第四章 結果與討論
4-1 衍生試劑 NBD-PZ-NH
2合成
本研究使用的衍生試劑是由 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) 和 N-(2-aminoethyl)piperazine 在鹼性下反應合成[31]。圖 4-1 是衍生試 劑合成反應式。
粗產物由矽膠管柱分離後得到衍生試劑溶液，將溶液經過減壓濃縮 後得到衍生試劑。為了更進一步確認衍生試劑是否合成，我們利用電噴 灑游離質譜 (ESI-MS) 鑑定母離子質量以及進行光譜掃描觀察特徵吸 收及螢光波長。
圖 4-1 NBD-PZ-NH2 合成反應式
第四章 結果與討論
Intensity (%)
[M+1]+
276
第四章 結果與討論
圖 4-2 為衍生試劑質譜鑑定結果，m/z = 293 母離子峰，m/z = 276 是母離子中銨基官能基斷裂 (fragmentation) 後的子離子峰。
圖 4-3 為衍生試劑溶液之激發與螢光光譜，由圖中得知
NBD-PZ-NH2激發波長在 465 nm，最大螢光強度波長在 555 nm。文獻 記載，NBD-PZ-NH2激發波長範圍在 460-490 nm ，螢光範圍在 530-560 nm [32]。兩者比較的結果是吻合的。
利用自組式毛細管電泳/雷射誘導螢光法偵測衍生試劑樣品，以 pH
= 2 磷酸鹽作為緩衝液，在 + 15 kV 高壓電下，PMT 偵測出衍生試劑 在總長 60 公分及有效長度 50 公分毛細管內通過偵測窗的時間約 10 分 鐘。(圖 4-4)
第四章 結果與討論
圖 4-3 衍生試劑 NBD-PZ-NH2之激發與螢光光譜 a: NBD-PZ-NH2 激發光譜
b: NBD-PZ-NH2 螢光光譜 Wavelength (nm)
Intensity
第四章 結果與討論
圖 4-4 PMT 偵測衍生試劑之毛細管螢光電泳圖
毛細管：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m
背景溶液：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分析物：0.2 mM NBD-PZ-NH2 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6]
進樣長度：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒) 偵測波長：560 nm
電壓：15 kV
PMT 電壓：-900 V
NBD-PZ-NH2
Migration Time (min)
5 10 15 20 25
0 500 1000 1500 2000
Fluorescence (mV)
第四章 結果與討論
4-2 乳酸和 3 -羥丁酸衍生反應之探討
本研究利用自製 NBD-PZ-NH2 (4-N-(4-N-aminoethyl)piperazino-7- nitro-2,1,3-benzoxadiazole) 衍生試劑與乳酸和 3-羥丁酸在催化劑存在狀 況下進行衍生反應，催化劑是等量 TPP (triphenylphosphine) 和 DPDS (2,2’-dipyridyl disulfide) 的生成物，反應後得到的衍生物則作為本研究 之分析物。
NBD-PZ-NH2衍生試劑是以羧酸類化合物作為衍生之對象，而乳酸 和 3-羥丁酸皆為羧酸化合物，所以選用 NBD-PZ-NH2，圖 4-5 為 NBD- PZ-NH2 與羧酸類化合物之反應路徑示意圖，由圖中可以知道 TPP 和 DPDS 會先反應生成催化物然後再和羧酸反應，此時 NBD-PZ-NH2的胺 基與羧酸進行取代反應，當 triphenylphosphine oxide 離去後，即形成醯 胺類衍生物。由於-OH、-OR 官能基不是好的離去基 (leaving group)，
所以必須藉由催化劑幫助反應進行。
第四章 結果與討論
第四章 結果與討論
NBD-PZ-NH2 NBD-PZ-NH-lactate
Lactic acid
NBD-PZ-NH2 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate
3-Hydroxybutyrate acid OH
OH
第四章 結果與討論
4-3 衍生物光譜性質測量
圖 4-7、4-8 各為 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate、NBD-PZ-NH-lactate 溶液之激發與螢光光譜。衍生物具有明顯的激發以及螢光光譜，激發光 波長為 465 nm，螢光波長為 560 nm。
