毛細管電泳/藍光雷射誘導螢光偵測法對尿液中乳酸及3-羥丁酸之分析研究

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(1)國立台灣師範大學化學系碩士論文. 指導教授：林震煌博士 (Cheng-Huang Lin). 毛細管電泳/藍光雷射誘導螢光偵測法對尿液中乳酸及 3-羥丁酸之分析研究. Determination of lactate and 3-hydroxybutyrate in Urine by Capillary Electrophoresis-Blue Laser Induced Fluorescence Detection. 研究生：洪榮華 (Rong-Hua Hong) 中華民國一百零二年六月.

(2) 謝誌時光即逝，兩年的研究生涯就要在此畫下句點了，這段時間受到很多人的幫助與鼓勵，如今希望能和你們分享這份喜悅。首先要感謝我的指導教授–林震煌博士的悉心教導與栽培，給予我許多實驗上的指導與建議，並且提供良好的研究環境，使得本論文順利完成。感謝口試委員呂家榮教授及丁望賢教授在百忙之中抽空參與口試審查，並給予指正與建議，使得本論文更加完善。一路走來，很感謝實驗室各位學長姐在實驗上的幫助，特別感謝怡珊、建宏、李珣、冠甫、智勝，你們總是提供了我很多做實驗的方法與方向，感謝同屆的建霖、小安、亞薇、卉馨在實驗上相互討論和幫助，並適時給予支持與鼓勵，很開心可以一起畢業了。另外也很感謝實驗室的學弟范范、昕楷為實驗室帶來不少輕鬆氣氛，希望這個好氣氛可以一直延續下去，也祝福你們實驗順利。最後，感謝最摯愛的父母在求學路上的支持關懷以及多年的照顧及教誨，尤其謝謝大姊琳茜常給予鼓勵並不時分享生活趣事，因為家人無私的奉獻和支持，我才能安心地專注於實驗。在此我僅以此論文獻給所有我感謝的人以及幫助過我的朋友。. 洪榮華一零二年六月四日.

(3) 摘要乳酸和 3-羥丁酸為體內正常有機代謝產物，但是當肝臟疾病或體內脂肪氧化代謝異常時，血液中乳酸和 3-羥丁酸就會過度累積，而發生乳酸性中毒和酮酸中毒的現象。由於乳酸和 3-羥丁酸僅有極低的紫外光吸收性質，且不容易以電噴灑質譜法進行偵測，而傳統酵素測定法偵測乳酸和 3-羥丁酸則容易受到內生性物質的干擾而影響準確性。本研究以毛細管電泳/藍光雷射誘導螢光偵測法，偵測尿液中的乳酸濃度以作為臨床診斷酮酸中毒的參考數據。目前市面上沒有適合的螢光衍生試劑，因此本實驗合成 4-N-(4-N-aminoethyl)piperazino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole 作為乳酸和 3-羥丁酸的螢光衍生試劑。衍生過程需要使用催化劑 TPP (triphenylphosphine) 和 DPDS (2,2’-dipyridyl disulfide) 來幫助反應進行。若利用微波輔助衍生，可將衍生反應時間縮短為 3 分鐘。衍生物結構在低 pH 值環境下會進行質子化並放出螢光，對於分離乳酸和 3-羥丁酸的衍生物而言，利用 pH 值小於 3 的磷酸緩衝液且不需添加有機修飾劑、界面活性劑即可完全分離。當以藍光雷射為螢光激發光源時，最佳偵測條件下，偵測極限約為 10 g/L。由於雷射誘導螢光檢驗法的靈敏度高，因此不需要利用線上濃縮技術。本研究選擇的真實樣品為尿液和唾液，其前處理經過去蛋白和稀釋即可進行衍生。檢測結果發現，正常人尿液中的乳酸濃度約為 39 ± 11 mg/L。藉由運動的方式增加醣類代謝和脂肪氧化速度，則尿液中代謝的乳酸濃度增加為 231 ± 121 mg/L。進食前唾液樣品中乳酸濃度約為 49 ± 16 mg/L，進食後唾液樣品中由於葡萄糖濃度上升增加轉醣酵素的代謝速率，代謝物乳酸濃度上升至 192 ± 48 mg/L。本研究提供簡單、快速的分析技術並成功的應用在真實樣品的檢測。. 關鍵字：毛細管電泳、螢光、乳酸、3-羥丁酸. I.

(4) Abstract Lactic acid and 3-hydroxybutyric acid are metabolites in organism. Unusual -oxidation of fatty acid and metabolism in liver will result in excessive accumulation which lead to lactic acidosis and ketoacidosis in blood eventually of those acids. Lactic acid and 3-hydroxybutyric acid are ill-suited for UV and mass detection due to their poor absorbance and low selectivity. The novel indirect UV detection for those acids is a rapid and simple determination but the enzyme exhibits a slight cross-reactivity to the endogenous compounds which could affect the accuracy and reproducibility for the determination of those acids. This study synthesized 4-N-(4-N-amino -ethyl)piperazino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole as the derivative reagent which reacted with acid in the presence of triphenylphosphine (TPP) and 2,2’-dipyridyl disulfide (DPDS) at room temperature within 3 hours or by microwave derivation within 3 minutes. The derivatives which were strongly fluoresced and were positively charged at pH below 3 were separated by using phosphate buffer without organic solvent or surfactant. The limit of determination were about 10 g/L by using blue laser as the light source under optimized condition. Since the sensitivity was enough for real sample detection, there is no need to use on-line concentration. This study choose urine and saliva as real sample, of which the pretreatment were only removing protein and then diluting before derivation. The concentration of lactic acid in urine was about 39 ± 11 mg/L. The concentration rose to 231 ± 121 mg/L because of the acceleration in glycolysis after exercise. On the other hand, the concentration of lactic acid in saliva was about 49 ± 16 mg/L. The concentration rose to 192 ± 48 mg/L due to the high abundance of glucose that result in accelerating the velocity that streptococcus mutans metabolized glucose after taking food. This study provided simple and fast technique which applied to the detection of real sample.. keywords: capillary electrophoresis, fluorescence, lactic acid, 3-hydroxybutyric acid II.

(5) 目錄摘要 .................................................................................................................. I Abstract .......................................................................................................... II 目錄 ........................................................................................................ III 圖目錄 ..................................................................................................... V 表目錄 .................................................................................................. VII 第一章緒論 ................................................................................................. 1 1-1 酮體簡介 ............................................................................................ 1 1-1-1 酮體生成 (ketogenesis) 與代謝 ............................................ 1 1-1-2 酮體測定 ................................................................................. 3 1-1-3 酮體測定的臨床意義 ............................................................. 4 1-2 乳酸與科氏循環 (Cori cycle) .......................................................... 5 1-2-1 乳酸生成與代謝 ..................................................................... 5 1-2-2 乳酸測定 ................................................................................. 7 1-2-3 乳酸測定的臨床意義 ............................................................. 8 1-3 分析物簡介 ........................................................................................ 9 1-4 研究目的 .......................................................................................... 10 第二章分析方法與原理 ........................................................................... 13 2-1 毛細管電泳法之發展...................................................................... 13 2-2 毛細管電泳法之基本原理.............................................................. 14 2-2-1 電泳分離與遷移率 ............................................................... 14 2-2-2 電滲流 (EOF) ....................................................................... 15 III.

(6) 2-3 毛細管電泳層析法之分離模式...................................................... 18 2-3-1 毛細管區帶電泳 (CZE) ....................................................... 19 2-3-2 微胞電動層析法 (MEKC) ................................................... 20 2-4 毛細管電泳線上濃縮技術.............................................................. 21 2-4-1 毛細管電泳線上堆積法 (stacking) ..................................... 21 2-4-2 毛細管電泳線上掃集法 (sweeping) ................................... 22 第三章儀器、藥品與實驗方法 ............................................................... 23 3-1 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (CE-LIF) ................... 23 3-2 儀器及周邊設備列表...................................................................... 25 3-3 藥品列表 .......................................................................................... 28 3-4 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 合成及純化 ............................................. 30 3-5 NBD-PZ-NH2 衍生物製備 .............................................................. 31 3-6 唾液、尿液真實樣品前處理.......................................................... 32 第四章結果與討論 ................................................................................... 33 4-1 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 合成 ......................................................... 33 4-2 乳酸和 3 -羥丁酸衍生反應之探討 ................................................ 38 4-3 衍生物光譜性質測量...................................................................... 41 4-4 衍生反應條件及電泳條件確立...................................................... 44 4-5 真實樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定 .............................................. 59 第五章結論 ............................................................................................... 68 學會發表 ....................................................................................................... 69 參考文獻 ....................................................................................................... 70. IV.

(7) 圖目錄第一章緒論圖 1-1 酮體生成與代謝反應式 ..................................................................... 2 圖 1-2 科氏循環 (Cori cycle) ........................................................................ 6. 第二章分析方法與原理圖 2-1 毛細管壁帶電荷形成電雙層及 Zeta 電位示意圖 .......................... 16 圖 2-2 電滲流的形成與流動 ....................................................................... 17 圖 2-3 CZE 分離模式下不同粒子遷移之示意圖 ....................................... 19 圖 2-4 MEKC 分離模式示意圖 ................................................................... 20 圖 2-6 掃集 (sweeping) 濃縮機制示意圖.................................................. 22. 第三章儀器、藥品與實驗方法圖 3-1 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 ...................................... 24. 第四章結果與討論圖 4-1 NBD-PZ-NH2 合成反應式............................................................... 33 圖 4-2 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 電噴灑質譜圖 ........................................... 34 圖 4-3 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 之激發與螢光光譜 ................................... 36 圖 4-4 PMT 偵測衍生試劑之毛細管螢光電泳圖 ...................................... 37 圖 4-5 NBD-PZ-NH2 與羧酸類化合物之反應路徑示意圖 ...................... 39 圖 4-6 乳酸和 3-羥丁酸衍生反應之反應式 ............................................... 40 V.

