伍、討論：

低劑量與高劑量的 DOX 可能經由不同途徑影響心肌與非心肌細胞。在

我們的實驗中，DOX 引起之心肌與非心肌細胞的 ET-1 分泌沒有 dose- dependent 的現象，有趣的是以 DOX 處理心肌細胞 24 小時後，0.1µM DOX 會抑制心肌細胞ET-1 的分泌，但是 1µM 和 10µM DOX 則會增加心肌細胞 ET-1 的分泌。而以 DOX 處理非心肌細胞 24 小時後，1µM DOX 會抑制非 心肌細胞ET-1 的分泌，但是 10µM DOX 則會增加非心肌細胞 ET-1 的分泌。

在之前發表的報告中，DOX 處理的老鼠血漿中 ET-1 值會上升，但是沒有 dose- dependent 的現象。實驗中老鼠從腹腔每次注射 5 mg/kg DOX，隔天 注射一次，使五組老鼠 DOX 的累積劑量分別達到 5 , 10, 15, 20 和 25 mg/kg，以及一組單一次注射高劑量 20 mg/kg。在最後一次注射的 24 小時 後，測血漿中ET-1 量。DOX 累積 10, 15, 20 mg/kg 的組別和只注射生理食 鹽水的組別相比，增加85%, 76% 和 97% ，而且在單一次注射 20 mg/kg 的 組別，發現血漿中 ET-1 量特別高，增加 130% (Sayed-Ahmed MM et.al., 2001)。除此之外，在細胞凋亡相關研究中，受到高劑量與低劑量的 DOX 處理的細胞表現有所差別，例如以1µM DOX 處理 p388 leukemic cells 會引 起細胞凋亡但在10µM DOX 處理下卻沒有(Ling et al.,1993)；Gewirtz 整理 前人的研究結果後提出一個假設，高劑量的anthracyclines 是經由非生理的

機制殺死腫瘤細胞(Gewirtz,1999)。這些結果似乎顯示 DOX 在低劑量與高 劑量時，採用不同的機制影響細胞。

ET-1 雖然在血漿中的 half-life 只有幾分鐘，但是作用時間卻可以持續 1 小 時 ， 所 以 非 心 肌 細 胞 受 到 DOX 刺 激 後 ET-1 的 分 泌 量 迅 速 增 加 (paracrine)，ET-1 有保護心肌細胞，減輕 DOX 引起的心肌細胞凋亡的作用，

加上心肌細胞本身受DOX 影響也會自我分泌 ET-1 (autocrine)。在 Takahiko, S. 和 Takashi, M. 的研究中證明將心肌細胞前處裡 ET-1 24 小時之後，可 以保護心肌細胞，減輕 DOX 引起的心肌細胞凋亡，作用可持續到 24 小時 (Takahiko, S. and Takashi, M. ,2001)。在我們的實驗中，1µM DOX 處理下，

非心肌細胞分泌的高峰出現在 6 小時，而心肌細胞出現在 12 小時(詳見圖

5 )，若綜合兩種細胞的表現模式，ET-1 的分泌增加可以持續到 12 小時，

在 in vivo 上是否能得到相似的表現模式，需要更進一步的研究證明。

非心肌細胞的ET-1 分泌受到其他機制的調控。觀察非心肌細胞以 DOX 處理的結果，我們發現DOX 在 3 小時內會抑制 ET-1 的轉錄，但是在 ET-1 的分泌量上我們卻觀察到，ET-1 的分泌在 6 小時內明顯地增加(詳見圖 1)，

我們推論是因為非心肌細胞平時就會穩定地表現 ET-1，即使在無血清的環

境下，因此細胞中隨時都有 prepro-ET、big-ET 的存在，雖然 DOX 抑制了

ET-1 的轉錄，但卻經由 Weibel-Palade bodies degranulation 的機轉增加了 ET-1 的分泌(詳見圖 13)。在人類內皮細胞中的蛋白質由內質網到細胞膜的 運輸經由二個完全不同的分泌途徑：一個是持續性的途徑，一個是受調節 的途徑。持續性的途徑受mRNA 的表現所調節(Yanagisawa et al.,1988) ； 受調節的途徑則和細胞中的儲存胞器Weibel- Palade bodies 的調節有關。之 前的研究報告，當機械張力作用在培養的牛動脈內皮細胞上，20 分鐘內，

在培養液中就能測到ET-1(Macarthur et al.,1994)。而在老鼠的內皮細胞中有 Weibel-Palade bodies 的存在(Doi et al., 1996; Ozaka et al.,1997)。因此在我們 的 實 驗 中 ， 非 心 肌 細 胞 很 有 可 能 是 受 到 DOX 刺 激 後 ， 很 快 的 經 由 Weibel-Palade bodies degranulation 分泌出 ET-1 ，使 ET-1 的分泌在 6 小時 內明顯地增加。但是在 6 小時後，因為 ET-1 mRNA 表現的早期抑制、加上 儲存在Weibel-Palade bodies 中的 ET-1 被分泌出去，還有 ET-1 本身的 half-life 只有幾分鐘，因此使得6 小時後培養液中的 ET-1 迅速下降。

