白色念珠菌 (C. albicans) 是臨床上最常造成人體感染且為致死率最 高的真菌 (Hsueh et al., 2002)。70%的健康人體上有白色念珠菌的存在,
通常存在於人體的黏膜或皮膚組織,例如:表面皮膚、陰道、腸胃道以及 口腔內黏膜組織等等 (Ruhnke and Maschmeyer, 2002)。在正常情況下,
白色念珠菌存在的量不多,在免疫系統正常運作的清況下,可與人體中其 他正常菌叢保持平衡,使人體不受白色念珠菌的侵害。但是白色念珠菌亦 是一種造成伺機性感染最常見的真菌,當人體免疫力下降、真菌菌量數目 增加或受藥物副作用的影響,導致體內菌叢生態改變,原本位於人體黏膜 或皮膚上的白色念珠菌便會轉為致病菌攻擊宿主,甚至引發全身性菌血症 (Candidema) (Calderone and Fonzi, 2001)。目前白色念珠菌為院內真菌 血液感染第一名,其死亡率高達 40% (Chen et al., 1997; Wenzel and Gennings, 2005)。因此早期對白色念珠菌的研究大多針對其抗藥性 (Albertson et al., 1996; Chen et al., 2003; Hitchcock et al., 1987)。
目 前 為 止 , 白 色 念 珠 菌 被 認 為 是 絕 對 二 倍 體 (obligate diploid) (Graser et al., 1996; Pujol et al., 1993; Taylor et al., 1999),只具有擬有性 世代 (parasexual cycle) (Bennett and Johnson, 2003; Johnson, 2003)。
由於其有性世代和單倍體尚未被發現,因此造成研究上的困難。若要進行 基因方面的研究,往往需要藉由 double knockout 的實驗技術來達成 (Ramage et al., 2002),也無法藉由孟德爾定律 (Mendelian Segregation
1999),由一對對偶基因 MTLa 和 MTLα 所組成。在自然的環境下,大於 99%的白色念珠菌是異型合子 (heterozygote) 的 a/α cell (a/α) (Anderson and Soll, 1987; Slutsky et al., 1987),必需經由同型合子化 (homozygosis) 的過程,形成同型合子 (homozygote) 的 a cell (a/a) 或 α cell (α/α),並 轉換成opaque phase,才能進行交配作用 (Lockhart et al., 2005)。藉由 二倍體間的交配,形成四倍體的 a/α cell (a/a/α/α),最後再轉變回二倍體 細胞。轉變的原因目前仍不明確,可能為染色體喪失 (chromosome loss) 或是減數分裂 (meiosis) 所造成,此現象稱為白色念珠菌的擬有性世代 (parasexual cycle) (Johnson, 2003)。
然而,於 2007 年歐聰億發現白色念珠菌在 Azole 類藥物刺激下,
會造成白色念珠菌的抑制圈內高頻率的發生 white-opaque switching,較 先前研究中所發現的轉換機率高出許多。大量homozygote 的產生,暗示 著白色念珠菌可能在此藥物壓力下進行減數分裂 (歐聰億, 2007)。
性別分離的單倍體和有性器官是證明白色念珠菌能經由減數分裂完 成有性世代的最直接證據。於是在 2008 年,鄭瑋寧將 Fluconazole 和 Terbinafine 藥物處理後之抑制圈內的 opaque 菌落挑出,經過塗盤篩選 後,藉由PCR 分析其基因型,結果發現只有 10%的機率可以挑選到同型 合子的菌株,即表示所挑選到的仍是混合的菌株 (鄭瑋寧, 2008)。
蘇慶華老師不斷的藉由顯微操作器挑選菌株,結果在 Fluconazole 藥物處理24~48 小時後的 SC5314 中,挑選出形態為 hyphae tip cell 的菌 株SC5314-4A、SC5314-4F 和 SC5314-GB2,藉由鄭瑋寧、張芳陌由 PCR 分析後發現其基因型分別為 a1、a1 和 α1α2;受 Terbinafine 藥物處理數 天後的SC5314 中,挑選出形態為 swollen cell 的菌株 SC5314-SW08,
基因型為 a1;在 Fluconazole 藥物處理 24~48 小時後的 SC5314 中,挑
選出形態為long cell 的菌株 SC5314-LN07,其基因型為 α1α2。以這些同 究上可以此方式來判定麵包酵母菌的倍數體 (Olaiya and Sogin, 1979)。
隨機以a type 的菌株 SW08 和 4F 以及 α type 的 GB2 進行營養要求菌株 之篩選,結果發現所有的菌株均對histidine 具有營養要求性,似乎以 UV 照射容易造成histidine 的生合成途徑受到抑制。因為所有營養要求菌株均 對同一種營養素具有營養要求性,因此無法進行之後的交配實驗。