(8) 圖 4-7 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 之激發與螢光光譜..................... 42 圖 4-8 NBD-PZ-NH-lactate 之激發與螢光光譜 ........................................ 43 圖 4-9 不同催化劑 (TPP/DPDS) 反應濃度對衍生物訊號影響 .............. 47 圖 4-10 譜峰面積與催化劑反應濃度之趨勢圖 ......................................... 48 圖 4-11 不同莫耳數比對衍生物訊號影響.................................................. 49 圖 4-12 譜峰面積與衍生試劑-羧酸比值之趨勢圖 .................................... 50 圖 4-13 衍生時間對衍生物訊號之關係 ..................................................... 51 圖 4-14 譜峰面積與衍生時間之趨勢圖 ..................................................... 52 圖 4-15 微波衍生與室溫下衍生的比較 ..................................................... 53 圖 4-16 pH 值對衍生物訊號之關係............................................................ 54 圖 4-17 譜峰面積與 pH 值之趨勢圖........................................................... 55 圖 4-18 衍生物光電子轉移示意圖 ............................................................. 56 圖 4-19 3-羥丁酸、乳酸衍生物之檢量線 .................................................. 58 圖 4-20 唾液中乳酸、3-羥丁酸的測定 ...................................................... 61 圖 4-21 進食前後唾液樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定 .............................. 62 圖 4-22 不同濃度環糊精對尿液衍生物之分離效果 ................................. 63 圖 4-23 尿液中乳酸、3-羥丁酸的測定 ...................................................... 64 圖 4-24 運動前後尿液樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定 .............................. 65 圖 4-25 進食前後唾液樣品中乳酸、3-羥丁酸濃度變化 .......................... 66 圖 4-26 運動前後尿液樣品中乳酸、3-羥丁酸濃度變化 .......................... 67. VI.

(9) 表目錄第一章緒論表 1-1 羧酸衍生試劑縮寫名稱及其結構 ................................................... 12. 第二章分析方法與原理表 2-1 毛細管電泳發展歷程 ....................................................................... 13 表 2-2 毛細管電泳常見分離模式與機制 ................................................... 18. VII.

(10) 第一章緒論. 第一章. 緒論. 1-1 酮體簡介酮體是由於脂肪代謝不完全而形成的產物，當飲食中缺少醣類或醣類代謝物，吸收有問題時，人體即代謝比正常多的脂肪酸。當大量增加時，脂肪酸的代謝便不完全，脂肪代謝的中間產物出現於血液中，並由尿液中排出。當某些疾病改變碳水化合物的代謝，使得過多脂肪被分解為能量的來源，過多的酮體堆積在血液中稱為酮血症 (ketonemia)；若隨尿液排出，稱為酮尿症 (ketonuria)；血液和尿液中的酮體顯著增加時即稱為酮症 (ketosis)，當體內堆積大量酮體時就會產生酸中毒，稱為酮酸毒症 (ketoacidosis)。正常情況下，人體的血液中只存在少量的酮體。其中， 78 %為 β-羥丁酸，20 % 為乙醯乙酸，2 % 為丙酮。 1-1-1 酮體生成 (ketogenesis) 與代謝. 酮體主要是在肝臟細胞中的線粒體中生成，當血液中的葡萄糖濃度低下或是糖代謝障礙時，脂肪酸開始產生降解反應形成乙醯輔酶 A，若是在 β-氧化中生成的乙醯輔酶 A 量超過了三羧酸循環的處理能力，此時乙醯輔酶 A 就會被用於生成酮體。然而，當肝外組織需要從酮體中獲得能量時，血液將酮體從肝臟中帶出到肝外，乙醯乙醯輔酶 A 在硫解酶的作用下與輔酶 A 結合裂解為兩分子的乙醯輔酶 A，這兩分子的乙醯輔酶 A 進入三羧酸循環而釋放能量。圖 1-1 為酮體生成與代謝反應式[1-10]。 1.

(11) 第一章緒論. 圖 1-1 酮體生成與代謝反應式. 2.

(12) 第一章緒論. 1-1-2 酮體測定. 酮體的測定是依據 Legal’s test 原理，即乙醯乙酸和丙酮在鹼性介質下和普魯士藍 (sodium nitroprusside) 反應生成紫色的複合物。此試驗對乙醯乙酸的實際敏感度為 5 mg/dl (0.5 mmol/L)，對丙酮為 40-70 mg/dl (7-12 mmol/L)。尿酮試紙在檢測尿液中酮體時，陽性反應會呈現明顯紫色變化，隨尿中酮體濃度增加其顏色加深。不同色塊對照不同乙醯乙酸濃度如下： +. 5-40 mg/dl ( 0.5-4 mmol/L). ++. 40-100 mg/dl ( 4-10 mmol/L). +++. >100 mg/dl ( >10 mmol/L). 當血酮 (β-羥丁酸＋乙醯乙酸) 達到 0.8 mmol/L (8mg/dl) 時，尿常規會得到一個加號的陽性結果。血酮達到 1.3 mmol/L (13mg/dl) 時，尿常規有三個加號的陽性結果。由於 β-羥丁酸在結構上並不屬於 ketone ，因此此試驗不會和 β-羥丁酸作用。. 3.

(13) 第一章緒論. 1-1-3 酮體測定的臨床意義. 酮症分為生理性和病理性兩種：生理性酮症多見於禁食、高脂飲食、長時間劇烈運動，新生兒和孕婦血清中的酮體也會稍增高；病理性酮症可由糖尿病、生長激素缺少、乙醇或水楊酸攝取過量等原因引起。 1. 對於禁食或進食困難患者，尤其是糖尿病患者，常規檢測血糖及酮體可以判斷脂肪代謝平衡狀況。 2. 對於可能導致酮體增高的藥物 (如雙胍類)，在使用過程中可檢測血酮濃度水平，作為診斷藥物副作用指標並檢測臨床合理用藥，以避免不良反應症狀。 3. 如果糖尿病患者糖化血色素 > 7 %，空腹血糖值 > 126 mg/dl ，雖尿酮體陰性，有必要同時監測血 β-羥丁酸，β-羥丁酸檢測結果可有效反映糖尿病患者患病程度，可有效預防糖尿病併發症引起的酸中毒，有助於糖尿病合併酮症的早期診斷及預防病情惡化。 4. 監測第一型糖尿病的控制狀況並給予胰島素治療，預測患糖尿病或妊娠糖尿病婦女的胎兒情況。 5. 臨床輕度酮症患者，血中 β-羥丁酸與乙醯乙酸濃度比為 2:1，重症時為 3:1[11]甚至高達 16:1。檢測 β-羥丁酸可準確反應酮體水平，對於糖尿病酮症酸中毒早期診斷和治療及預後判斷上均具有重要的臨床意義。. 4.

(14) 第一章緒論. 1-2 乳酸與科氏循環 (Cori cycle) 對於人的身體來說，乳酸是疲勞物質之一，是身體在保持體溫和肌體運動而產生熱量過程中產生的廢棄物。我們身體生存所需要的能量大部分來自於糖分。血液按照需要把葡萄糖送至各個器官燃燒，產生熱量。這一過程中會產生水、二氧化碳和丙酮酸，丙酮酸還原後生成乳酸。如果身體的能量代謝能正常進行，不會產生堆積，將被血液帶至肝臟，進一步分解為水和二氧化碳，血液中乳酸濃度和組織產生乳酸的速率以及肝臟對乳酸的代謝速度有關，約 65 ％乳酸由肝臟利用。乳酸產物增加會促進肝對乳酸的清除，但當乳酸濃度超過 2 mmol/L 時，肝臟對其的攝取就會達到飽和，當乳酸濃度維持在高水平狀態下容易引發中毒的現象，然而乳酸中毒沒有可接受的濃度標準，一般認為乳酸濃度超過 4 mmol/L 以及血液 pH 小於 7.25 時有明顯的乳酸中毒。. 1-2-1 乳酸生成與代謝. 持續的強烈運動過程中，人體需要大量能量。當組織無法獲得足夠的氧、或無法快速處理氧氣的情況下[12]，丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase complex) 便無法及時將丙酮酸 (pyruvate) 轉換為乙醯輔酶 A ( acetyl-CoA ) 進入有氧呼吸，組織也因此無法藉有氧呼吸獲得充足能量、丙酮酸開始堆積，在這種情況下假如乳酸脫氫酶不將丙酮酸還原為乳酸的話，會抑制糖解過程和三磷酸腺苷 (ATP) 的產生，此時乳酸的濃度會上升。 5.

(15) 第一章緒論. 乳酸代謝過程中，肝臟會接著進行醣質新生反應 (gluconeogenesis) 將乳酸氧化成並進一步變成葡萄糖。於是葡萄糖將進入血液，並回到肌肉組織的活動中提供能量加以利用，此循環即為科氏循環 (Cori cycle)[13]，如圖 1-2。科氏循環重要的基礎在於防止肌肉在無氧呼吸情況下的乳酸中毒 (lactic acidosis)，因此正常情況下，在中毒症狀產生前，乳酸已離開肌肉並進入肝臟代謝了。科氏循環中，在骨骼肌活動產生能量來源 ATP 也是相當重要的。當骨骼肌肉活動停止後更加有效率，因氧氣可再次補充，所以檸檬酸循環及電子傳遞 (electron transport chain) 的機制將可再度進行。. 圖 1-2 科氏循環 (Cori cycle) 6.

(16) 第一章緒論. 1-2-2 乳酸測定. 現存測定全血乳酸大多是利用分光光度法 (或稱酵素法)[14-20]，其原理是利用氧化型輔酶 (NAD+) 在乳酸脫氫酶 (LDH) 催化下將乳酸氧化成丙酮酸，在加入硫酸肼 (hydrazine sulfate) 捕獲產物丙酮酸，並促進反應完成。反應完成後生成的 NADH 與乳酸為等莫耳數，在 340 nm 波長下在測定吸收度 (NADH 最大吸收為 340 nm) [14]如圖 1-3，計算 NADH 生成量並推算出乳酸濃度。另一測血乳酸的方法是利用比色法，以氧化型輔酶 (NAD＋) 作氫受體，LDH 催化 L-乳酸脫氫，生成丙酮酸，NAD ＋轉變成還原型輔酶 (NADH)。酚嗪二甲酯硫酸鹽 (5-methylphenazinum methosulfate, PMS) 將 NADH 的氫傳遞給氯化硝基四氮唑藍 (nitrotetrazolium blue chloride, NBT)，使其還原，在 530 nm 波長測定吸收度。雖然以上方法測定時間短，但是酵素反應會受到許多內生性物質干擾，像是丙酮酸、3-磷酸甘油酸 (3-phosphoglyceric acid)、果糖-1,6-雙磷酸 (fructose-1,6-bisphosphate)、S-lactonyl glutathione [14-15]，這會影響到實驗準確度和再現性，嚴格來說，這並不是一個好的乳酸分析方法。. 圖 1-3 酵素測定法原理 7.