DOX對心肌細胞和非心肌細胞的影響有很明顯的不同。在之前的研究 中已經確定拓樸異構酶II是DOX的作用目標，當DNA被切開並與拓樸異構 酶II 的 tyrosine 形 成 共 價 結 合 時 ， DOX 的 環 狀 結 構 會 插 入 DNA ， 形 成 DOX-DNA-topoisomerase II三元體，DOX沒有插入DNA的部分扮演穩定三 元體的角色，結果使得DNA斷裂(Binaschi et al.,2000,2001)。這樣的DNA斷

裂 造 成 細 胞 生 長 停 在G1和G2期 以 及 造 成 計 畫 性 的 細 胞 死 亡(Perego et al.,2001; Zunino et al., 2001)。反之，腫瘤細胞會對DOX產生抗藥性的原因 之一，就是因為topoisomerase II基因的表現或活性發生改變(Lage et al., 2000)。至於為何DOX對於非心肌細胞的ET-1 RNA的表現有抑制的現象但 是對心肌細胞卻沒有抑制的原因，可能就是因為DOX的會嵌入DNA、抑制 拓樸異構酶II的活性，因此DOX對於會分裂的細胞影響特別大，而心肌細 胞是不會再分裂的細胞，因此心肌細胞的ET-1 mRNA的表現不會受到DOX 的抑制。

此外，我們發現心肌細胞ET-1的轉錄與ET-1的分泌有一時間上的差異 (詳見圖9)。我們推論是因為ET-1轉譯成蛋白質後，還需要經過細胞內酶的 剪切，由prepro-ET變成big ET，還要經ECE(endothelin converting enzyme) 剪切成為ET-1，最後才分泌出去，因此ET-1的轉錄與ET-1的分泌才會有時 間上的差距。從之前研究牛生殖系統ET-1表現的real-time結果發現，ET-1 mRNA的表現高峰出現在12~24小時，但是ET-1 protein分泌的高峰則是出現 在24~48小時(Schams et al.,2003)。此外另一個可能性是由於DOX代謝產物 對 心 肌 細 胞 的 影 響 大 於DOX 的 緣 故 ， DOX 在 心 臟 中 會 被 代 謝 為 C-13 alcohols ( Young and Raymond, 1986 )，Doxorubicinol (DOXol)是DOX主要的 C-13 alcohol代謝物，會累積在心臟組織中(Del et al., 1985; Rossini et al.,

1986) ，在DOX引起的心臟毒性中扮演重要的角色(Danesi et al., 1987; Olson et al., 1988) 。從藥理學的觀點來看，這可以解釋DOX處理有延遲之心臟毒 性的現象，從實驗中發現DOX注射到老鼠體內1小時後，心臟中的DOX濃 度達到最高，然而DOXol幾乎測不到；經過24小時後，心臟中的DOXol濃 度逐漸增加，高過肝臟中的濃度(Peters et al., 1981) 。DOXol能比ROS促進 更多的鐵離子之釋放，鐵離子與ROS的作用產生更多自由基，在牛動脈內 皮細胞中及H9c2心肌細胞中會造成apoptosis (Minotti et al., 2001; Kotamraju et al.,2002)。而DOX造成的心臟衰竭與ET-1的表現有正相關性，因此心肌細 胞ET-1的延遲分泌有可能和DOX的延遲心臟毒性有關。

ROS的增加會促進心肌細胞的ET-1的表現，在之前的許多研究已經證 實ROS在心臟血管疾病中扮演訊息傳遞的角色，以活化轉錄因子及下游基 因的表現。ROS的產生是經由細胞內酶的作用，而catalase有去除細胞內H2O2

功能(詳見圖14,A)。細胞外的刺激會增加細胞內的ROS，抗生素，例如DOX 的quinone結構受到NAD(P)H-oxidoreductases (cytochrome P450 reductase、

cytochrome b5 reductase、mitochondrial NADH dehydrogenase、xathine dehydrogenase 和 endothelial nitric oxide synthase ) 所催化，當作反應的電 子接受者，使得quinones轉變成semiquinone free radicals，接著semiquinone free radicals藉由還原氧原子使本身迅速恢復為quinone結構，因此產生活性

