第三章 儀器、藥品與實驗方法
3-1 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (CE-LIF)
圖 3-1 為自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀裝置圖，螢光由 slit 進入單光器再由光倍電增管 (PMT) 偵測。本研究以藍光雷射做為 誘導螢光的光源，選用內徑為 50 m 的石英熔融矽毛細管柱分離待測物。
當毛細管內注滿緩衝溶液後，以虹吸進樣的方式注入待測樣品，接著施 加高壓電進行電泳分離。
實驗中所使用的光源為 100 mW，波長為 473 nm 的藍光雷射，利用 光學顯微鏡的聚焦鏡聚光，聚焦於毛細管上作為誘導螢光的光源。在與 入射光約 90 度角的位置上架設一個倍率為 20 倍的光學顯微鏡接物鏡，
用以收集產生的螢光，接著放置一片橘黃色的濾光片，主要目的是用來 消除雷射聚焦於毛細管所產生的散射光。再由聚焦鏡聚光，經由單光器 (Omni-λ1509) 分光後，藉由光電倍增管 (PMT) 放大產生電位差，再 經過訊號轉換器 (ADC-9724) 轉換，連接至電腦搭配 SCSI 32 程式讀取 實驗數據。
第三章 儀器、藥品與實驗方法
圖 3-1 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (以光電倍增管偵測衍生物螢光)
第三章 儀器、藥品與實驗方法
3-2 儀器及周邊設備列表
毛細管螢光電泳相關儀器
名稱 製造廠商 型號 示意圖及規格
diode laser
BIO-ACCORD SCIENTIFIC &
INSTRUMEN T CO.
Class III laser output power <100 mW wavelength 460-490 nm
monochromator Zolix Omni-λ1509
resolution 0.4 nm dispersion 5.4 nm/mm
光電倍增管(PMT) Hamamatsu R928
PMT 電源供應器 THORN EMI Power supply Type PM28B 電泳儀高壓電源 focal length 8.5 mm
三向微動平台 Thorlabs, Ltd, UK 25 mm Travel
第三章 儀器、藥品與實驗方法
post and holder Onset Electro-optics
EP01N EP02N EP03N
base and holder Onset Electro-optics
ESB03S ESB01 ESB02S 高通濾光片
(橘黃色) --- --- size : 4 x 4 x 0.3 cm wavelength pass : 520 nm
毛細管 J&W Scientific, California
160-2644 (2650) Undeact Fused
Silica .075
I.D. 75 µm
類比/數位
轉換器 訊華 ADC-9724 supply power 110 V
output signal ±10 V
資料處理系統 訊華 SCSI 32 ---
第三章 儀器、藥品與實驗方法
speed:6000 rpm/min 1.5 mL
過濾器 Basic Life PL-6054541 13 mm syringe filter with 0.45 µm nylon membrance 紫外光可見光
第三章 儀器、藥品與實驗方法 (Alfa Aesar)
N-(2-aminoethyl)
piperazineC6H15N3
(Alfa Aesar)
催
2,2’ - dipyridyl disulfide (DPDS)
第三章 儀器、藥品與實驗方法
monosodium phosphate NaH2PO4 (Sigma)
disodium phosphate Na2HPO4 (Sigma)
sodium hydroxide NaOH (J. T. Baker)
silica gel (Sigma)
第三章 儀器、藥品與實驗方法
3-4 衍生試劑 NBD-PZ-NH
2合成及純化
本研究使用的衍生試劑是由 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) 和 N-(2-aminoethyl)piperazine 在鹼性下反應合成。