(17) 第一章緒論. 1-2-3 乳酸測定的臨床意義. 乳酸堆積症的病理分類大致上分為三種：第一型：組織細胞缺氧所引起任何會造成組織缺氧的因素，如：激烈運動、癲癇、心肺血管疾病、休克等低血容性疾病。第二型：非缺氧性因素/代謝性疾病，如：脾胃扭轉、糖尿病代謝酸血症、肝或腎臟衰竭、癌症、低血糖、罕見遺傳性代謝性疾病 (粒腺體或乳酸脫氫脢的基因缺陷)。第三型：酸性藥物所誘發，如：水楊酸、巴比妥 (Barbital) 類藥物等。. 乳酸的不正常大量堆積反應了身體的不良生理狀況，因此測定乳酸可以為醫師提供很好的疾病預候與病程預估，如： 1. 心肺血管疾病所引發的乳酸推積，代表組織的血液灌流與供氧不足，醫師就必須在病程轉壞之前就先行進行這方面的改善。 2. 死亡率甚高的急性脾胃扭轉症在進行手術前的患者體內乳酸濃度評估便可預告了其術後的存活率 A. 血漿乳酸濃度大於 6 mmol/L, 存活率只在 58 %以下。 B. 血漿乳酸濃度小於 6 mmol/L, 存活率可在 99 %以上。 3. 輔助做為腎臟衰竭或癌症治療的參考指標之一，來做為代謝性有機酸在患者體內堆積的情形評估。. 8.

(18) 第一章緒論. 1-3 分析物簡介乳酸 (lactic acid)：乳酸是體內組織細胞在缺氧環境下，為求持續供給能量來源而產生的一種有機酸副產物，血液循環中本來就有少許的乳酸出現，而肝臟則負責將乳酸轉化成血糖或碳酸根 (碳酸根本身則負責維持血液微鹼性) 及水，因此血液中乳酸不正常堆積，意謂著體內的組織有體液循還或代謝方面的障礙。有休克的臨床症狀、心血管疾病、血栓症、脾胃扭轉、肝或腎臟的衰竭、撞擊傷害、激烈運動及身體疲勞等情況下，會出現大量的乳酸堆積。一般來說在不運動時，全血乳酸正常值 0.5 ~ 1.7 mmol/L (4.5-15 mg/dl)，尿液乳酸為 5.5 ~ 22 mmol/24h。. 3-羥丁酸 (3-hydroxybutyric acid)：傳統檢查酮體均是檢查尿酮體的含量，但尿酮體分析以乙醯乙酸為主。而酮體的主要成分為 β-羥丁酸 (約占酮體總量的 78 %)，所以檢測 β羥丁酸才是監測酮症酸中毒最敏感的指標。β-羥丁酸檢測在糖尿病酮症酸中毒診斷有重要意義，對糖尿病的早期診斷也有重要意義。同時它也做為糖尿病昏迷的診斷及鑒別依據，可用作肝移植後肝能量代謝的指標，在代謝性酸中毒過程中，除檢查電解質之外，還應檢查 β-羥丁酸的含量。血液中 β-羥丁酸正常值 0.031 ~ 0.263 mmol/L (0.3-2.5 mg/dl)，尿液 β-羥丁酸 < 1 mg/24h。. 9.

(19) 第一章緒論. 1-4 研究目的乳酸和 3-羥丁酸分別為有機體中糖解產物和脂肪代謝中間物，正常情況下，檸檬酸循環嚴密調控生物體中丙酮酸氧化以及糖類、蛋白質或脂肪酸代謝等過程，血液中這兩種酸的濃度才得以維持；然而，在不同的生理狀況 (運動、疾病、藥物等) 刺激時，會使得代謝速率、酵素活性發生改變，進一步造成酸濃度上升或堆積，暫時性的堆積可由檸檬酸循環調控回正常水平，但是疾病 (如糖尿病) 造成的代謝缺陷使得血液酸濃度過度累積而進一步誘發酸中毒，無法被代謝的酸會進入尿液，因此，測定血 (尿) 液乳酸、3-羥丁酸對於評估代謝性酸中毒極具重要性。就結構而言，乳酸和 3-羥丁酸在紫外光區僅有 n →π* 的吸收，加上此躍遷的吸收強度弱，即使是添加 p-methoxybenzoate[21-22] 、 p-toluenesulfonate[23]、anthraquinone-2-sulfonic acid[24]或 dodecyl benzenesulfonate[25]使分析物鍵結上具 UV 吸收的官能基再以間接紫外光吸收 (indirect UV) 偵測，但靈敏度仍不足且偵測極限通常在 10-5 M 等級，故本研究選擇靈敏度較好的螢光衍生法。螢光衍生不外乎是選擇衍生試劑使分析物反應成具有螢光的衍生物，由於不同結構的衍生物會有不同的吸收波長、極性、帶電性質、消散 (decay) 時間等，故選擇雷射光源、衍生反應催化劑和分離裝置非常重要。表 1-1 列出已發表文獻使用的羧酸衍生試劑，這類衍生試劑在結構上含有胺 (amine)、硫醇 (thiol) 或其他可和羧酸反應的官能基，其中 MTBD-SH、DBD-PZ-NH2、NBD-PZ-NH2 是 Kazuhiro Imai 研究團隊自 10.

(20) 第一章緒論. 行合成的衍生試劑並發表在期刊，且這些衍生試劑的衍生物成功利用層析或電泳進行分離檢測。評估上述衍生試劑優劣，本研究以 NBD-PZ-NH2 為衍生試劑，並以藍光雷射做為誘導光源，針對乳酸及 3-羥丁酸衍生物進行偵測。本研究重點大至如下： 1. 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 合成：利用原料 NBD-Cl 和 N-(2-aminoethyl)piperazine 在鹼性下反應，將粗產物經過矽膠管柱純化，再以質譜鑑定和吸收光譜掃描以確認衍生試劑是否合成。 2. 藍光雷射發光光譜以及乳酸、3-羥丁酸衍生物光譜測量：量測藍光雷射之發光光譜圖與乳酸、3-羥丁酸兩者衍生物之激發與螢光光譜圖，以光譜得到的資訊，選取適當的濾光片及相關光學元件，用來建構整組毛細管電泳裝置。 3. 乳酸、3-羥丁酸衍生物條件測試：本研究以毛細管電泳法作為分離方法，並配合藍光雷射做為誘導光源，偵測乳酸、3-羥丁酸衍生物，藉由改變衍生反應條件或背景溶液組成，期望找出最佳偵測條件。 4. 真實樣品應用：將分析技術應用於真實樣品，檢測進食前後唾液中乳酸濃度變化，以及運動前後尿液中乳酸、3-羥丁酸濃度變化。未來發展方向，可做為臨床醫學上用來了解體內代謝性酸中毒，以及診斷生理狀況的參考指標。. 11.

(21) 第一章緒論. 表 1-1 羧酸衍生試劑縮寫名稱及其結構衍生試劑. 縮寫. 5-bromomethylfluorescein 5-BMF [26] 4-aminofluorescein 4-AF [27]. 4-mercapto-7-methylthio MTBD-SH -2,1,3-benzoxadiazole[28] 7-(N,N-dimethylamino sulfonyl)-4-N-(4-N-amino DBD-PZ-NH2 ethyl)piperazino-2,1,3 -benzoxadiazole[29]. 4-nitro-7-piperazinoNBD-PZ 2,1,3-benzoxadiazole[30]. 4-N-(4-N-aminoethyl) piperazino-7-nitro-2,1,3-. NBD-PZ-NH2. benzoxadiazole[31-32]. 12. 結構.

(22) 第二章分析方法與原理. 第二章. 分析方法與原理. 2-1 毛細管電泳法之發展電泳 (electrophoresis) 是指在外加電場的作用下，溶液中的帶電粒子受電場排斥或吸引以不同的速度產生遷移的現象。因為不同帶電粒子的荷電量與質量的不同，導致荷質比的差異，產生不同的遷移速度，藉此達到分離的效果，此稱為電泳分離法。表 2-1 為毛細管電泳法之發展歷程。表 2-1 毛細管電泳發展歷程西元(年) 科學家 1886 1892 1899 1937 1948 1965 1967. Lodge. Jorgenson. 1984. Terabe. 1987 1990. 使用含有膠質的電解液，在兩端加以電壓，發現顏色. 產生的變化[33] 使用含有離子性色素的電解液 Picton 使用含有膠質粒子的 U 型管，發現了電泳的現象 Hardy 應用於離子性物質的分離與精製[34] Tiselius Tiselius 因電泳法-吸附現象及分離血清蛋白等相關研 Tiselius 究得諾貝爾化學獎 Konstantinov 首度使用毛細管進行電泳分離的嘗試提出在高壓電場，直徑 3mm 毛細管中作自由溶液毛細 Hjerten 管區帶電泳[35-36]. 1981. 1987. 事件. Hjerten. Cohen Honda. 使用內徑 75 µm 的石英毛細管，以螢光的方式進行型研究，確立了一般所稱毛細管區帶電泳法(CZE)[37-38] 提出了膠束電動層析法 (micellar electrokinetic chromatography, MEKC)[39] 把傳統的等電聚焦法，應用到毛細管電泳法來，提出了毛細管等電聚焦法 (capillary isoelectric focusing, CIEF)[40-41] 提出了毛細管凝膠電泳法(capillary gel electrophoresis, CGE) [42] 最早將毛細管電泳應用於中芍藥 paeoniflorin 及 oxypaeoniflorin 之定量[43-44] 13.