氧族群(ROS)，像是superoxide anion(O2^‧﹣)、hydrogen peroxide (H2O2)等 (Vasquez-Vivar et al., 1997; Minotti et al., 1999)。另一方面semi- quinone free radicals也會自我氧化，產生deglycosidation和7-deoxyaglycone以及H2O2。此 外，DOX的親脂性7-deoxyaglycone會累積在粒腺體內膜上，大大增加呼吸 鏈轉移給氧的電子，使得O2^‧﹣和H2O2增加(Gille and Nohl, 1997)。這些ROS 會參與MAPKs pathway的調控以及NF-κB的活化等，MAPKs pathway會活化 基因的AP-1 sites，例如ET-1的promoter上的AP-1 site ，進而活化下游基因 的轉錄；而NF-κB的活化與細胞凋亡有關(詳見圖23,B) (Jun-ichi, A. and Bradford C. B.,1998)。在我們的實驗中發現，DOX會刺激心肌細胞表現 ET-1，並且是經由ROS相關的訊息傳遞路徑活化ET-1的轉錄，因為 這個現象受到catalase的抑制，而catalase具有清除H2O2的功能。

雖然在許多病人的臨床報告和老鼠的活體實驗的結果都指出，DOX 會

引起血漿中 ET-1 量的持續上升，且和心臟衰竭有正相關性，因此 ET-1 具 有當作DOX 引起心臟損傷的指標的潛力，但是要實際使用 ET-1 當作 DOX 引起心臟損傷的指標，需要在機制上有更多的了解，以及在實驗上有更多 數據支持。在我們的實驗中發現 DOX 的確會刺激心臟細胞的 ET-1 分泌增 加，是經由刺激非心肌細胞 ET-1 的分泌以及刺激心肌細胞 ET-1 的表現及 分泌，我們發現非心肌細胞負責早期的 ET-1 分泌(6 小時前)，而心肌細胞

負責較晚期的 ET-1 分泌(12~24 小時)。並且 DOX 是經由引起 ROS 有關的

機制而調控心肌細胞ET-1 表現量的增加，但是在非心肌細胞中是經由其他

的機制參與ET-1 表現的調控。

＊

ET-1 secretion (fmol/ml/1x10 6 cells)

DOX 1µM

12、24 小時，之後收集培養液，用 Endothelin-1 Biotrak Assay 測 ET-1 的量。

12 小時 DOX 處理的心肌細胞之 ET-1 分泌量是 14.7 fmol/ml，對照組沒有 測到ET-1 分泌。24 小時 DOX 處理的心肌細胞之 ET-1 分泌量是 8.7fmol/ml，

對照組是6.9 fmol/ml。(mean±S.T.D.E.V.;＊P<0.05 v.s.沒有處理 DOX 的心肌 細胞; n=5)。

(μM)

E T -1 s ecr et io n (f m ol /m l/ 1x10

6

cel ls )

＃ DOX 處理細胞 24 小時之後，收集培養液，用 Endothelin-1 Biotrak Assay 測 ET-1 的量。發現 1µM、10µM 的 DOX 明顯引起心肌細胞的 ET-1 分泌，但 是0.1µM 的 DOX 會抑制 ET-1 的分泌。0.1µM DOX、1µM DOX 和 10µM DOX 處理的心肌細胞之ET-1 分泌量分別是 5.24 fmol/ml、12.3 fmol/ml 和 11 fmol/ml，對照組是 8.3 fmol/ml，沒有 dose-dependent 的現象。(mean±

S.T.D.E.V.;＊P<0.05 v.s.沒有處理 DOX 的心肌細胞; # P<0.05 v.s.沒有處理 DOX 的心肌細胞; n=5)。

＃

ET-1 secretion (fmol/ml/1.5x10 6 cells)

＊ ＊

1µM處理細胞 1、3、6、12、24 小時，收集培養液，用Endothelin-1 Biotrak Assay測ET-1 的量。1 小時DOX處理的非心肌細胞之ET-1 分泌量是 11.2 fmol/ml，對照組是 3.9 fmol/ml。3 小時DOX處理的非心肌細胞之ET-1 分泌 量是17.5 fmol/ml，對照組是 3 fmol/ml。6 小時DOX處理的非心肌細胞之ET-1 分泌量是30 fmol/ml，對照組是 11.4 fmol/ml。(mean± S.T.D.E.V. ;＊P<0.05 v.s.

沒有處理DOX的非心肌細胞; # P<0.05 v.s.沒有處理DOX的非心肌細胞;

n=6)。

圖4. DOX刺激非心肌細胞ET-1 的分泌。從初生 1-2 天的Wistar rat分離培養 出來的非心肌細胞，經由DMEM培養 2 代後，每培養皿種 1.5x10⁶細胞，以 DMEM培養 1 天，接著換上sreum-free DMEM 24 小時後，以 0.01、0.1、1、

10µM的DOX處理細胞 24 小時，收集培養液，用Endothelin-1 Biotrak Assay 測ET-1 的量。1µM 和 10µM DOX處理的非心肌細胞之ET-1 分泌量是 15.5 和 25.3 fmol/ml，對照組是 19 fmol/ml，沒有dose-dependent的現象。

(mean±S.T.D.E.V.;＊P<0.05 v.s.沒有處理DOX的非心肌細胞; # P<0.05 v.s.沒 有處理DOX的非心肌細胞;n=6)。

在文檔中 阿黴素對心臟內皮素表現的影響 (頁 48-58)