實驗一、評估 MPP+ 、TNF-α或 MPP+ 合併 TNF-α對 PC-12 的作用 細胞凋亡的過程在形態學上具有一些特徵，例如：細胞萎縮、細 胞質濃縮、染色質凝聚並黏附在核膜形成隆起和出現凋亡小體；細胞 內的粒線體、高爾基體沒有腫脹現象；在相當長一段時間內，核膜保 持完整。這些細胞形態上的改變均可利用相位差顯微鏡（phase contrast microscope）的技術來觀察。
圖一實驗使用未分化的 PC-12 細胞，並分別予以 150μM MPP+、 30 ng/ml TNF-α 及 150μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α，經處理 24 小 時後，細胞以 400 倍相位差顯微鏡觀察細胞形態上改變。
由圖一實驗結果發現未經藥物處理組別（對照組）中部分 PC-12 細胞可觀察到神經軸生長（圖 A 白色箭號所指處），當單獨給予 TNF-α30 ng/ml 24 小時後，細胞在形態上與對照組比較沒有明顯差 異，且細胞仍然具有神經軸生長能力（圖 B）。但是當給予
150μM MPP+ 處理後，細胞開始出現細胞凋亡的特徵，例如：皺縮
（shrinkage）、神經軸退化（neurite retraction）等（圖 C 黑色箭號所指 處）。而且當合併加入 30 ng/ml TNF-α 處理時，細胞死亡的現象更是 明顯（圖 D）。
為探討不同時間點 MPP+ 與 TNF-α 藥物處理對細胞形態的影
響。圖二實驗中分別給予細胞 300μM MPP+ 、30 ng/ml TNF-α 或 150μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 處理至不同時間點（1、2、6、12 及 24 小時）。圖二實驗結果發現對照組在 1 小時（C1；圖 A）及 24 小時（C24；圖 C）細胞外觀成圓形、完整且部分細胞有神經軸的生 長表現（圖 A 及圖 C 白色箭號所指處）。當單獨處理 30 ng/ml TNF-α 時細胞在各個時間點（TNF-α 處理 1 小時，T1，圖 B；TNF-α 處理 24 小時，T24，圖 D）其形態上與對照組比較沒有明顯差異。但是當 予以 300μM MPP+ 處理 6 小時後（M6，圖 I），細胞開始出現皺縮、
貼附性差或是漂浮的細胞碎片。且此死亡現象隨著處理時間增加而更 明顯。但是，當 300μM MPP+ 合併加入 30 ng/ml TNF-α 處理時，細 胞自 2 小時即開始出現上述特徵（TM2，圖 H），且此現象隨著時間 增加而增加。
由圖一、圖二中的結果顯示，在時間點上不但 TNF-α 與 MPP+ 合併處理會引起較多細胞死亡，且細胞死亡現象隨著處理時間增加而 增加。
實驗二、評估 MPP+ 、TNF-α或 MPP+ 合併 TNF-α處理對 PC-12 的存 活率（cell viability）影響
為更進一步證實 MPP+ 合併 TNF-α同時處理能引起細胞死亡，在
此使用 MTT Assay 來評估細胞存活率。MTT Assay 被廣泛應用於細胞 存活率的檢測。MTT（3-(4,5dimethyl- thiazol- 2-yl) - 2,5-dip-he-
nyltetrazolium bro- mide）是一種水溶性且黃色的物質，可以被粒線體 內的脫氫酶 （dehydrogenase）還原生成結晶狀的藍紫色產 formazan。
Formazan 以 10% SDS 溶解後，可利用 enzyme-link immunosorbent assay
（ELISA）reader 在波長 570 nm 下測其吸光值並分析之。因為只有活 細胞的粒線體內才有脫氫酶，能將 MTT 還原成結晶狀的藍紫色物，
故所測得的吸光值與細胞存活率成正比。因此若吸光值愈大，則表示 細胞存活率愈高。所以我們可利用吸光值評估細胞存活率。
本實驗使用未分化的 PC-12 細胞來進行下列實驗，細胞培養在 96 孔盤中且分為不同藥物處理組別：（1）. 600μM MPP+；（2）. 300μM MPP+；（3）. 150μM MPP+ ；（4）. 75μM MPP+；（5）. 30 ng/ml TNF-α合併 600μM MPP+ ；（6）. 30ng/ml TNF-α合併 300μM MPP+ ；
（7）. 30 ng/ml TNF-α合併 150μM MPP+；（8）. 30 ng/ml TNF-α合併 75μM MPP+ ；（9）. 15 ng/ml TNF-α合併 600μM MPP+ ；（10）. 15 ng/ml TNF-α合併 300μM MPP+ ；（11）. 15 ng/ml TNF-α合併 150μM MPP+ ；（12）. 15 ng/ml TNF-α合併 75μM MPP+ ；（13）. 30 ng/ml TNF-α；（14）. 15 ng/ml TNF-α；（15）. control。以上各組細胞經處 理 24 小時後細胞以 MTT Assay 評估細胞存活率。
圖三的實驗結果顯示，當分別給予 TNF-α 0、15 或 30 ng/ml 時，
並不影響細胞存活率（0 ng/ml TNF-α，100% ± 0.31；15 ng/ml