(23) 第二章分析方法與原理. 2-2 毛細管電泳法之基本原理 2-2-1 電泳分離與遷移率. 電泳分離機制係以帶電荷粒子在電場下的速度差異為基礎，而帶電粒子的遷移速率可用下列式子表示： v = e E 其中，v = 帶電粒子遷移速度；e = 電泳遷移率；E = 電場強度當帶電粒子在自由溶液中，外加電場作用下所受到的靜電力為 Fi Fi = qE q = 帶電粒子電量此靜電力會使得帶電粒子加速運動，直到和反方向的黏滯力 Fd 相等而達成平衡。 Fi = Fd 此黏滯力與帶電粒子的移動速度 v、半徑 r、介質的黏度成正比，可表示為： Fd = 6rv 對速度 v 求解可得： qE 6r. v= 將此解代入 v = eE 中可得： e =. q 6r. 由上式可說明，遷移率和帶電粒子的電荷量、半徑以及緩衝溶液的黏滯力有關。通常在同一介質中，粒子越小且表面電荷大時，其遷移的速度愈大；反之則愈小。 14.

(24) 第二章分析方法與原理. 2-2-2 電滲流 (EOF). 高效能毛細管電泳的操作中最基本的一個現象是電滲流 (electroosmotic flow)[45]，電滲流是毛細管內壁表面電荷的移動，引起管內液體的整體流動，之所以會有這樣的表面電荷形成，主要是外加電場對管壁溶液的電雙層作用所致。如圖 2-1 所示，以 fused silica 為材料的毛細管其內壁的矽醇官能基 (SiOH)在不同的 pH 值下會有不同解離度，因為解離的關係會吸引緩衝液中的陽離子，形成所謂的電雙層 (electrical double layer )。為了保持電荷平衡，陽離子在靠近表面處聚集時，使得從電雙層到離管壁很近的地方產生了一個電位差，稱為 Zeta 電位 ()。公式表示則為： =. 4e . 其中，為電雙層的厚度，e 為單位表面積電荷，為溶液的介電常數。由於 Zeta 電位的存在，在高壓電場的作用下毛細管壁附近的陽離子會朝陰極方向移動，而溶劑中的陽離子會將整個緩衝溶液拉往陰極，使得毛細管中的液體有流動的現象，此即稱為電滲流，如圖 2-2-(c)。電滲流的大小可用速度或遷移率來表示： veof = (/)E 或 eof = / 由於帶電粒子本身有其電泳遷移率 (e)，而溶液本身亦存在著電滲流遷移率 (eof)，因此帶電粒子的總遷移率可視為這兩個數值的加成： total = e + eof 15.

(25) 第二章分析方法與原理. 圖 2-1 毛細管壁帶電荷形成電雙層及 Zeta 電位示意圖. 16.

(26) 第二章分析方法與原理. 圖 2-2 電滲流的形成與流動 (a) 毛細管內壁解離。。。 (b) 電雙層形成。。。。。 (c) 加電場後，電滲流形成. 17.

(27) 第二章分析方法與原理. 2-3 毛細管電泳層析法之分離模式毛細管電泳具有多種的操作模式，每種模式分離機制也都不盡相同，而毛細管電泳基本操作模式包含有：毛細管區帶電泳 (CZE)[46-47]、毛細管微胞電動層析 (MEKC)[48-50]、毛細管凝膠電泳 (CGE)[51]、毛細管等電聚焦 (CIEF)[52-53]、毛細管等速電泳 (CITP)[54-57]以及毛細管電色層析法(CEC)[58-61]，其分離機制如表 2-2 所示。. 表 2-2 毛細管電泳常見分離模式與機制. 分. 離. 模. 式. 分. 毛細管區帶電泳. 離. 機. 制. 自由溶液中電泳遷移率. capillary zone electrophoresis (CZE) 微胞電動層析. 分析物與微胞間相互作用力差異. micellar electrokinetic chromatography (MEKC) 毛細管凝膠電泳. 分析物大小及電荷不同. capillary gel electrophoresis (CGE) 毛細管等電聚焦. 依等電點不同 (pKI). capillary isoelectric focusing (CIEF) 毛細管等速電泳. 界面移動促使分析物分離. capillary isotachophoresis (CITP) 毛細管電色層析法. 分析物與靜相間作用力. capillary electrochromatography (CEC). 18.

(28) 第二章分析方法與原理. 2-3-1 毛細管區帶電泳 (CZE). 毛細管電泳中最基本、也是使用最廣泛的操作模式就是毛細管區帶電泳 (CZE)。其分離的原理就是在外加電場下，分析物因為在緩衝溶液中其質荷比不同，造成電泳遷移率的差別而達到分離的效果。如圖 2-3[62]。在 CZE 模式中，操作的主要變因為：電場強度、溫度、背景溶液組成、pH 值及濃度。在緩衝溶液中加入一些修飾劑如：有機修飾劑 (organic modifier)、界面活性劑 (surfactant) 或手性選擇劑 (chiral selector) 等，透過不同作用機制達到所需的分離效果[63-67]。. a. Detector -. -. -. -. -. -. -- --. -. -. -. -. -. -. -. -. - -. -. -. -. -. -. -. -. -. N N. EOF N -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. + + + + + + + +. N. -. -. N. -. -. N. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. + + + + + + + + + + -. -. -. -. -. -. b t=0 t+. t+. t. N. t-. t-. 圖 2-3 CZE 分離模式下不同粒子遷移之示意圖 (a) 分離示意圖. (b) 層析圖譜示意圖. 19.

(29) 第二章分析方法與原理. 2-3-2 微胞電動層析法 (MEKC). 微胞電動層析 (MEKC) 技術起源於西元 1984 年，由 Terabe 等人首先提出[68-69]，此一技術最大之特點是可同時分離離子型化合物與中性物質。在 MEKC 模式中，是在背景溶液中加入界面活性劑，當界面活性劑濃度在大於其臨界微胞濃度時，每個界面活性劑之單體會聚集在一起，進而形成球狀體，稱其為微胞 (micelle)，這些微胞類似於 HPLC 層析方法之靜相填充物，但是微胞是會隨著電泳而移動，因此在 MEKC 模式中包括流動的背景溶液相與類似固定作用的微胞相，以圖 2-4 所示 [70]。. 圖 2-4 MEKC 分離模式示意圖 S1 及 S2 分別代表不同的溶質粒子，因與微胞產生作用力之不同，而有不同的遷移速率 (a) 分離示意圖 (b) 層析圖譜示意圖 20.

(30) 第二章分析方法與原理. 2-4 毛細管電泳線上濃縮技術 2-4-1 毛細管電泳線上堆積法 (stacking). 由 Chien 與 Burgi 在西元 1991 年所發表的場放大樣品堆積 (field amplified sample stacking) 技術，主要的原理機制於圖 2-5[71]所示。本濃縮技術的成敗關鍵在於分析物在強場 (樣品區帶) 與弱場 (背景溶液區帶) 中期電泳遷移率的差異。. 圖 2-5 堆積 (stacking) 濃縮機制示意圖 A：在毛細管中注入背景溶液，接著注入一段低導電度的樣品基質 (S)，施加正電場進行電泳，基質中帶正電的分析物會往負極移動，達 BGS 與 S 的界面時，移動速度下降，分析物堆積在界面。 B：當所有的分析物都快速的移動到界面上後，分析物就開始進行一般的 CZE 電泳分離模式。 C：堆積過的分析物依次通過偵測點，達到分離與濃縮的效果。 21.

(31) 第二章分析方法與原理. 2-4-2 毛細管電泳線上掃集法 (sweeping). 由 Quirino 以及 Terabe 在 1998 年所提出的毛細管線上濃縮技術：掃集 (sweeping)[72-76]，乃是減弱了電滲流 (EOF)，在 MEKC 模式下的一種線上樣品堆積技術。該濃縮技術的特色在於樣品基質與背景溶液是維持在約相等的導電度，其主要的原理機制如圖 2-4[77]，sweeping 與 MEKC 就以此簡單的方式作結合，被廣泛的運用在毛細管電泳的分析上 [78-80]。. 圖 2-6 掃集 (sweeping) 濃縮機制示意圖 A：首先毛細管內注入背景溶液 (BGS)，之後注射一段樣品 (S)。 B：施加負電場後微胞進入 S 區將分析物掃集至一狹窄區帶，而圖中所標 PS vacancy 則是指前導 BGS 中的微胞往前移動，導致的一段不含微胞的背景溶液。 C：電泳時間的增長，所有樣品區帶都被掃集過後，分析物完全被濃縮在此一黑色區帶上，隨著微胞繼續遷移，被濃縮的分析物區帶 (黑色部分)就此進行 MEKC 電泳分離機制。 22.

(32) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 第三章. 儀器、藥品與實驗方法. 3-1 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (CE-LIF) 圖 3-1 為自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀裝置圖，螢光由 slit 進入單光器再由光倍電增管 (PMT) 偵測。本研究以藍光雷射做為誘導螢光的光源，選用內徑為 50 m 的石英熔融矽毛細管柱分離待測物。當毛細管內注滿緩衝溶液後，以虹吸進樣的方式注入待測樣品，接著施加高壓電進行電泳分離。實驗中所使用的光源為 100 mW，波長為 473 nm 的藍光雷射，利用光學顯微鏡的聚焦鏡聚光，聚焦於毛細管上作為誘導螢光的光源。在與入射光約 90 度角的位置上架設一個倍率為 20 倍的光學顯微鏡接物鏡，用以收集產生的螢光，接著放置一片橘黃色的濾光片，主要目的是用來消除雷射聚焦於毛細管所產生的散射光。再由聚焦鏡聚光，經由單光器 (Omni-λ1509) 分光後，藉由光電倍增管 (PMT) 放大產生電位差，再經過訊號轉換器 (ADC-9724) 轉換，連接至電腦搭配 SCSI 32 程式讀取實驗數據。. 23.

(33) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 圖 3-1 自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光分析儀 (以光電倍增管偵測衍生物螢光). 24.

(34) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 3-2 儀器及周邊設備列表毛細管螢光電泳相關儀器名稱. 製造廠商. 型號. 示意圖及規格. diode laser. BIO-ACCORD SCIENTIFIC & INSTRUMEN T CO.. Class III laser. output power <100 mW wavelength 460-490 nm resolution 0.4 nm dispersion 5.4 nm/mm. monochromator. Zolix. Omni-λ1509. 光電倍增管(PMT). Hamamatsu. R928. PMT 電源供應器. THORN EMI. Power supply Type PM28B. 電泳儀高壓電源供應器. Gamma, FL, USA. Model RR 30-2R. ± 0-30 kV, 0-2 mA, reversible. 顯微鏡接物鏡. kyowa. MODEL BMO20. H 20x N.A. 0.4 focal length 8.5 mm. 三向微動平台. Thorlabs, Ltd, UK. 25 mm Travel. 25.

