表 2-1 毛細管電泳發展歷程 ... 13 表 2-2 毛細管電泳常見分離模式與機制 ... 18
第一章 緒論
第一章 緒論
1-1 酮體簡介
酮體是由於脂肪代謝不完全而形成的產物，當飲食中缺少醣類或醣 類代謝物，吸收有問題時，人體即代謝比正常多的脂肪酸。當大量增加 時，脂肪酸的代謝便不完全，脂肪代謝的中間產物出現於血液中，並由 尿液中排出。
當某些疾病改變碳水化合物的代謝，使得過多脂肪被分解為能量的 來源，過多的酮體堆積在血液中稱為酮血症 (ketonemia)；若隨尿液排出，
稱為酮尿症 (ketonuria)；血液和尿液中的酮體顯著增加時即稱為酮症 (ketosis)，當體內堆積大量酮體時就會產生酸中毒，稱為酮酸毒症 (ketoacidosis)。正常情況下，人體的血液中只存在少量的酮體。其中，
78 %為 β-羥丁酸，20 % 為乙醯乙酸，2 % 為丙酮。
1-1-1 酮體生成 (ketogenesis) 與代謝
酮體主要是在肝臟細胞中的線粒體中生成，當血液中的葡萄糖濃度 低下或是糖代謝障礙時，脂肪酸開始產生降解反應形成乙醯輔酶 A，若 是在β-氧化中生成的乙醯輔酶 A 量超過了三羧酸循環的處理能力，此時 乙醯輔酶 A 就會被用於生成酮體。然而，當肝外組織需要從酮體中獲得 能量時，血液將酮體從肝臟中帶出到肝外，乙醯乙醯輔酶 A 在硫解酶的 作用下與輔酶 A 結合裂解為兩分子的乙醯輔酶 A，這兩分子的乙醯輔酶 A 進入三羧酸循環而釋放能量。圖 1-1 為酮體生成與代謝反應式[1-10]。
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圖 1-1 酮體生成與代謝反應式
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1-1-2 酮體測定
酮體的測定是依據 Legal’s test 原理，即乙醯乙酸和丙酮在鹼性介 質下和普魯士藍 (sodium nitroprusside) 反應生成紫色的複合物。此試驗 對乙醯乙酸的實際敏感度為 5 mg/dl (0.5 mmol/L)，對丙酮為 40-70 mg/dl (7-12 mmol/L)。
尿酮試紙在檢測尿液中酮體時，陽性反應會呈現明顯紫色變化，隨 尿中酮體濃度增加其顏色加深。不同色塊對照不同乙醯乙酸濃度如下：
+ 5-40 mg/dl ( 0.5-4 mmol/L) ++ 40-100 mg/dl ( 4-10 mmol/L) +++ >100 mg/dl ( >10 mmol/L)
當血酮 (β-羥丁酸＋乙醯乙酸) 達到 0.8 mmol/L (8mg/dl) 時，尿常 規會得到一個加號的陽性結果。血酮達到 1.3 mmol/L (13mg/dl) 時，尿 常規有三個加號的陽性結果。
由於 β-羥丁酸在結構上並不屬於 ketone ，因此此試驗不會和 β-羥 丁酸作用。
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1-1-3 酮體測定的臨床意義
酮症分為生理性和病理性兩種：生理性酮症多見於禁食、高脂飲食、
長時間劇烈運動，新生兒和孕婦血清中的酮體也會稍增高；病理性酮症 可由糖尿病、生長激素缺少、乙醇或水楊酸攝取過量等原因引起。
1. 對於禁食或進食困難患者，尤其是糖尿病患者，常規檢測血糖及酮 體可以判斷脂肪代謝平衡狀況。
2. 對於可能導致酮體增高的藥物 (如雙胍類)，在使用過程中可檢測血 酮濃度水平，作為診斷藥物副作用指標並檢測臨床合理用藥，以避 免不良反應症狀。
3. 如果糖尿病患者糖化血色素 > 7 %，空腹血糖值 > 126 mg/dl ，雖尿
酮體陰性，有必要同時監測血 β-羥丁酸，β-羥丁酸檢測結果可有效
反映糖尿病患者患病程度，可有效預防糖尿病併發症引起的酸中毒，
有助於糖尿病合併酮症的早期診斷及預防病情惡化。
4. 監測第一型糖尿病的控制狀況並給予胰島素治療，預測患糖尿病或 妊娠糖尿病婦女的胎兒情況。
5. 臨床輕度酮症患者，血中 β-羥丁酸與乙醯乙酸濃度比為 2:1，重症時 為 3:1[11]甚至高達 16:1。
檢測 β-羥丁酸可準確反應酮體水平，對於糖尿病酮症酸中毒早期診
斷和治療及預後判斷上均具有重要的臨床意義。
