一、Doxorubicin 刺激心肌細胞 ET-1 的分泌
從 初 生 1-2 天 的 Wistar rat 分 離 培 養 出 來 的 心 肌 細 胞 ， 經 由 DMEM-BrdU 培養 2 天，讓心肌細胞可以回復，2 天後心肌細胞會開始 跳動，每分鐘約可跳動125 次。換上 sreum-free DMEM 培養 24 小時 後，以 DOX 1µM 處理細胞 1、3、6、12、24 小時。收集培養液，用 Endothelin-1 Biotrak Assay 測 ET-1 的量，結果發現 DOX 會引起心肌細 胞的 ET-1 分泌，在 12 小時 ET-1 的分泌量明顯比對照組多，而 24 小
時 ET-1 的分泌量雖然下降，但是仍然比對照組多。我們也觀察到以
DOX 處理 24 小時後，雖然會造成心肌細胞損傷，但是心肌細胞仍會 跳動。12 小時 DOX 處理的心肌細胞之 ET-1 分泌量是 14.7 fmol/ml，
對照組沒有測到 ET-1 分泌。24 小時 DOX 處理的心肌細胞之 ET-1 分 泌量是8.7fmol/ml，對照組是 6.9 fmol/ml。雖然對照組沒有加入 DOX，
但是在無血清的環境下，隨時間增加心肌細胞的ET-1 分泌量也會逐漸
增加 (詳見圖 1)。若是以 0.01、0.1、1、10µM 的 DOX 處理細胞 24 小 時之後，測量 ET-1 的分泌，發現 1µM、10µM 的 DOX 明顯引起心肌 細胞的ET-1 分泌，但是 0.1µM 的 DOX 會抑制 ET-1 的分泌。0.1µM、
1µM 和 10µM DOX 處理的心肌細胞之 ET-1 分泌量分別是 5.24、12.3
應的現象(詳見圖 2)。
二、Doxorubicin 會刺激非心肌細胞 ET-1 的分泌
從初生 1-2 天的Wistar rat分離培養出來的非心肌細胞，可以繼代
培養，最多可以繼代3 到 4 次，非心肌細胞會增殖，但隨著天數增加，
非心肌細胞的生長能力會逐漸下降，變的容易死亡，對trypsin的耐受 性降低，約 17 天後細胞的型態也會有所改變，約 20 天後細胞便會死
亡，因此我們選擇繼代 2 次的非心肌細胞進行實驗。取繼代 2 次的非
心肌細胞，每培養皿種 1.5x106細胞，以DMEM培養 1 天，接著換上 sreum-free DMEM 培養 24 小時後，以 DOX 1µM處理細胞 1、3、6、
12、24 小時，收集培養液，用Endothelin-1 Biotrak Assay測ET-1 的量，
結果發現處理1 小時的非心肌細胞之ET-1 分泌量是 11.2fmol/ml，對照 組是 3.9 fmol/ml。處理 3 小時的非心肌細胞之ET-1 分泌量是 17.5 fmol/ml，對照組是 3 fmol/ml。處理 6 小時的非心肌細胞之ET-1 分泌量 是 30 fmol/ml，對照組是 11.4 fmol/ml。處理 24 小時的非心肌細胞之 ET-1 分泌量是 13.7 fmol/ml，對照組是 24.5 fmol/ml (詳見圖 3)，受到 DOX刺激的非心肌細胞 6 小時內ET-1 分泌量增加 3 到 6 倍，但是 24 小時ET-1 的分泌量卻明顯降低。若是以 0.01、0.1、1、10µM的DOX處 理細胞 24 小時之後，測量ET-1 的分泌，發現 1µM 和 10µM DOX處
理的非心肌細胞之ET-1 分泌量是 15.5 和 25.3 fmol/ml，對照組是 19 fmol/ml，沒有dose-dependent的現象，以DOX處理非心肌細胞 24 小時 後，1µM DOX會抑制非心肌細胞ET-1 的分泌，但是 10µM DOX則會增 加非心肌細胞ET-1 的分泌(詳見圖 4)。
三、Doxorubicin 會刺激心肌細胞 ET-1 基因的表現