(35) 第三章儀器、藥品與實驗方法. Onset Electro-optics. EP01N EP02N EP03N. base and holder. Onset Electro-optics. ESB03S ESB01 ESB02S. 高通濾光片 (橘黃色). -------. -------. size : 4 x 4 x 0.3 cm wavelength pass : 520 nm. 毛細管. J&W Scientific, California. 160-2644 (2650) Undeact Fused Silica .075. I.D. 75 µm. 類比/數位轉換器. 訊華. ADC-9724. supply power 110 V output signal ±10 V. 資料處理系統. 訊華. SCSI 32. -------. post and holder. 26.

(36) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 其他相關儀器及耗材名稱. 製造廠商. 型號. 示意圖及規格. 電子天秤. AND. ER-120A. max:120 g d = 0.1 mg. pH 測定儀. HORIBA. F-52. 微量吸量管. Eppendorf. Research micropipet. 超音波洗淨器. BRANSON. 3510. 高速離心機. Serial no:025720. Micro Centrifuge SD mode. speed:6000 rpm/min 1.5 mL. 過濾器. Basic Life. PL-6054541. 13 mm syringe filter with 0.45 µm nylon membrance. HEWLETT PACKARD. 8453. 紫外光可見光吸收光譜儀. ROTAVAPOR 減壓濃縮儀. BUCHI. R R II ○. 27. 100-1000 µL 10-100 µL 0.5-10 µL.

(37) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 3-3 藥品列表類別. 藥名. 化學式及來源. lactic acid. C3H6O3 (Aldrich). 3-hydroxybutyric acid. C4H8O3 (Aldrich). 4-chloro -7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl). C6H2ClN3O3 (Alfa Aesar). N-(2-aminoethyl) piperazine. C6H15N3 (Alfa Aesar). triphenylphosphine (TPP). C18H15P (Aldrich). 分析物. 衍生試劑原料. 催化. 劑 2,2’ - dipyridyl disulfide (DPDS) acetonitrile (ACN). C10H8N2S2 (Aldrich) CH3CN (Merck) 28. 結構式.

(38) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 溶劑. methanol (MeOH). CH3OH (Merk). dichloromethane (DCM). CH2Cl2 (Merk). monosodium phosphate. NaH2PO4 (Sigma). disodium phosphate. Na2HPO4 (Sigma). phosphoric acid. H3PO4 (J. T. Baker). -cyclodextrin. C42H70O35 (Acros). sodium carbonate. Na2CO3 (Acros). sodium hydroxide. NaOH (J. T. Baker). silica gel. (Sigma). 試藥. 29.

(39) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 3-4 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 合成及純化本研究使用的衍生試劑是由 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) 和 N-(2-aminoethyl)piperazine 在鹼性下反應合成。藥品劑量和添加過程：秤取 400 mg N-(2-aminoethyl)piperazine 並以 10 mL 乙腈 (ACN) 溶解，再加入 60 mg 碳酸鈉和 3 mL 去離子水，以磁石均勻攪拌之。另一原料溶液是秤取 100 mg NBD-Cl 溶於 5 mL ACN，待溶解後，將 NBD-Cl 溶液緩慢滴加至 N-(2-aminoethyl)piperazine 溶液，滴加的過程中可觀察到顏色變化，滴加完後以鋁箔紙包住樣品瓶，並以水浴加熱 (50 ℃ ~ 60 ℃) 6 小時，反應結束後將溶液移至圓底燒瓶進行減壓濃縮，濃縮後的油狀物即為粗產物。矽膠管柱製備與粗產物分離：秤取適量的矽膠至管柱約八分滿，以加壓幫浦幫助沖提液 (V. 甲醇. :. V 二氯甲烷 = 1:10) 潤洗，待沖提液面與矽膠等高將粗產物裝載上去，樣品滲透至矽膠後再加入沖提液即開始進行粗產物分離。最先沖提出黃色區帶是起始物 NBD-Cl，待此區帶的溶液沖提完畢後，更換成另一比例沖提液 (V 甲醇 : V 二氯甲烷 = 1:3)，接著收集深褐色區帶產物 NBD-PZ-NH2，將收集到的溶液進行減壓濃縮，濃縮快結束時會發現油狀物產生，流動性較大的油狀物可能是起始物 N-(2-aminoethyl)piperazine，濃縮至剩下深褐色油狀固體 (衍生試劑) 即可。. 30.

(40) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 3-5 NBD-PZ-NH2 衍生物製備衍生步驟是取 50 µL 溶於去離子水中的分析物溶液 (乳酸和 3-羥丁酸濃度各為 2 mg/L)，加入 100 µL 的催化劑，催化劑溶液為 50 µL 150 mM triphenylphosphine (TPP) 和 50 µL 150 mM 2,2’-dipyridyl disulfide (DPDS) 的混合溶液，催化劑皆溶於 ACN，將分析物與催化劑混合均勻之後，再加入 50 µL 2 mM 的 NBD-PZ-NH2 溶於 ACN 中的衍生試劑，在室溫下之暗處靜置 3 小時衍生或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，待衍生完成後，以 buffer 稀釋至 500 µL 最後得到乳酸和 3-羥丁酸衍生物濃度各為 0.2 mg/L。buffer 是由 30 mM NaH2PO4 和 30 mM Na2HPO4 以 H3PO4 調整 pH 值等於 2。. 50 µL 分析物溶液. 100 µL 催化劑 (150 mM TPP/DPDS). 50 µL 2 mM NBD-PZ-NH2. 靜置 3 小時或是微波 3 分鐘衍生. 以 buffer 稀釋至 500 µL 31.

(41) 第三章儀器、藥品與實驗方法. 3-6 唾液、尿液真實樣品前處理毛細管電泳雷射誘導螢光法真實樣品處理步驟：取 1000 µL 唾 (尿) 液至離心管中，以高速離心機離心 5 分鐘，取上層清澈唾 (尿) 液 700 µL 和 700 µL ACN 混合震盪 5 分鐘，待蛋白質析出後再以高速離心機離心 5 分鐘，取上層澄清液並移至另一個離心管，以減壓濃縮裝置將有機溶劑抽掉，以上是唾 (尿) 液去蛋白的過程。取去蛋白的唾 (尿) 液 25 µL 以去離子水稀釋至 1000 µL，此時唾 (尿) 液濃度為原來的 0.025 倍，取稀釋後的唾(尿)液 50 µL，再循著標準品的衍生步驟，加入 100 µL 催化劑 (TPP/DPDS)，最後再加入 50 µL 2 mM 的 NBD-PZ-NH2 溶於 ACN 中的衍生試劑，在室溫下之暗處靜置 3 小時衍生或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，待衍生完成後，以緩衝液稀釋至 500 µL 即配製成唾 (尿) 液稀釋 400 倍的樣品。模擬乳酸中毒、尿酮體患者尿液的配置方式，取去蛋的唾 (尿)液 25 µL 加入 300 µL 10 mg/L 乳酸、3-羥丁酸標準品再以去離子水稀至 1000 µL，此時樣品為唾 (尿) 液稀釋 40 倍含 3 mg/L 標準品，經過衍生後的樣品為唾 (尿) 液稀釋 400 倍含 0.3 mg/L 標準品。. 32.

(42) 第四章結果與討論. 第四章. 結果與討論. 4-1 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 合成本研究使用的衍生試劑是由 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) 和 N-(2-aminoethyl)piperazine 在鹼性下反應合成[31]。圖 4-1 是衍生試劑合成反應式。粗產物由矽膠管柱分離後得到衍生試劑溶液，將溶液經過減壓濃縮後得到衍生試劑。為了更進一步確認衍生試劑是否合成，我們利用電噴灑游離質譜 (ESI-MS) 鑑定母離子質量以及進行光譜掃描觀察特徵吸收及螢光波長。. 圖 4-1 NBD-PZ-NH2 合成反應式. 33.

(43) 第四章結果與討論. 100. [M+1]+ 293. 90. NH3. N. 80 N. 70. N. 60. N. Intensity (%). O. NO2. 50 276 40. N. 30. N N. 20. O N. 10. NO2. 0 200. 210. 220. 230. 240. 250. 260. 270. 280. 290. m/z 圖 4-2 衍生試劑 (NBD-PZ-NH2) 電噴灑質譜圖. 樣品：50 M NBD-PZ-NH2 [ACN] 甲醇流速：6 L/min 噴灑電壓：3 kV. 34. 300.

(44) 第四章結果與討論. 圖 4-2 為衍生試劑質譜鑑定結果，m/z = 293 母離子峰，m/z = 276 是母離子中銨基官能基斷裂 (fragmentation) 後的子離子峰。圖 4-3 為衍生試劑溶液之激發與螢光光譜，由圖中得知 NBD-PZ-NH2 激發波長在 465 nm，最大螢光強度波長在 555 nm。文獻記載，NBD-PZ-NH2 激發波長範圍在 460-490 nm ，螢光範圍在 530-560 nm [32]。兩者比較的結果是吻合的。利用自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光法偵測衍生試劑樣品，以 pH = 2 磷酸鹽作為緩衝液，在 + 15 kV 高壓電下，PMT 偵測出衍生試劑在總長 60 公分及有效長度 50 公分毛細管內通過偵測窗的時間約 10 分鐘。(圖 4-4). 35.

(45) Intensity. 第四章結果與討論. Wavelength (nm) 圖 4-3 衍生試劑 NBD-PZ-NH2 之激發與螢光光譜 a: NBD-PZ-NH2 激發光譜 b: NBD-PZ-NH2 螢光光譜. 36.

(46) 第四章結果與討論. 2000. Fluorescence (mV). NBD-PZ-NH2 1500. 1000. 500. 0 5. 10. 15. 20. Migration Time (min) 圖 4-4 PMT 偵測衍生試劑之毛細管螢光電泳圖. 毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：0.2 mM NBD-PZ-NH2 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 37. 25.

