四、RT-PCR

(1) total RNA 之分離

將-70℃儲存的細胞解凍，震盪打散細胞，將樣本通過直徑 0.9mm 的針頭 5 次，加入等體積的 70% 酒精混合均勻，將所有的樣本加到 RNeasy Mini Column set中，以 10,000 rpm 離心15秒，倒掉管內液體。

加700µl RW1到 RNeasy Mini Column set 中，以 10,000 rpm 離心15 秒，倒掉管內液體。將RNeasy Mini Column 移到新的 2ml 離心管，加

入500µl RPE，以 10,000 rpm 離心15秒，倒掉管內液體。加500µl RPE 到RNeasy Mini Column set中，以 10,000 rpm 離心2分鐘，倒掉管內液 體。最後將RNeasy Mini Column移到新的 1.5ml 離心管，加入30µl RNase-free water，以 10,000 rpm 離心1分鐘，得到total RNA，儲存在 -70℃。

(2) RNA量測定

取 2µl total RNA，加 68µl RNase-free water，以光電比度計測 A260/A280( nm) 吸光值，RNA濃度以下列公式換算求得：

RNA濃度 (µg/ml) = OD260 As值 × 40 × 稀釋倍數

(3) total RNA 的 rRNA 比例檢測

取 5µl total RNA，進行 1%瓊脂凝膠電泳，檢測 18S rRNA、28S rRNA 比例。

(4) Superscript II RT

取2.5µg 的 total RNA， 加入 oligo dT 0.5µl、25mM dNTP 0.5µl、

滅菌之去離子水6.5µl，65℃反應 5 分鐘，接著放到冰上逾 10 分鐘。接 著加入RNase inhibitor 0.5µl、Superscript II reverse transcriptase 0.5µl、

5X 第一次反應緩衝液 2.5µl，37℃反應 1 小時，合成 cDNA。

(5) PCR

取反轉錄作用成的cDNA 2µl，加入 ET-1 引子各 0.5µl 或 GAPDH 引 子各0.5µl、2mM dNTP 5µl、Taq DNA polymerase buffer 5µl、Taq DNA polymerase 0.25µl、滅菌去離子水 36.25µl。反應 94℃、30 秒，55℃、30 秒，72℃、1 分鐘，25 個循環。

(6)瓊脂凝膠電泳

取10µl RT-PCR 產物，進行 1%瓊脂凝膠電泳，電泳結束，以紫外光影 像分析儀檢測mRNA 的表現。

五、細胞內ROS測定

將以doxorubicin處理的細胞及控制組的細胞用1XPBS洗2次，接著以 trypsin 處理2分鐘，收集下來以200rpm、5分鐘離心，重新以1XPBS打散 細胞，計算細胞數，之後每管加入5µl 的10 mM nonpolar 2’,7’-DCFH-DA (nonpolar 2’,7’- dichlorofluorescein diacetate)，避光下，在37℃、震盪反應30 分鐘，之後以1200xg、5分鐘離心，沉澱的細胞重新以1XPBS懸浮，測 525/475nm螢光光譜。

六、以 CAT assay 測 ET-1 promoter 的活性 (1)細胞轉染

(1-1)轉染-1.7kCAT plasmid

5µg -1.7kCAT plasmid 和 10µl lipofectamine 分別加入不含血清及 抗生素的DMEM 到 800µl，彼此混合作用 45 分鐘後，加同樣的培養 液5 毫升，處理細胞 16 小時後，將 DMEM 盡量吸乾淨，換上 10%DMEM 終止反應。

(1-2)轉染 pBLCAT2 plasmid

5µgpBLCAT2 plasmid 和 10µl lipofectamine 分別加入不含血清及 抗生素的DMEM 到 800µl，彼此混合作用 45 分鐘後，加同樣的培養 液5 毫升，處理細胞 16 小時後，將 DMEM 盡量吸乾淨，換上 10%DMEM 終止反應。

(1-3)轉染 pBLCAT3 plasmid

5µg pBLCAT3 plasmid 和 10µl lipofectamine 分別加入不含血清及 抗生素的 DMEM 到 800µl，彼此混合作用 45 分鐘後，加同樣的培養 液 5 毫升，處理細胞 16 小時後，將 DMEM 盡量吸乾淨，換上 10%

DMEM 終止反應。

(2) 以 Doxorubicin 處理細胞

轉染的細胞培養48 小時後，以 catalase(350U/ml)處理心肌細胞 3 小 時，接著以DOX 處理細胞 6 小時，接著收集細胞。

(3) CAT assay

(3-1)細胞萃取液之製備

細胞以 PBS 洗 2 次後，加 1ml TEN 溶液，放冰上 5 分鐘，將細 胞刮下以4℃、14,000rpm、1 分鐘離心。之後以 0.25M Tris.Cl(pH7.5) 打散細胞，接著以超音波的方式打破細胞，4℃、14,000rpm、10 分 鐘離心取上清液，儘速凍在-70℃，之後移到-20℃儲存。

(3-2) 細胞萃取液反應進行之測定

取樣本加1MTris.Cl(pH7.5) 到 120µl ，繼續加 35µl H2O 、4µl 200µCi[¹⁴C]-chloramphenicol，20µl 10mM acetyl CoA， 37℃水浴 1 小 時後，每管再加入 10µl 10mM acetyl CoA繼續 37℃水浴 2 小時，最後 加入300µl ethyl acetate終止反應，震盪 1 分鐘，14,000rpm、3 分鐘離 心取上層液，之後在快速真空乾燥機中乾燥。

(3-3) Perform thin-layer chromatography

準備TLC tank ，加入190 ml chloroform, 10 ml methanol,以及What- man 3MM filter paper，以凡士林封住空隙，靜置2小時備用。將樣本

重新溶解在30µl ethyl acetate中，每次1µl點在TLC-sheet邊緣2.5cm處每

點相距1.5cm並吹乾，在有200ml 之 19:1 chloroform /methanol的TLC tank中伸展1小時，乾燥後壓片。