從初生 1-2 天的Wistar rat分離培養出來的心肌細胞，經由DMEM- BrdU培養 2 天後，換上sreum-free DMEM 24 小時後，以DOX 1µM處 理細胞1、3、6、12、24 小時，收集細胞後，加入RLT solution(這樣細 胞可保存在-70℃一個月)，接著打散細胞，將細胞通過直徑 0.9mm 的 針頭5 次以打破細胞，接著以RNeasy Product Mini Kit取得total RNA。
得到的RNA測吸光值，A260/A280比值≧2。將這些total RNA做RT-PCR，
結果發現DOX處理的心肌細胞之ET-1 在 1 小時就有表現，而在 3 小時
則有高量的表現，之後就顯著減少，但在 24 小時的處理，心肌細胞死
亡 很 多(細胞數≦5 x 106 )，所以無法得到足量的total RNA進行 RT-PCR。對照組的心肌細胞在無血清的環境下，隨時間增加ET-1 的表 現也會逐漸增加(詳見圖 6)。我們還發現DOX刺激心肌細胞ET-1 基因 的表現到ET-1 分泌中間有一段時間延遲(詳見圖 9 )。
四、Doxorubicin 會短暫抑制非心肌細胞 ET-1 基因的表現
從初生 1-2 天的Wistar rat分離培養出來的非心肌細胞，經由DMEM 培養2 代後，每培養皿種 1.5x106細胞，換上sreum-free DMEM 24 小時 後，以DOX 1µM處理細胞 1、3、6、12、24 小時，收集細胞後，加入 RLT solution(這樣細胞可保存在-70℃一個月)，接著打散細胞，將細胞 通過直徑 0.9mm 的針頭 5 次以打破細胞，接著以RNeasy Product Mini Kit取得total RNA。得到的RNA測吸光值，A260/A280比值≧2。將這些total RNA做RT-PCR，結果發現DOX處理的非心肌細胞之ET-1 在 1~3 小時 間的表現受抑制，之後就恢復與對照組相同。對照組的非心肌細胞之 ET-1 則在平時就有穩定表現(詳見圖 7)。在處理DOX 24、27、30、36、
48 小時的非心肌細胞中，ET-1 的轉錄和對照組並無差異(詳見圖 8)。
五、受 DOX 刺激使得心肌細胞中 ROS 的量增加
DOX處理會使心肌細胞中的ROS量增加。從初生1-2天的Wistar rat 分離培養出來的心肌細胞，經由DMEM-BrdU培養2天後，心肌細胞開始
跳動，換上sreum-free DMEM 培養24小時後，以DOX 1µM處理細胞，1、
3、6、12、24小時，收集細胞。離心去掉上清液後，以1X PBS重新懸浮 細胞，加入nonpolar 2’,7’-DCFH-DA (nonpolar 2’,7’- dichloro- fluorescein diacetate)，避光下，在37℃震盪反應30分鐘，離心去掉上清液，沉澱的
細胞重新以1XPBS懸浮，計算細胞數目以及測525/475nm螢光光譜，DOX 處理心肌細胞 1, 3, 6, 12, 24小時後，與對照組相比，ROS增加132%、
152%、135%、137%、121%(詳見圖11)。但是非心肌細胞以DOX處理1, 3, 6, 12, 24小時後，與對照組相比，ROS並無差異。
六、ROS 參與心肌細胞轉錄的活化
心肌細胞轉染-1.7kCAT plasmid、pBLCAT2 plasmid 及 pBLCAT3 Plasmid，轉染的細胞培養48小時後，以catalase 350U/ml先處理3小時，
再以DOX處理6小時，接著收集細胞。 取樣本加入[14C]-chloramphenicol 和 acetyl CoA作用，之後加入ethyl acetate終止反應，最後進行TLC。
經由X光底片壓片後的結果發現，DOX會活化心肌細胞的ET-1 promotor，且這個作用會受到catalase的抑制，顯示這個活化是經由 ROS相關的訊息傳遞途徑所調控。