經由減數分裂完成有性世代最直接的證據就是找到其有性器官。而 酵母菌分類中,可分成子囊菌或擔子菌。白色念珠菌與麵包酵母菌同屬於 酵母菌 (yeast),多項基因學的研究也認為白色念珠菌與麵包酵母菌具有 同源性 (Boone et al., 1991; Colthurst et al., 1992; Diener and Fink, 1996;
Goldberg et al., 1993; Hull and Johnson, 1999; Klig et al., 1991; Sadhu et al., 1992)。而麵包酵母菌屬於子囊菌,其會產生子囊 (ascus),並於其 中進行減數分裂產生子囊孢子 (ascospore),並將孢子包裹於其中。而在 歐聰億的研究中,也曾在PDA/PB 培養基中觀察到如豆莢型之類未成熟子 囊形態之細胞,但其於培養後並無進一步的發展 (歐聰億, 2007)。然而,
養,結果發現母細胞無法生長,但子細胞都可順利生長。藉由鄭瑋寧以PCR Fluconazole 會抑制麥角固醇 (Ergosterol) 生合成中 Cytochrome P450 系統的酵素14α-demethylase,使得 Ergosterol 的合成受到抑制。因此在 培養基中加入 Ergosterol,觀察是否能使在 Fluconazole 藥物壓力下所產 生的 Peapod 能存活、發芽。Fluconazole 藥物壓力下之 YEPD/PB 與 YEPD/PB/ Ergosterol 所造成 Peapod 的巨觀菌落形態或藉由光學顯微鏡 觀察之微觀菌落形態均可發現Peapod 菌落的生長速率較一般菌落形態來 Fluconazole 壓力下加有 Ergosterol 的培養基中,發現具有多核的 Peapod 存在,但螢光的強度卻較一般普遍常見的酵母菌型弱很多。因此以50 ng/ml DAPI 觀察不同濃度的 Ergosterol 對 Peapod 影響,結果發現,在
Fluconazole 的壓力下,無論 Ergosterol 濃度的高低,只要培養基中含有 Ergosterol,便可尋找到 Peapod 的蹤跡,多核的現象也一再的發現,且 螢光的強度也明顯提升許多。在 Fluconazole 藥物處理下,Peapod 螢光 強度較弱,推測原因可能是Fluconazole 造成白色念珠菌細胞壁的形態、
成分和密度改變所造成的結果 (Herrera-Arellano et al., 2007)。
雖然在 Fluconazole 壓力下加有 Ergosterol 的培養基中,於 18 小時 內便可發現具有多核的Peapod 存在,但以顯微操作器挑出 300 個以上的 Peapod 進 行 培 養 , 仍 然 不 見 其 存 活 、 發 芽 的 現 象 。 然 而 , 的 確在 Fluconazole 壓力所造成的抑制圈中分離生長形態不同的菌株,依形態的 不同可分為圓胖的 fat cell、較長的 long cell 與具有許多長型菌絲的 mycelium (hypha tip) cell,且也發現其帶有的交配基因型包括 a1、α1α2、
a1α1 和 a1α2 四種情況 (歐聰億, 2007; 鄭瑋寧, 2008)。這些細胞經由本 實驗室廖家瑜以流式細胞儀分析得到單倍體圖形,但其是否真為單倍體或 其是否經由減數分裂後由Peapod 釋出,則仍需更進一步的探討。
Fluconazole 抑制麥角固醇 (Ergosterol) 的生合成,間接造成羊毛脂 固醇 (Lanosterol) 和鮫鯊烯 (Squalene) 的累積。因此在 C. albicans 於 含有0.1% Squalene (以等量 Tween 80 分散均勻) 的 PDA/PB 中培養,
觀察是否能有Peapod 的形成。結果發現在培養 18 小時內 (第 1 天) 細胞 仍然呈現普遍常見的橢圓球狀結構,但卻有雙核的存在,而在很少的機會 下可以發現到Peapod 的蹤跡。然而,第 2 天,細胞形態開始出現變化,
核的現象。而其中的顆粒狀結構漸漸的形成包覆結構。第 21 天時發現了 膨大的類子囊Peapod,有一端較大的 head cell 和一端較小的 tail cell,
其中包裹著2~16 個為數不等的橢圓球狀的類子囊孢子細胞。第 28 天時發
在Fluconazole 藥物壓力下,含有 Ergosterol 的培養基可以找到具有 多核的Peapod,但其卻未能再繼續發展成成熟的 Peapod,可能是因為部 份 Ergosterol 轉換成 Squalene,促使 Peapod 形成,但在 Fluconazole 的環境下,受到藥物的抑制,而使得Peapod 無法成熟。
所有形態的證據足以判定 Peapod 極有可能為白色念珠菌的有性器 官—子囊 (ascus),而膨大的 Peapod 中包裹的為數不等的橢圓球狀細胞 則可能為子囊孢子 (ascospore),但仍需藉由其他遺傳學與分子生物學的 證據佐證。