kD 及
P-C-Jun
β-actin
C T24 M1 M2 M6 M12 M24 TM1 TM2 TM6 TM12 TM24
圖八、MPP+ 及MPP+ 合併TNF-α處理並不導致c-Jun 磷酸化 （p-c-Jun）
的增加。 培養的PC-12細胞分別給予不同藥物處理（30 ng/ml
TNF-α、300μM MPP+ 或是給予30 ng/ml TNF-α合併300μM MPP+ 或 對照組）至不同時間點（1、2、6、12、24小時）後收取細胞蛋白質，
並且以西方墨點法偵測p-c-Jun的表現量。上圖為四次實驗的結果之 一，結果顯示p-c-Jun表現量並不因為各組藥物處理而增加（n=4）。C：
對照組處理24小時；T24：TNF-α處理24小時；M1：MPP+ 處理1小時；
M2：MPP+ 處理2小時；M6：MPP+ 處理6小時；M12：MPP+ 處理12小 時；M24：MPP+ 處理24小時；TM1：TNF-α合併MPP+ 處理1小時；TM2：
TNF-α合併MPP+ 處理2小時；TM6：TNF-α合併MPP+ 處理6小時；
TM12：TNF-α合併MPP+ 處理12小時；TM24：TNF-α合併MPP+ 處理 24小時。
C T M TM
p-c-Jun
圖九、MPP+ 合併 TNF-α 處理可增加 JNK 活性。 培養的 PC-12 細胞 分別給予不同藥物處理 （30 ng/ml TNF-α、300μM MPP+ 或是給予 30 ng/ml TNF-α 合併 300μM MPP+ 或對照組）至 24 小時後收取細胞 蛋白質，並以自 Cell Signal 購得之 Kinase Assay Kit 分析 p-c-Jun 表現 量用以評估 JNK 的活性。此圖為四次實驗的結果之一。結果顯示 p-c-Jun 表現量在 MPP+ 合併 TNF-α 處理的細胞有增加的趨勢（n=4）。 顯示 JNK 活性因藥物合併處理而上升。C：對照組處理 24 小時；T：
TNF-α 處理 24 小時；M：MPP+ 處理 24 小時；TM：TNF-α 合併 MPP+ 處理 24 小時。
圖十、抑制 caspase 活化可阻止 MPP+ 及 MPP+ 合併 TNF-α 導致的 PC-12
圖十、抑制 caspase 活化可阻止 MPP+ 及 MPP+ 合併 TNF-α 導致的 PC-12