(47) 第四章結果與討論. 4-2 乳酸和 3 -羥丁酸衍生反應之探討本研究利用自製 NBD-PZ-NH2 (4-N-(4-N-aminoethyl)piperazino-7nitro-2,1,3-benzoxadiazole) 衍生試劑與乳酸和 3-羥丁酸在催化劑存在狀況下進行衍生反應，催化劑是等量 TPP (triphenylphosphine) 和 DPDS (2,2’-dipyridyl disulfide) 的生成物，反應後得到的衍生物則作為本研究之分析物。 NBD-PZ-NH2 衍生試劑是以羧酸類化合物作為衍生之對象，而乳酸和 3-羥丁酸皆為羧酸化合物，所以選用 NBD-PZ-NH2，圖 4-5 為 NBDPZ-NH2 與羧酸類化合物之反應路徑示意圖，由圖中可以知道 TPP 和 DPDS 會先反應生成催化物然後再和羧酸反應，此時 NBD-PZ-NH2 的胺基與羧酸進行取代反應，當 triphenylphosphine oxide 離去後，即形成醯胺類衍生物。由於-OH、-OR 官能基不是好的離去基 (leaving group)，所以必須藉由催化劑幫助反應進行。. 38.

(48) 第四章結果與討論. TPP Carboxylic acid. P N. S. N. HO. O. O. S. N. S. R. R. P. O. P. DPDS. R. N. H2N. N O2N. NBD-PZ-NH2. O O2N. O. N O N. P. N N. O. N H2N. N. O P. N. N R. H2N. R. HN. N. N. O. O O2N. O. R. N N O. O2N. N N O. 圖 4-5 NBD-PZ-NH2 與羧酸類化合物之反應路徑示意圖. 39.

(49) 第四章結果與討論. O NH2. N H. N. O OH. N. OH. TPP/DPDS. +. N. OH. N N. N O. O. N. N. NO2 Lactic acid. NO2. NBD-PZ-NH2. NBD-PZ-NH-lactate. O NH2 OH. N H. N. O OH. +. N TPP/DPDS. N. N N. N O. O. N. N. NO2 3-Hydroxybutyrate acid. OH. NO2. NBD-PZ-NH2. NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate. 圖 4-6 乳酸和 3-羥丁酸衍生反應之反應式. 40.

(50) 第四章結果與討論. 4-3 衍生物光譜性質測量圖 4-7、4-8 各為 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate、NBD-PZ-NH-lactate 溶液之激發與螢光光譜。衍生物具有明顯的激發以及螢光光譜，激發光波長為 465 nm，螢光波長為 560 nm。藍光雷射發光範圍大約是 460-480 nm，假若以藍光雷射作為 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 及 NBD-PZ-NH-lactate 衍生物之激發光源，則必須隔絕 500 nm 波長前之光源干擾，在波長 500 nm 之後所放出的光大部分是衍生物的螢光。在衍生物激發光譜 440 nm 波長前有一段強吸收的曲線，這是因為衍生物溶液中催化劑存在的狀況下造成的，催化劑的結構上有苯環所以在接近紫外光區會有很強的吸收，圖 4-7 (c) 是為了確認催化劑的強吸收所進行的吸收光譜測試。由於衍生試劑和衍生物的螢光皆來自同一發色團 (chromophor) 被激發後的放射能量，且衍生試劑反應成衍生物的過程中並沒有其他助色團 (auxochrome) 官能基的修飾，因此衍生試劑和衍生物的激發和螢光光譜在最大吸收位置上並沒有太明顯的差異。. 41.

(51) Intensity. 第四章結果與討論. Wavelength (nm) 圖 4-7 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 之激發與螢光光譜 a. NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 激發光譜 b. NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 螢光光譜 c. 催化劑 (TPP/DPDS) 激發光譜. 42.

(52) Intensity. 第四章結果與討論. Wavelength (nm) 圖 4-8 NBD-PZ-NH-lactate 之激發與螢光光譜 a. NBD-PZ-NH-lactate 激發光譜 b. NBD-PZ-NH-lactate 螢光光譜 c.催化劑 (TPP/DPDS) 激發光譜. 43.

(53) 第四章結果與討論. 4-4 衍生反應條件及電泳條件確立利用 NBD-PZ-NH2 衍生羧酸化合物，在催化劑存在的情況下生成醯胺類衍生物。由於不同的羧酸化合物會有不同的大小、極性和結構，衍生條件會有差異，衍生物的螢光強度在不同環境也不一樣。本研究將針對衍生過程反應時間、催化劑濃度、衍生試劑/羧酸莫耳數比對訊號強度作探討，電泳條件部分則是針對緩衝溶液 pH 值對衍生物螢光強度作探討。緩衝溶液： 30 mM Na2HPO4 及 30 mM NaH2PO4 配製於去離子水中，以 H3PO4 調整 pH 值。分析樣品配製：取 50 µL 溶於去離子水中的分析物溶液 (乳酸和 3-羥丁酸濃度各為 2 mg/L)，加入 100 µL 的催化劑，催化劑溶液為 50 µL TPP 和 50 µL DPDS 的混合溶液，催化劑皆溶於 ACN，將分析物與催化劑混合均勻之後，再加入 50 µL 的 NBD-PZ-NH2 溶於 ACN 中的衍生試劑，在室溫下之暗處靜置 3 小時衍生，或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，最後取 buffer 稀釋至 500 µL，最後得到乳酸和 3-羥丁酸衍生物濃度各為 0.2 mg/L。樣品進樣方式：注入樣品採取虹吸進樣，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高度，進樣時間約 5 秒，換算毛細管進樣長度約 1.9 mm。. 44.

(54) 第四章結果與討論. 不同衍生條件下的測試結果：【一】催化劑濃度樣品配製過程中添加不同濃度的催化劑，在相同衍生時間和衍生試劑濃度下，其電泳圖如圖 4-9，催化劑濃度提高至 12 mM 兩衍生物訊號達到最佳化 (圖 4-10)。. 【二】衍生試劑/羧酸莫耳比為了確保羧酸和衍生試劑反應完全，衍生試劑在分析物配製過程中濃度皆為過量。衍生試劑和羧酸的莫耳數比是影響衍生物訊號的因素之一，圖 4-11 列出不同衍生試劑/羧酸莫耳數比的電泳圖，比值達到 50，兩衍生物訊號達到最佳化 (圖 4-12)。. 【三】衍生時間乳酸與 3-羥丁酸不同衍生時間下的電泳圖如圖 4-13，衍生時間為 3 小時 (圖 4-14) 可得到最大衍生物訊號。此外，利用微波衍生樣品，意外的發現衍生時間由原本的 3 小時縮短為 3 分鐘。圖 4-15 為標準品在室溫衍生和微波衍生的比較結果。. 45.

(55) 第四章結果與討論. 【四】緩衝溶液 pH 值緩衝溶液基值為 30 mM Na2HPO4 及 30 mM NaH2PO4 配製於去離子水中，以 H3PO4 調整至不同 pH 值。圖 4-16 為衍生物在不同 pH 值緩衝液的電泳圖，衍生物在 pH 值 2 ~ 4 緩衝溶液中沒有電滲流的作用，其分離機制是依據衍生物帶電荷密度差異導致遷移速率不同。然而，當緩衝溶液 pH 值由 4 提升至 7，電滲流效應使譜峰的總遷移速率增加，但在 pH 值大於 4 的磷酸鹽緩衝溶液並沒有發現衍生物的螢光訊號。由於衍生物在 pH 值大於 4 的緩衝液中會產生光誘導電子轉移效應 (photoinduced electron transfer, PET) 造成淬熄 (quench) 現象[81-87]。圖 4-18 描述衍生物產生光誘導電子轉移的機制：當緩衝液 pH 值高於 4 時，piperazine 上的氮原子存在一孤對電子 (即 free donor)，當螢光團被光源 (hv1) 激發後，電子躍遷至較高的能階 (LUMO)，此時未成對的電子有很大的機率與電子予體產生交換而鍵結成穩定的能態，這使得激發態電子躍遷回基態的過程受到阻礙，無法產生螢光；然而在緩衝液 pH 低於 4 時，piperazine 上的氮原子進行質子化，當 free donor 與氫離子鍵結產生穩定的 bound donor，光誘導電子轉移過程無法進行，激發態電子順利躍遷回基態 (HOMO) 並放出螢光 (hv2)。. 46.

(56) 第四章結果與討論. 2 0.3 V. 1. e.. 2 1. Fluorescence. d.. 2 1 c.. 1. b.. 2. NBD-PZ-NH2. a.. 5. 10. 15. 20. 25. Migration Time (min) 圖 4-9 不同催化劑 (TPP/DPDS) 反應濃度對衍生物訊號影響 a. 0 mM b. 4 mM c. 8 mM d. 12 mM e. 20 mM 毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：200 g/L 混合物 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 47.

(57) 第四章結果與討論. 8 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate. Peak area (1× 106). 6. 4. 2. 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. Concentration CTPP/DPDS (mM) 圖 4-10 譜峰面積與催化劑反應濃度之趨勢圖. 48. 30.

(58) 第四章結果與討論. 2 1. e.. 0.3 V. 2 1 Fluorescence. d.. 2 1. c.. 1. b.. 2. NBD-PZ-NH2. a.. 5. 1. 10. 2. 15. 20. Migration Time (min) 圖 4-11 不同莫耳數比對衍生物訊號影響 (ratio = NBD-PZ-NH2/acid) a. 30 b. 40 c. 50 d. 60 e. 70 毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：200 g/L 混合物 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 49. 25.

(59) 第四章結果與討論. 6. Peak area (1×106). NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate. 4. 2. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. Molar ratio (NBD-PZ-NH2/acid) 圖 4-12 譜峰面積與衍生試劑-羧酸比值之趨勢圖. 50. 120.

(60) 第四章結果與討論. 1. d. Fluorescence. 2. 1. e.. 0.2 V. 2. 12. c.. 1 2. b. NBD-PZ-NH2. a.. 5. 10. 15. 20. Migration Time (min) 圖 4-13 衍生時間對衍生物訊號之關係 a. 0 min b. 60 min c. 120 min d. 180 min e. 240 min 毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：200 g/L 混合物 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 51. 25.

(61) 第四章結果與討論. 8 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate. Peak area (1×106). 6. 4. 2. 0.0 0. 60. 120. 180. 240. Time (min) 圖 4-14 譜峰面積與衍生時間之趨勢圖. 52. 300.