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1-2 乳酸與科氏循環 (Cori cycle)
對於人的身體來說，乳酸是疲勞物質之一，是身體在保持體溫和肌 體運動而產生熱量過程中產生的廢棄物。我們身體生存所需要的能量大 部分來自於糖分。血液按照需要把葡萄糖送至各個器官燃燒，產生熱量。
這一過程中會產生水、二氧化碳和丙酮酸，丙酮酸還原後生成乳酸。如 果身體的能量代謝能正常進行，不會產生堆積，將被血液帶至肝臟，進 一步分解為水和二氧化碳，血液中乳酸濃度和組織產生乳酸的速率以及 肝臟對乳酸的代謝速度有關，約 65 ％乳酸由肝臟利用。乳酸產物增加 會促進肝對乳酸的清除，但當乳酸濃度超過 2 mmol/L 時，肝臟對其的 攝取就會達到飽和，當乳酸濃度維持在高水平狀態下容易引發中毒的現 象，然而乳酸中毒沒有可接受的濃度標準，一般認為乳酸濃度超過 4 mmol/L 以及血液 pH 小於 7.25 時有明顯的乳酸中毒。
1-2-1 乳酸生成與代謝
持續的強烈運動過程中，人體需要大量能量。當組織無法獲得足夠 的氧、或無法快速處理氧氣的情況下[12]，丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase complex) 便無法及時將丙酮酸 (pyruvate) 轉換為乙醯輔 酶 A ( acetyl-CoA ) 進入有氧呼吸，組織也因此無法藉有氧呼吸獲得充 足能量、丙酮酸開始堆積，在這種情況下假如乳酸脫氫酶不將丙酮酸還 原為乳酸的話，會抑制糖解過程和三磷酸腺苷 (ATP) 的產生，此時乳 酸的濃度會上升。
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乳酸代謝過程中，肝臟會接著進行醣質新生反應 (gluconeogenesis) 將乳酸氧化成並進一步變成葡萄糖。於是葡萄糖將進入血液，並回到肌 肉 組 織 的 活 動 中 提 供 能 量 加 以 利 用 ， 此 循 環 即 為 科 氏 循 環 (Cori cycle)[13]，如圖 1-2。
科氏循環重要的基礎在於防止肌肉在無氧呼吸情況下的乳酸中毒 (lactic acidosis)，因此正常情況下，在中毒症狀產生前，乳酸已離開肌肉 並進入肝臟代謝了。科氏循環中，在骨骼肌活動產生能量來源 ATP 也是 相當重要的。當骨骼肌肉活動停止後更加有效率，因氧氣可再次補充，
所以檸檬酸循環及電子傳遞 (electron transport chain) 的機制將可再度 進行。
圖 1-2 科氏循環 (Cori cycle)
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1-2-2 乳酸測定
現存測定全血乳酸大多是利用分光光度法 (或稱酵素法)[14-20]，
其原理是利用氧化型輔酶 (NAD+) 在乳酸脫氫酶 (LDH) 催化下將乳 酸氧化成丙酮酸，在加入硫酸肼 (hydrazine sulfate) 捕獲產物丙酮酸，
並促進反應完成。反應完成後生成的 NADH 與乳酸為等莫耳數，在 340 nm 波長下在測定吸收度 (NADH 最大吸收為 340 nm) [14]如圖 1-3，計 算 NADH 生成量並推算出乳酸濃度。
另一測血乳酸的方法是利用比色法，以氧化型輔酶 (NAD＋) 作氫受 體，LDH 催化 L-乳酸脫氫，生成丙酮酸，NAD＋轉變成還原型輔酶 (NADH)。酚嗪二甲酯硫酸鹽 (5-methylphenazinum methosulfate, PMS) 將 NADH 的氫傳遞給氯化硝基四氮唑藍 (nitrotetrazolium blue chloride, NBT)，使其還原，在 530 nm 波長測定吸收度。
雖然以上方法測定時間短，但是酵素反應會受到許多內生性物質干 擾，像是丙酮酸、3-磷酸甘油酸 (3-phosphoglyceric acid)、果糖-1,6-雙磷 酸 (fructose-1,6-bisphosphate)、S-lactonyl glutathione [14-15]，這會影響 到實驗準確度和再現性，嚴格來說，這並不是一個好的乳酸分析方法。
圖 1-3 酵素測定法原理
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1-2-3 乳酸測定的臨床意義