TNF-α，95.12% ± 2.96；30 ng/ml TNF-α，99.75% ± 4.48）。但是 MPP+ 處理的細胞中，當濃度愈高時細胞的存活率就越低（75μM MPP+， 93.09% ± 4.37；600μM MPP+，73.98% ± 2.33）。而且當合併加入 TNF-α15 或 30 ng/ml 時，細胞存活率更是明顯下降。例如：當細胞 給予 75μM MPP+處理 24 小時後，細胞存活率與對照組相較是沒有差 異的（75μM MPP+，93.09% ± 4.37；對照組，100﹪± 0.31） 但是，
當 75μM MPP+ 合併 TNF-α 不論是 15 ng/ml 或是 30 ng/ml，細胞存活 率與分別與單一藥物處理組相較則呈現有統計意義的下降（圖三）。
而且二樣藥物合併處理所引發之細胞死亡率傾向大於此二種藥物分 別處理時引發的死亡率的總合。表示 MPP+ 對細胞的毒性因 TNF-α 的 存在而增加。
本實驗結果係以 mean ± S.D.來表示，以對照組當作 100﹪後以 One-Way ANOVA 分析其差異性，當
p
值小於 0.05 時則判定為有統計 意義之差異（每次實驗 3 重複，n =3）。實驗三、利用 DAPI （4',6-diamidino-2-phenylindole）染色觀察藥物處 理是否引起細胞凋亡
4，6-聯脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole ；DAPI）是 常用的DNA特異性染料之一。它是一種半通透性染料，用於常規固定 細胞的染色。DAPI主要結合在DNA的A-T鹼基區，以螢光顯微鏡或共 軛焦顯微鏡用紫外光激發即可見明亮的藍色螢光。DAPI 染色是以細 胞核的形態改變作為評估細胞凋亡的指標。細胞凋亡時的特徵為細胞 核濃縮（condensation）、DNA斷裂 (DNA fragmentation) 及細胞皺縮
（shrinkage），若是有此現象可以做為細胞凋亡指標 （Schapira, 1999；
Kim et al., 2003）。
在前面實驗結果顯示 MPP+ 或 MPP+ 合併 TNF-α 處理可引發 PC-12 細胞死亡。並有文獻顯示 MPP+ 處理會引發細胞凋亡（Nicotra and Parvez, 2003） 。在此我們欲進一步探討 MPP+ 及 MPP+ 合併 TNF-α 處理引起的細胞死亡是否屬於細胞凋亡。之前實驗結果（圖 一）顯示 150μM MPP+ 或 150μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 處理 即可明顯引發 PC-12 細胞死亡。因此，本實驗將 PC-12 細胞培養在 1.8 平方公分的蓋玻片上，並分別給予 150μM MPP+、30 ng/ml TNF-α、150μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 處理 24 小時後，以 DAPI 染細胞核後並以雷射掃描共軛焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy）觀察細胞凋亡的情形。
實驗結果在圖四中發現在對照組或是 30 ng/mlTNF-α 處理的細
胞，細胞核完整、沒有核濃縮或裂解（apoptotic nuclei）的情形。在 MPP+ 處理的細胞，細胞出現凋亡的特徵，例如：細胞核斷裂及核 濃縮。而 TNF-α 合併 MPP+ 處理後，細胞核斷裂或是濃縮的情形相 對增加。可知，本實驗中藥物處理可引發細胞凋亡。
實驗四、以西方墨點法分析藥物處理引發 PC-12 細胞死亡的相關蛋白 質表現。
在MPTP的帕金森氏症的實驗模式中發現MPTP處理導致的細胞 死亡可能與凋亡的路徑有關，其相關蛋白質有cytochrome-
c
及caspase-3（Fahn and Sulzer., 2004）。另外也有其他學者發現1 mM的MPP+ 處理72 小時可引發SH-SY5Y細胞凋亡，且導致caspase-3的活化及JNK磷酸化
（Chen et al., 2003），另外，在其他神經細胞株例如：MN9D，也發現 100μM的MPP+ 處理12小時也可引發細胞死亡，且可藉由抑制caspases 來緩解細胞死亡的比例（Choi et al., 1999）。在PC-12細胞也有研究發 現經由MPP+ 處理後可降低細胞存活率，且引起caspase-3的活化（Park et al., 2003；Sheng et al., 2002；Viswanath et al., 2001；Chuenkova et al., 2003）。除此之外，MPP+ 或MPTP也被證實會引起JNK磷酸化 （Hunot et al., 2004；Eberhardt and Schulz, 2003；Nicotra and Parvez, 2003），且有 學者認為MPP+ 處理導致的神經細胞死亡可能經由JNK路徑而誘發
caspase-3活化而致（Chun et al., 2001）。因此本實驗旨在探討MPP+ 或 MPP+ 合併TNF-α處理導致的PC-12細胞凋亡是否也與JNK及caspase-3 的路徑有關。
