3-2.1 光學顯微鏡觀察 Fluconazole 壓力下白色念珠菌之細胞形態 1. 首先進行抗生素感受性試驗 (Antibiotic susceptibility test)。將培養於 PDA 之白色念珠菌標準菌株 SC5314 取出，用接種環接於無菌水中，
震盪均勻。
2. 以血球計數器計數，並以連續稀釋法，將菌液濃度調整至 10
5
~107
cells/ml。3. 以微量吸管吸取 0.1 ml 之菌液，滴在 YEPD/PB 培養基上。將三角玻 棒先置於95%酒精中，取出過火，使酒精燃盡，稍待片刻待玻棒冷卻 後，右手持玻棒混勻菌液，左手則旋轉培養基，將菌液均勻分布。
4. 在室溫放置 5~10 分鐘後，等待水氣消失後，用鑷子將 Fluconazole 藥物紙錠 (濃度 200 μg/ml, 35μl)，擺放置培養基中，在室溫下培養 2~3 天。
5. 以光學顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外的細胞形態。
3-2.2 觀察 Fluconazole 壓力下 Ergosterol 對白色念珠菌巨觀形態 之影響
3-2.2.1 解剖顯微鏡觀察菌落形態
1. 首先進行抗生素感受性試驗。將培養於 PDA 之白色念珠菌標準菌株 SC5314 取出，用接種環接於無菌水中，震盪均勻。
2. 以血球計數器計數，並以連續稀釋法，將菌液濃度調整至 10
5
~107
cells/ml。3. 以微量吸管吸取 0.1 ml 之菌液，滴在 YEPD/PB/0.2% Ergosterol 或 YEPD/PB 培養基上。將三角玻棒先置於 95%酒精中，取出過火，使 酒精燃盡，稍待片刻待玻棒冷卻後，右手持玻棒混勻菌液，左手則旋 轉培養基，將菌液均勻分布。
4. 在室溫放置 5~10 分鐘後，等待水氣消失後，用鑷子將 Fluconazole 藥物紙錠 (濃度 200 μg/ml, 35μl) ，擺放置培養基中，在室溫下培養 3~4 天。
5. 將結果分成 P1、P2、P3 和 Control 四區，以解剖顯微鏡觀察菌落形 態。
3-2.2.2 觀察特殊菌落形態之相關性
1. 將 在 有 Fluconazole 壓 力 下 ， 於 YEPD/PB 和 YEPD/PB/Ergosterol (0.1%和0.2%) 培養的白色念珠菌分為P1、P2、P3和Control四區。
2. 在解剖顯微鏡下，挑取各區菌落置於 1 ml 無菌水中。以血球計數器計 數，並以連續稀釋法，將菌液濃度調整至10
4
cells/ml。3. 以微量吸管吸取 0.1 ml 之菌液，滴在 YEPD/PB 培養基上。將三角玻 棒先置於95%酒精中，取出過火，使酒精燃盡，稍待片刻待玻棒冷卻 後，右手持玻棒混勻菌液，左手則旋轉培養基，將菌液均勻分布。
4. 於室溫培養 3~4 天後，觀察菌落形態，並計數求其比例。隔週觀察，
為期4 週。
3-2.3 觀察Fluconazole壓力下Ergosterol對白色念珠菌抑制圈內 與抑制圈外之影響
1. 準備長方形載玻片，在載玻片上面以Blocking marker筆畫一個約一元 硬幣大小的圓。再於圓中滴入約100μl的無菌水。
2. 在解剖顯微鏡下觀察，利用接種針挑取YEPD/PB和YEPD/PB/0.2%
Ergosterol抑制圈內、外的菌，將針上的白色念珠菌輕輕的放到已加 100μl的無菌水的玻片上，以劃圓圈的方式使菌可以均勻分布在 Blocking圈中，而且要注意濃度不可以太稀或是太濃。
3. 等約30~40分鐘待載玻片上面的菌液變乾。
4. 待菌液乾後，加入150μl的4% Formaldehyde再靜置15~20分鐘。
5. 將靜置後的玻片，以PBS清洗3次，再利用拭鏡紙將Blocking圈以外之 的水漬擦乾淨。
6. 將擦乾後的玻片平放入已經鋪好濕紙巾的微波盒中。在Blocking圈中 加入150μl的Blocking Buffer (Blocking Buffer內利用PBS為溶劑再加 入含有3% BSA、0.2% Triton-X100、0.1% Tween 80)，再將微波盒 用保鮮膜包住後放入4
o
C冰箱中overnight。7. 第二天將冰箱中的玻片拿出來，以PBS清洗3次，再利用拭鏡紙將 Blocking圈以外之的水漬擦乾淨。
8. 在避光的情況下，將擦乾後的玻片加入5 ng/ml的DAPI (溶劑為PBS) 約150μl，靜置30~40分鐘。
9. 將靜置後的玻片，以PBS清洗3次，再利用拭鏡紙將Blocking圈以外之