乳酸堆積症的病理分類大致上分為三種：
第一型：組織細胞缺氧所引起任何會造成組織缺氧的因素，如：激烈 運動、癲癇、心肺血管疾病、休克等低血容性疾病。
第二型：非缺氧性因素/代謝性疾病，如：脾胃扭轉、糖尿病代謝酸 血症、肝或腎臟衰竭、癌症、低血糖、罕見遺傳性代謝性疾 病 (粒腺體或乳酸脫氫脢的基因缺陷)。
第三型：酸性藥物所誘發，如：水楊酸、巴比妥 (Barbital) 類藥物等。
乳酸的不正常大量堆積反應了身體的不良生理狀況，因此測定乳酸 可以為醫師提供很好的疾病預候與病程預估，如：
1. 心肺血管疾病所引發的乳酸推積，代表組織的血液灌流與供氧不 足，醫師就必須在病程轉壞之前就先行進行這方面的改善。
2. 死亡率甚高的急性脾胃扭轉症在進行手術前的患者體內乳酸濃 度評估便可預告了其術後的存活率
A. 血漿乳酸濃度大於 6 mmol/L, 存活率只在 58 %以下。
B. 血漿乳酸濃度小於 6 mmol/L, 存活率可在 99 %以上。
3. 輔助做為腎臟衰竭或癌症治療的參考指標之一，來做為代謝性有 機酸在患者體內堆積的情形評估。
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1-3 分析物簡介
乳酸 (lactic acid)：
乳酸是體內組織細胞在缺氧環境下，為求持續供給能量來源而產生 的一種有機酸副產物，血液循環中本來就有少許的乳酸出現，而肝臟則 負責將乳酸轉化成血糖或碳酸根 (碳酸根本身則負責維持血液微鹼性) 及水，因此血液中乳酸不正常堆積，意謂著體內的組織有體液循還或代 謝方面的障礙。
有休克的臨床症狀、心血管疾病、血栓症、脾胃扭轉、肝或腎臟的 衰竭、撞擊傷害、激烈運動及身體疲勞等情況下，會出現大量的乳酸堆 積。一般來說在不運動時，全血乳酸正常值 0.5 ~ 1.7 mmol/L (4.5-15 mg/dl)，尿液乳酸為 5.5 ~ 22 mmol/24h。
3-羥丁酸 (3-hydroxybutyric acid)：
傳統檢查酮體均是檢查尿酮體的含量，但尿酮體分析以乙醯乙酸為 主。而酮體的主要成分為羥丁酸 (約占酮體總量的 78 %)，所以檢測 β-羥丁酸才是監測酮症酸中毒最敏感的指標。β-羥丁酸檢測在糖尿病酮症 酸中毒診斷有重要意義，對糖尿病的早期診斷也有重要意義。同時它也 做為糖尿病昏迷的診斷及鑒別依據，可用作肝移植後肝能量代謝的指標，
在代謝性酸中毒過程中，除檢查電解質之外，還應檢查β-羥丁酸的含量。
血液中β-羥丁酸正常值 0.031 ~ 0.263 mmol/L (0.3-2.5 mg/dl)，尿液 β-羥 丁酸 < 1 mg/24h。
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1-4 研究目的
乳酸和 3-羥丁酸分別為有機體中糖解產物和脂肪代謝中間物，正常 情況下，檸檬酸循環嚴密調控生物體中丙酮酸氧化以及糖類、蛋白質或 脂肪酸代謝等過程，血液中這兩種酸的濃度才得以維持；然而，在不同 的生理狀況 (運動、疾病、藥物等) 刺激時，會使得代謝速率、酵素活 性發生改變，進一步造成酸濃度上升或堆積，暫時性的堆積可由檸檬酸 循環調控回正常水平，但是疾病 (如糖尿病) 造成的代謝缺陷使得血液 酸濃度過度累積而進一步誘發酸中毒，無法被代謝的酸會進入尿液，因 此，測定血 (尿) 液乳酸、3-羥丁酸對於評估代謝性酸中毒極具重要性。
就結構而言，乳酸和 3-羥丁酸在紫外光區僅有 n →π* 的吸收，加 上 此 躍 遷 的 吸 收 強 度 弱 ， 即 使 是 添 加 p-methoxybenzoate[21-22] 、
p-toluenesulfonate[23]、anthraquinone-2-sulfonic acid[24]或 dodecyl benze-
nesulfonate[25]使分析物鍵結上具 UV 吸收的官能基再以間接紫外光吸 收 (indirect UV) 偵測，但靈敏度仍不足且偵測極限通常在 10-5 M 等級，就結構而言，乳酸和 3-羥丁酸在紫外光區僅有 n →π* 的吸收，加 上 此 躍 遷 的 吸 收 強 度 弱 ， 即 使 是 添 加 p-methoxybenzoate[21-22] 、