(62) 第四章結果與討論. 2 1. Fluorescence. b.. 0.3 V. NBD-PZ-NH2. 2 1 a.. 5. 10. 15. 20. Migration Time (min) 圖 4-15 微波衍生與室溫下衍生的比較 a. 微波衍生 3 分鐘 b. 室溫反應 3 小時毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：200 g/L 混合物 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 53. 25.

(63) 第四章結果與討論. e.. Fluorescence. d.. 2 1 c. 2 1 b. NBD-PZ-NH2. 2 1. a.. 5. 10. 15. 0.4 V. 20. Migration Time (min) 圖 4-16 pH 值對衍生物訊號之關係背景溶液 pH 值 a. 2.0 b. 3.0 c. 4.0 d. 4.5 e. 5.0 毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4 分析物：200 g/L 混合物 [H2O:ACN:buffer = 1:3: 6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 54. 25.

(64) 第四章結果與討論. 10 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate. Peak area (1×106). 8. 6. 4. 2. 0 1. 2. 3. 4. 5. pH 圖 4-17 譜峰面積與 pH 值之趨勢圖. 55. 6. 7.

(65) 第四章結果與討論. 圖 4-18 衍生物光電子轉移示意圖. 56.

(66) 第四章結果與討論. 檢量線製作：總結以上條件測試，衍生反應以 15 mM 催化劑溶液，2 mM NBDPZ-NH2，室溫衍生 3 小時或微波衍生 3 分鐘，緩衝溶液 pH 值維持在 2.0，以此條件作真實樣品衍生及偵測。我們分別配製分析物 NBD-PZ-NH-3hydroxybutyrate 及 NBD-PZ-NH-lactate 800、400、100、60 及 30 g/L，進行檢量線的製作，以譜峰面積對濃度作圖，可得到圖 4-19 檢量線。由圖可知系統對於 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 及 NBD-PZ-NH-lactate 的偵測極限分別為 8 g/L (7.68 × 10-8 M)、10 g/L (1.11 × 10-7 M)，譜峰面積與濃度也有很明顯的線性關係 (NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate, y = 11889 x + 60145, R2 = 0.9981; NBD-PZ-NH-lactate, y = 11255 x +174740, R2 = 0.9990)。. 57.

(67) 第四章結果與討論. 10 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate. Peak area (1×106). 8. 6. 4. 2. 0 0. 200. 400. 600. 800. g/L 圖 4-19 3-羥丁酸、乳酸衍生物之檢量線 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate , y = 11889x+60145, R2 = 0.9981 NBD-PZ-NH-lactate , y = 11255x+174740, R2 = 0.9990. 58. 1000.

(68) 第四章結果與討論. 4-5 真實樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定本實驗選擇的真實樣品為尿液和唾液。前處理步驟起先是利用有機溶劑使蛋白質析出，經過離心去除蛋白後，再將上層澄清液以減壓抽氣的方式除去多餘的有機溶劑，最後再將去蛋白後的唾 (尿) 液稀釋即可進行衍生，衍生過程如下：取稀釋後的唾 (尿) 液 50 µL，加入 100 µL 15 mM 催化劑 TPP/DPDS ，最後再加入 50 µL 2 mM NBD-PZ-NH2 衍生試劑，在室溫下暗處靜置 3 小時衍生，或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，待衍生完成後，以 buffer 稀釋至 500 µL 即配製成唾 (尿) 液稀釋 400 倍的樣品。詳細步驟參見 3-6 節。在唾液的應用中，我們利用 4-4 節找到的最佳條件進行毛細管區帶電泳分析，由圖 4-20 顯示，在此分離模式中，分析物與大多數唾液雜質已分離的相當良好。之後 spike 3 mg/L 50 L 的 NBD-PZ-NH-lactate 和 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 得到圖 4-20 (b)，從圖 4-20 (a)中我們可以定出 NBD-PZ-NH-lactate，並推算出唾液中乳酸原有濃度大約是 49 ± 16 mg/L 左右。比較進食前後的唾液樣品，由圖 4-21 (b) 可看出進食後的唾液樣品中由於葡萄糖濃度上升增加轉糖酵素代謝速率，代謝物乳酸濃度上升至 192 ± 48 mg/L (圖 4-25)。考量尿液樣品成分複雜，我們在緩衝溶液中添加-環糊精改善衍生物分離度[88]，由於-環糊精對不同分析物形成內包錯合物能力有差異，藉此增加電泳系統分離的選擇性，圖4-22為不同濃度環糊精對尿液衍生物之分離效果，由圖可看出乳酸、3-羥丁酸衍生物在-環糊精濃度5 mM 時有較好的分離度。圖4-23 (a) 為尿液樣品衍生後電泳分析圖，圖中可 59.

(69) 第四章結果與討論. 觀察到相當明顯的雜質譜峰且基線值的變動也較為明顯，這是由於尿液樣品成分複雜所致，但這不影響後續的定量分析。之後spike 3 mg/L 50 L 的NBD-PZ-NH-lactate和NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate得到圖4-23 (b) 從圖4-23 (a) 中我們可以定出NBD-PZ-NH-lactate，並推算出尿液中乳酸原有濃度大約是 39 ± 11 mg/L 左右。比較運動前後的尿液樣品，由圖4-24 (b) 可看出運動後的尿液樣品中，乳酸濃度有明顯上升，其濃度約為 231 ± 121 mg/L (圖4-26)，由於受試者的代謝狀況不同，偵測到的乳酸濃度亦有差異，即使是相同運動量下，採集到的尿液其乳酸濃度也有很大的差異。至於 3-羥丁酸未能偵測到，推測是因為尿液檢體是正常且沒有酮體代謝異常的情況下，含量低於偵測極限。. 60.

(70) 第四章結果與討論. Spiked : NBD-PZ-NH-LA (300 g/L ). Spiked : NBD-PZ-NH-3HB (300 g/L ). 2 Fluorescence. 1 b.. 0.3 V. NBD-PZ-NH2. 1. a.. 5. 10. 15. 20. Migration Time (min) 圖 4-20 唾液中乳酸、3-羥丁酸的測定 a. 空白唾液衍生 b. 唾液添加 300 g/L 標準品衍生毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：唾液 (原濃度的 1/400) [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 61. 25.

(71) 第四章結果與討論. Fluorescence. 1. b.. 0.3 V. NBD-PZ-NH2. 1. a.. 5. 10. 15. 20. Migration Time (min) 圖 4-21 進食前後唾液樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定 a. 進食前唾液衍生 b. 進食後唾液衍生毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：唾液 (原濃度的 1/400) [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate ) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 62. 25.

(72) 第四章結果與討論. 2. 1 2. d.. 15. 19. 17. 1. 2. Fluorescence. 1. c.. 12 15. 19. 17. 1 2. b.. 1 2 15. NBD-PZ-NH2. a.. 1. 0.5 V 1. 2. 2 14. 8. 12. 19. 17. 16. 20. 16. 24. Migration Time (min) 圖 4-22 不同濃度環糊精對尿液衍生物之分離效果 -CD a. 0 mM b. 2.5 mM c. 5 mM d. 7.5 mM 毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4； pH = 2.00 分析物：尿液 (原濃度的 1/400) [ H2O:ACN:buffer = 1 : 3 : 6 ] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 63. 18.

(73) 第四章結果與討論. Spiked : NBD-PZ-NH-LA (300 g/L ) Spiked : NBD-PZ-NH-3HB (300 g/L ). 2. Fluorescence. 1. 0.3 V. b.. NBD-PZ-NH2. 1 a.. 5. 10. 15. 20. 25. Migration Time (min) 圖 4-23 尿液中乳酸、3-羥丁酸的測定 a. 空白尿液衍生 b. 尿液添加 300 g/L 標準品衍生毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；5 mM -CD；pH = 2.00 分析物：尿液 (原濃度的 1/400) [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 64.

(74) 第四章結果與討論. 0.3 V. Fluorescence. 1 b.. NBD-PZ-NH2. 1 a.. 5. 10. 15. 20. 25. Migration Time (min) 圖 4-24 運動前後尿液樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定 a. 運動前尿液衍生 b. 運動後尿液衍生毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；5 mM -CD；pH =2.00 分析物：唾液 (原濃度的 1/400) [H2O:ACN:buffer = 1:3:6] (1:NBD-PZ-NH-lactate ) 進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm 電壓：15 kV PMT 電壓：-900 V 65.

(75) 第四章結果與討論. 400. n=4. n=4 進食前. 350. 進食後. 300. 濃度 (ppm). 250 200 150 100 50 0 乳酸. 乳酸. 3-羥丁酸. 3-羥丁酸. 圖 4-25 進食前後唾液樣品中乳酸、3-羥丁酸濃度變化. 66.

(76) 第四章結果與討論. 400. n=4. n=4 運動前. 350. 運動後. 300. 濃度 (ppm). 250 200 150 100 50 0 乳酸. 乳酸. 3-羥丁酸. 3-羥丁酸. 圖 4-26 運動前後尿液樣品中乳酸、3-羥丁酸濃度變化. 67.

(77) 第五章結論. 第五章. 結論. 本研究使用雷射誘導螢光偵測法，配合毛細管區帶電泳模式針對乳酸和 3-羥丁酸衍生物進行偵測，並實際應用於唾液、尿液分析上，研究成果統整如下: 1. 本研究成功合成 NBD-PZ-NH2 作為乳酸及 3-羥丁酸的螢光衍生試劑。電泳分離過程中，其衍生物在不添加有機修飾劑和界面活性劑的緩衝溶液中也可有效分離。. 2. 真實樣品檢測結果，發現進食後唾液的乳酸濃度有明顯上升；運動後尿液乳酸濃度亦明顯增加；至於 3-羥丁酸未能偵測到，推測是尿液檢體是正常且沒有酮體代謝異常的情況下，含量低於偵測極限。. 3. 與傳統乳酸、3-羥丁酸分析方法比較，本研究在靈敏度及再現性的部分有相當大的改善。. 4. 毛細管電泳螢光法配合微波衍生提供簡單、快速的分析技術並成功的應用在尿液樣品的檢測，未來期望可以應用於人體或是動物檢體血液中乳酸和 3-羥丁酸的分析上，作為代謝性酸中毒相關疾病診斷的依據。. 68.