3-2.4 觀察Fluconazole壓力下不同濃度Ergosterol對白色念珠菌 抑制圈內與抑制圈外的影響
3-2.4.1 光學顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外之菌落形態
1. 於YEPD/PB和YEPD/PB/Ergosterol (0.05%、0.1%、0.15%和0.2%) 的培養基上進行抗生素敏感性試驗 (受Fluconazole藥物處理)，於室溫 下培養。
2. 在18小時內 (第1天) 與第2和7天以光學顯微鏡 (10×10) 觀察抑制圈 內和抑制圈外的菌落形態。
3-2.4.2 光學顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外之細胞形態
1. 於YEPD/PB和YEPD/PB/Ergosterol (0.05%、0.1%、0.15%和0.2%) 的培養基上進行抗生素敏感性試驗 (受Fluconazole藥物處理)，於室溫 下培養。
2. 在18小時內 (第1天)，於解剖顯微鏡下，挑取抑制圈內與抑制圈外的 白色念珠菌，於滴有無菌水的載玻片上塗開。
3. 以光學顯微鏡 (10×10) 觀察抑制圈內和抑制圈外的細胞形態。
3-2.4.3 共軛焦顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外之細胞形態
1. 於YEPD/PB和YEPD/PB/Ergosterol (0.05%、0.1%、0.15%和0.2%) 的培養基上進行抗生素敏感性試驗 (受Fluconazole藥物處理)，於室溫 下培養。
2. 在18小時內與第7、14、21和28天，以共軛焦顯微鏡觀察 (50 ng/ml DAPI染色) 抑制圈內與抑制圈外的細胞形態。
3-2.5 觀察Fluconazole壓力下Squalene對白色念珠菌抑制圈內與 抑制圈外之影響
3-2.5.1 光學顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外之細胞形態
1. 將SC5314於Fluconazole壓力下的PDA/PB/0.1% Squalene的培養基 中於室溫下培養。
2. 在第1、2、7、14、21和28天，於解剖顯微鏡下，挑取抑制圈內與抑 制圈外的白色念珠菌，於滴有無菌水的載玻片上塗開。
3. 以光學顯微鏡 (10×10) 觀察抑制圈內和抑制圈外的細胞形態。
3-2.5.2 共軛焦顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外之細胞形態
1. 將SC5314於Fluconazole壓力下的PDA/PB/0.1% Squalene的培養基 中於室溫下培養。
2. 在第1、2、7、14、21和28天，以共軛焦顯微鏡觀察 (50 ng/ml DAPI 染色) 抑制圈內與抑制圈外的細胞形態。
3-2.5.3 掃描式電子顯微鏡觀察抑制圈內與抑制圈外之細胞形態 1. 前處理：準備直徑1公分的圓形載玻片及12 Well的Plate，在12 Well
的Plate上面註明培養天數。直徑1公分的圓形載玻片需先經過0.1%
Tween 80溶液的浸泡，在超音波震盪機上震盪30分鐘後，用70%的酒 精清洗，再以拭鏡紙將圓形載玻片上面的水漬擦乾。在圓形載玻片上 面滴入約20μl的ddH
2
O。2. 將SC5314於Fluconazole壓力下的PDA/PB/0.1% Squalene的培養基 中培養，於第1、2、7、14、21和28天利用無菌的細針取菌，將細針 上的菌輕放入已加入20μl的ddH
2
O的玻片上，以劃圓的方式使菌均勻 分散於玻片，而且要注意濃度不可以太稀或是太濃。3. 待30~40分鐘載玻片上的菌液變乾。
4. 將圓形玻片置入12 Well的Plate，加入1 ml的Glutaldehyde，靜置30分 鐘。
5. 將靜置過後12 Well Plate中的Glutaldehyde倒掉，以ddH
2
O清洗3次，每次5分鐘。
6. 加入1 ml OsO
4
到12 Well的Plate中，靜置30分鐘。7. 將靜置過後12 Well Plate中的OsO
4
倒掉，以ddH2
O清洗3次，每次5 分鐘。8. 清洗完之後進行脫水的步驟，以35%、45%、60%、75%、80%、95%、
100%酒精，分別各5分鐘逐次以不同濃度酒精置換。
9. 待100%酒精脫水完，即將酒精倒掉，讓圓形玻片上面的酒精自然揮 發，即可送至電子顯微鏡室進行coating。
10. 以掃描式電子顯微鏡觀察。