藥品劑量和添加過程：
秤取 400 mg N-(2-aminoethyl)piperazine 並以 10 mL 乙腈 (ACN) 溶 解，再加入 60 mg 碳酸鈉和 3 mL 去離子水，以磁石均勻攪拌之。另一 原料溶液是秤取 100 mg NBD-Cl 溶於 5 mL ACN，待溶解後，將 NBD-Cl 溶液緩慢滴加至 N-(2-aminoethyl)piperazine 溶液，滴加的過程中可觀察 到顏色變化，滴加完後以鋁箔紙包住樣品瓶，並以水浴加熱 (50 ℃ ~ 60
℃) 6 小時，反應結束後將溶液移至圓底燒瓶進行減壓濃縮，濃縮後的油 狀物即為粗產物。
矽膠管柱製備與粗產物分離：
秤取適量的矽膠至管柱約八分滿，以加壓幫浦幫助沖提液 (V 甲醇 : V二氯甲烷 = 1:10) 潤洗，待沖提液面與矽膠等高將粗產物裝載上去，樣品 滲透至矽膠後再加入沖提液即開始進行粗產物分離。最先沖提出黃色區 帶是起始物 NBD-Cl，待此區帶的溶液沖提完畢後，更換成另一比例沖 提液 (V甲醇 : V二氯甲烷 = 1:3)，接著收集深褐色區帶產物 NBD-PZ-NH2， 將收集到的溶液進行減壓濃縮，濃縮快結束時會發現油狀物產生，流動 性較大的油狀物可能是起始物 N-(2-aminoethyl)piperazine，濃縮至剩下 深褐色油狀固體 (衍生試劑) 即可。
第三章 儀器、藥品與實驗方法
3-5 NBD-PZ-NH
2衍生物製備
衍生步驟是取 50 µL 溶於去離子水中的分析物溶液 (乳酸和 3-羥丁 酸濃度各為 2 mg/L)，加入 100 µL 的催化劑，催化劑溶液為 50 µL 150 mM triphenylphosphine (TPP) 和 50 µL 150 mM 2,2’-dipyridyl disulfide (DPDS) 的混合溶液，催化劑皆溶於 ACN，將分析物與催化劑混合均勻之後，再 加入 50 µL 2 mM 的 NBD-PZ-NH2溶於 ACN 中的衍生試劑，在室溫下之 暗處靜置 3 小時衍生或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，待衍生 完成後，以 buffer 稀釋至 500 µL 最後得到乳酸和 3-羥丁酸衍生物濃度 各為 0.2 mg/L。buffer 是由 30 mM NaH2PO4和 30 mM Na2HPO4以 H3PO4
調整 pH 值等於 2。
50 µL 分析物溶液
100 µL 催化劑 (150 mM TPP/DPDS)
50 µL 2 mM NBD-PZ-NH2
靜置 3 小時或是微波 3 分鐘衍生
以 buffer 稀釋至 500 µL
第三章 儀器、藥品與實驗方法
3-6 唾液、尿液真實樣品前處理
毛細管電泳雷射誘導螢光法真實樣品處理步驟：取 1000 µL 唾 (尿) 液至離心管中，以高速離心機離心 5 分鐘，取上層清澈唾 (尿) 液 700 µL 和 700 µL ACN 混合震盪 5 分鐘，待蛋白質析出後再以高速離心機離心 5 分鐘，取上層澄清液並移至另一個離心管，以減壓濃縮裝置將有機溶 劑抽掉，以上是唾 (尿) 液去蛋白的過程。
取去蛋白的唾 (尿) 液 25 µL 以去離子水稀釋至 1000 µL，此時唾 (尿) 液濃度為原來的 0.025 倍，取稀釋後的唾(尿)液 50 µL，再循著標準 品的衍生步驟，加入 100 µL 催化劑 (TPP/DPDS)，最後再加入 50 µL 2 mM 的 NBD-PZ-NH2溶於 ACN 中的衍生試劑，在室溫下之暗處靜置 3 小時衍生或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，待衍生完成後，以 緩衝液稀釋至 500 µL 即配製成唾 (尿) 液稀釋 400 倍的樣品。
模擬乳酸中毒、尿酮體患者尿液的配置方式，取去蛋的唾 (尿)液 25 µL 加入 300 µL 10 mg/L 乳酸、3-羥丁酸標準品再以去離子水稀至 1000 µL，此時樣品為唾 (尿) 液稀釋 40 倍含 3 mg/L 標準品，經過衍生 後的樣品為唾 (尿) 液稀釋 400 倍含 0.3 mg/L 標準品。