實驗中將PC-12細胞培養在6孔盤培養皿內，每孔盤約有7×105個細 胞，並分別給予300μM MPP+ 、30 ng/ml TNF-α、300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α處理至特定時間後，分別收取細胞蛋白質，再以西方 墨點法分析caspase-3、JNK及cytochrome-
c
等相關路徑的蛋白質表現量 及JNK的活性分析。我們先測試MPP+ 是否能引發cytochrome-
c
釋放，結果發現MPP+ 不論是150或是300μM在處理4小時後即可引起cytochrome-c
釋放，且 具有時間相依性的特徵（圖五）。Viswanath等人曾證實MPP+ 處理引起 cytochrome-c
釋放之後，將導致caspase的活化（Viswanath et al., 2001）。 因此，我們便進一步探討MPP+ 及MPP+ 合併TNF-α處理導致的細胞 死亡是否會經由caspase的活化。在caspase家族中，caspase-3屬於細胞 凋亡的執行者（executioner），而且被認為是在帕金森氏症中導致神經 退化的主要因子（Viswanath et al., 2001）。實驗結果如圖六所見，MPP+ 處理的確可引起caspase-3的活化，然而MPP+ 合併TNF-α處理所導致 活化的caspase-3的表現量均高於單獨給予MPP+ 處理的組別。有文獻 指出在MPP+ 處理後導致的神經細胞死亡機制與JNK活化caspase-3有關（Chun et al., 2001）。接著，我們欲探知MPP+ 合併TNF-α處理引起 的JNK磷酸化是否與此一凋亡現象有關？由四次實驗結果中觀察到 不同時間點的TNF-α或MPP+ 單獨處理時，與對照組相較並不誘發 JNK磷酸化。但是，在TNF-α合併MPP+ 處理1小時後，則可觀察到磷 酸化的JNK表現量增加（TM1），而此現象在2、6、12及24小時均可觀 察到（TM2、TM6、TM12及TM24）。然而，JNK磷酸化一旦被誘發後，
其表現量並不因為處理時間的增長而增加。
為進一步證實JNK的磷酸化後是否經由改變細胞內的c-Jun的活 性來影響細胞的存活，我們以西方墨點法，在實驗結果中（圖八）發 現不論是單獨給予MPP+ 、TNF-α處理或是MPP+ 合併TNF-α處理 時，c-Jun的磷酸化卻不見增加（n=4）。由圖七及圖八的實驗結果顯示，
或許圖七中觀察到的JNK的磷酸化並不是作用於改變細胞內的c-Jun 的活性。為進一步確認圖七所看到的結果，我們接著以kinase assay的 方式來探討給予MPP+ 合併TNF-α處理後JNK活性的改變。結果如圖 九所見，MPP+ 合併TNF-α處理時引發了JNK活性的增加，這與圖七 JNK磷酸化的結果相符。由圖七圖、八及圖九的實驗中，我們推測MPP+ 合併TNF-α處理時可增加JNK的磷酸化及其活性，但此一活化的JNK 並非直接促使c-Jun的磷酸化，而是可能作用於其他下游的受質
（substrates）。
實驗五、評估 JNK 的活化與 caspase-3 的活化在 MPP+ 合併 TNF-α 引 發細胞凋亡之角色。
經由以上實驗得知 TNF-α合併 MPP+ 處理導致細胞死亡且引發 了 caspase-3、JNK 磷酸化及 JNK 活性增加。因此本實驗使用 SP600125
（JNK 抑制劑） 及 Z-VAD （caspase 抑制劑）來觀察抑制 JNK 及 caspase-3 是否能緩解 TNF-α 合併 MPP+ 處理導致的細胞死亡。圖十 實驗結果發現 MPP+ （圖 D）或是 300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 處理（圖 E）可導致 PC-12 細胞產生如：皺縮、神經軸退化且細胞呈 現懸浮或是貼附性差等現象。然而當細胞給予 100μM Z-VAD 前處理 30 分鐘後，再給予 300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α，細胞死亡的 現象可以明顯的被緩解 （圖 G），但是對於 300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 造成細胞懸浮或是貼附性差（poor adhesion）的情形卻無法改
（JNK 抑制劑） 及 Z-VAD （caspase 抑制劑）來觀察抑制 JNK 及 caspase-3 是否能緩解 TNF-α 合併 MPP+ 處理導致的細胞死亡。圖十 實驗結果發現 MPP+ （圖 D）或是 300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 處理（圖 E）可導致 PC-12 細胞產生如：皺縮、神經軸退化且細胞呈 現懸浮或是貼附性差等現象。然而當細胞給予 100μM Z-VAD 前處理 30 分鐘後，再給予 300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α，細胞死亡的 現象可以明顯的被緩解 （圖 G），但是對於 300μM MPP+ 合併 30 ng/ml TNF-α 造成細胞懸浮或是貼附性差（poor adhesion）的情形卻無法改