(78) 學會發表毛細管電泳-藍光雷射誘導螢光偵測法對尿液中乳酸及 3-羥丁酸之分析研究 Rong-Hua, Hong (洪榮華) and Cheng-Huang, Lin (林震煌)* 第十九屆分析技術交流研討會國立臺灣師範大學 (102.05.25 ~ 26). 69.

(79) 參考文獻 [1] de Jaeger A, F. Proulx, T. Yandza, Intensive Care Med. 24 (1998) 268. [2] T. Kiuchi, E. R. Kuse, K. J. Oldhafer, Hepatology. 21 (1995) 1561. [3] C. Miki, K. Iriyama, J. D. Harrison, Am J Gastroenterol. 92 (1997) 863. [4] C. Miki, K. Iriyama, A. D. Mayer, Cytokine. 11 (1999) 244. [5] C. Miki, A. D. Mayer, J. A. Buckels, K. Iriyama, H. Suzuki, Gut. 44 (1999) 862. [6] K. Ozawa, K. Mori, Curr Opin Gen Surg. (1994) 17. [7] A. J. Garber, P. H. Menzel, G. Boden, J Clin Invest. 54 (1974) 981. [8] G. Riechard, O. Owen, A. Haff, J Clin Invest. 53 (1974) 508. [9] J. P. Flatt, Diabetes. 21 (1972) 50. [10] V. Zammit, Diabetes Reviews. 2 (1994) 132. [11] M. Davidson, In Diabetes Mellitus: Diagnosis and Treatment, 4th Edition. (1998) 159. [12] W. E. Huckabee, J Clin Invest. 37 (1958) 244. [13] J. A. Tayek, J. Katz, Am J Physio. 272 (1997) 476. [14] R. B. Brandt, S. A. Siegel, M. G. Waters, M. H. Bloch, Anal Biochem. 102 (1980) 39. [15] S. Goritti, S. Ghini, G. Carrea, R. Bovara, R. A. Roda, R. Budini, Anal Chim Acta. 255 (1991) 259. [16] A. C. McLellan, S. A. Phillips, P. J. Thornalley, Anal Biochem. 206 (1992) 12. [17] A. C. McLellan, P. J. Thornalley, J. Benn, P. H. Sonksen, Clin Sci. 87 70.

(80) (1994) 21 [18] S. Ohmori, T. Iwamoto, J. Chromatogr. 431 (1988) 239. [19] S. Ohmori, Y. Nose, H. Ogawa, K. Tsuyama, T. Hirota, H. Goto, Y. Yano, Y. Kondoh, K. Nakata, S. Tsubo, J Chromatogr. 566 (1991) 1. [20] D. Narasaiah, U. Spohn, L. Gorton, Anal Lett. 29 (1996) 181. [21] J. Collet, P. Gareil, J Chromatogr A. 792 (1997) 165. [22] R. Roldan-Assad, P. Gareil, J Chromatogr A. 708 (1995) 339. [23] H. Salimi-Moosavi, R. M. Cassidy, Anal Chem. 68 (1996) 293. [24] E. Drange, E. Lundanes, J Chromatogr A. 771 (1997) 301. [25] F. B. Erim, X. Xu, J. C. Kraak, J Chromatogr A. 694 (1995) 471. [26] V. Zuriguel, E. Causse, J. D. Bounery, G. Nouadje, N. Simeon, M. Nertz, R. Salvayre, F. Couderc, J Chromatogr A. 781 (1997) 233. [27] K. Kibler, K. Bachmann, J Chromatogr A. 836 (1999) 325. [28] S. Uchiyama, T. Santa, K. Imai, Anal Chem. 73 (2001b) 2165. [29] C. Z. Huang, T. Santa, K. Imai, Analyst. 127 (2002) 741. [30] T. Fukushima, J. A. Lee, T. Korenaga, H. Ichihara, M. Kato, K. Imai, Biomed Chromatogr. 15 (2001) 189. [31] T. Santa, D. Matsumura, C. Z. Huang, C. Kitada, K. Imai, Biomed Chromatogr. 16 (2002) 523. [32] C. Z. Huang, T. Santa, K. Okabe, K. Imai, J Chromatogr A. 1011 (2003) 193. [33] F. Kohlrausch, Ann. Phys. Chem. 62 (1897) 209. [34] A. Tiselius, Trans. Faraday Soc. 33 (1937) 524. [35] S. Hjerten, Chromatogr. Rev. 9 (1967) 122. 71.

(81) [36] R. Virtanen, Acta Polytechnica Scand. Chem. 123 (1974) 1. [37] J. W. Jorgenson, K. D. Lukacs, J. Chromatogr. 218 (1981) 209. [38] J. W. Jorgenson, K. D. Lukacs, Anal. Chem. 53 (1981) 1298. [39] S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando, Anal. Chem. 56 (1984) 111. [40] S. Hjerten, M. D. Zhu, J. Chromatogr. 346 (1985) 265. [41] S. Hjerten, J. L. Liao, K. Yao, J. Chromatogr. 387 (1987) 127. [42] A. S. Cohen, B. L. Karger, J. Chromatogr. 397 (1987) 409. [43] M. M. Dittmann, G. P. Rozing, J. Chromatogr. A 744 (1996) 63. [44] C. Yan, R. Dadoo, R. N. Zare, D. J. Rakestraw, D. S. Anex, Anal. Chem. 68 (1996) 2726. [45] H. Z. Helmholtz, Annal. Phys. Chem. 7 (1879) 337. [46] J.W. Joegenson, K. D. Lukacs, J. Chromatogr. 218 (1981) 209. [47] J.W. Joegenson, K. D. Lukacs, Anal. Chem. 53 (1981) 1298. [48] K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando, Anal. Chem. 56 (1984) 111. [49] S. Terabe, K. Otsuka, T. Ando, Anal. Chem. 57 (1985) 834. [50] K. H. Row, W. H. Griest, M. P. Maskarienc, J. Chromatogr. 409 (1987) 193. [51] A. Cohen, B. L. Karger, J. Chromatogr. 397 (1987) 409. [52] S. Hjerten, M. D. Zhu, J. Chromatogr. 346 (1985) 265. [53] S. Hjerten, J. L. Liao, K. Yao, J. Chromatogr. 387 (1987) 127. [54] S. Hjerten, K. Elenbring, F. Kilar, J. Liao, A. J. C. Chen, C. J. Siebert, M. Zhu, J. Chromatogr. 403 (1987) 47. 72.

(82) [55] F. Foret, E. Szoko, B. L. Karger, J. Chromatogr. 608 (1992) 3. [56] C. Schwer, F. Lottspeich, J. Chromatogr. 623 (1992) 345. [57] M. Mazereeuw, U. R. Tjaden, N. J. Reinhoud, J. Chromatogr. Sci. 33 (1995) 686. [58] X. Huang, R. N. Zare, Anal. Chem. 63 (1991) 2193. [59] R. D. Holland, M. J. Sepaniak, Anal. Chem. 65 (1993) 1140. [60] X. Huang, M. J. Gordon, R. N. Zare, Anal. Chem. 60 (1993) 375. [61] R. T. Kennedy, J. W. Gorgenson, Anal. Chem. 61 (1989) 1128. [62] D. N. Heiger, Hewlett-Packard Company Publication Number 12-5091-6199E. [63] H. Z. Helmholtz, Anal. Phys. Chem. 7 (1897) 337. [64] B. Krattiger, G. J. M. Bruin, A. E. Bruin, Anal. Chem. 66 (1994) 1. [65] M. Stefansson, M. Novotny, Anal. Chem. 66 (1994) 1134. [66] Y. Kim, M.D. Morris, Anal. Chem. 66 (1994) 1168. [67] Z. Zhzo, A. Malik, M. L. Lee, Anal. Chem. 65 (1994) 2747. [68] R. L. Chien, M. G. Khaledi, High Performance Capillary Electrophoresis, Chapter 13, CRC Press, 1998. [69] Z. Liu, P. Sam, S. R. Sirimanne, P. C. McClure, J. Grainger, D. G. Patterson, J. Chromatogr. A 673 (1994) 125. [70] S.Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando, Anal. Chem. 56 (1984) 111. [71] C. H. Lin, T. Kaneta, Electrophoresis 25 (2004) 4058. [72] K. R. Nielson, J. P. Foley, J. Chromatogr. A 686 (1994) 283. [73] J. P. Quirino, S. Terabe, J. Chromatogr. A 781 (1997) 119. 73.

(83) [74] C. X. Zhang, W. Thormann, Anal. Chem. 70 (1998) 540 [75] Z. K. Shihabi, J. Chromatogr. A 817 (1998) 25. [76] J. Palmer, N. J. Munro, J. P. Landers, Anal. Chem. 71 (1999), 1679. [77] J. P. Quirino, S. Terabe, Anal. Chem. 72 (2000) 1023. [78] O. Nunez, J. B. Kim, E. Moyano, M. T. Galceran, S. Terabe, J. Chromatogr. A 961 (2002) 65. [79] J. B. Kim, K. Otsuka, S. Terabe, J. Chromatogr. A 932 (2001) 129. [80] L. Zhu, C. Tu, H. K. Lee, Anal. Chem. 74 (2002) 5820. [81] S. Uchiyama, T. Santa, K. Imai, Analyst. 125 (2000) 1839. [82] M. Onoda, S. Uchiyama, T. Santa, K. Imai, Luminescence. 17 (2002) 11. [83] A. P. de Silva, H. Q. N. Gunaratne, T. Gunnlaugsson, Chem Rev. 97 (1997) 1515. [84] J. Gan, K. Chen, C. P. Chang, H. Tian, Dyes Pigments. 57 (2003) 21. [85] A. P. de Silva, H. Q. N. Gunaratne, C. P. McCoy, Nature. 364 (1993) 42. [86] K. Rurack, M. Kollmannsberger, J. Daub, Angew Chem, Int Ed 2001 40 385. [87] C. J. McAdam, B. H. Robinson, J. Simpson, Organomet. 19 (2000) .3644 [88] Z. D. Hu, High Performance Capillary Electrophoresis, Lanzhou University Press, Lanzhou, p. 31, 90.. 74.

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毛細管電泳/藍光雷射誘導螢光偵測法 對尿液中乳酸及3-羥丁酸之分析研究

毛細管電泳/藍光雷射誘導螢光偵測法對尿液中乳酸及3-羥丁酸之分析研究