藍 光 雷 射 發 光 範 圍 大 約 是 460-480 nm ， 假 若 以 藍 光 雷 射 作 為 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 及 NBD-PZ-NH-lactate 衍生物之激發光源，
則必須隔絕 500 nm 波長前之光源干擾，在波長 500 nm 之後所放出的光 大部分是衍生物的螢光。
在衍生物激發光譜 440 nm 波長前有一段強吸收的曲線，這是因為 衍生物溶液中催化劑存在的狀況下造成的，催化劑的結構上有苯環所以 在接近紫外光區會有很強的吸收，圖 4-7 (c) 是為了確認催化劑的強吸 收所進行的吸收光譜測試。
由於衍生試劑和衍生物的螢光皆來自同一發色團 (chromophor) 被 激發後的放射能量，且衍生試劑反應成衍生物的過程中並沒有其他助色 團 (auxochrome) 官能基的修飾，因此衍生試劑和衍生物的激發和螢光 光譜在最大吸收位置上並沒有太明顯的差異。
第四章 結果與討論
圖 4-7 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 之激發與螢光光譜 a. NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 激發光譜
b. NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 螢光光譜 c. 催化劑 (TPP/DPDS) 激發光譜
Intensity
Wavelength (nm)
第四章 結果與討論
圖 4-8 NBD-PZ-NH-lactate 之激發與螢光光譜 a. NBD-PZ-NH-lactate 激發光譜
b. NBD-PZ-NH-lactate 螢光光譜 c.催化劑 (TPP/DPDS) 激發光譜
Intensity
Wavelength (nm)
第四章 結果與討論
4-4 衍生反應條件及電泳條件確立
利用 NBD-PZ-NH2衍生羧酸化合物，在催化劑存在的情況下生成醯 胺類衍生物。由於不同的羧酸化合物會有不同的大小、極性和結構，衍 生條件會有差異，衍生物的螢光強度在不同環境也不一樣。
本研究將針對衍生過程反應時間、催化劑濃度、衍生試劑/羧酸莫耳 數比對訊號強度作探討，電泳條件部分則是針對緩衝溶液 pH 值對衍生 物螢光強度作探討。
緩衝溶液：
30 mM Na2HPO4及 30 mM NaH2PO4配製於去離子水中，以 H3PO4 調整 pH 值。
分析樣品配製：
取 50 µL 溶於去離子水中的分析物溶液 (乳酸和 3-羥丁酸濃度各為 2 mg/L)，加入 100 µL 的催化劑，催化劑溶液為 50 µL TPP 和 50 µL DPDS 的混合溶液，催化劑皆溶於 ACN，將分析物與催化劑混合均勻之後，再 加入 50 µL 的 NBD-PZ-NH2溶於 ACN 中的衍生試劑，在室溫下之暗處 靜置 3 小時衍生，或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微波衍生，最後取 buffer 稀釋至 500 µL，最後得到乳酸和 3-羥丁酸衍生物濃度各為 0.2 mg/L。
樣品進樣方式：
注入樣品採取虹吸進樣，將注入端抬高距離出口端約 30 公分的高 度，進樣時間約 5 秒，換算毛細管進樣長度約 1.9 mm。
第四章 結果與討論
不同衍生條件下的測試結果：
【一】催化劑濃度
樣品配製過程中添加不同濃度的催化劑，在相同衍生時間和衍生試 劑濃度下，其電泳圖如圖 4-9，催化劑濃度提高至 12 mM 兩衍生物訊號 達到最佳化 (圖 4-10)。
【二】衍生試劑/羧酸莫耳比
為了確保羧酸和衍生試劑反應完全，衍生試劑在分析物配製過程中 濃度皆為過量。衍生試劑和羧酸的莫耳數比是影響衍生物訊號的因素之 一，圖 4-11 列出不同衍生試劑/羧酸莫耳數比的電泳圖，比值達到 50，
兩衍生物訊號達到最佳化 (圖 4-12)。
【三】衍生時間
乳酸與 3-羥丁酸不同衍生時間下的電泳圖如圖 4-13，衍生時間為 3 小時 (圖 4-14) 可得到最大衍生物訊號。此外，利用微波衍生樣品，意 外的發現衍生時間由原本的 3 小時縮短為 3 分鐘。圖 4-15 為標準品在室 溫衍生和微波衍生的比較結果。
第四章 結果與討論
【四】緩衝溶液 pH 值
緩衝溶液基值為 30 mM Na2HPO4及 30 mM NaH2PO4配製於去離子 水中，以 H3PO4調整至不同 pH 值。圖 4-16 為衍生物在不同 pH 值緩衝 液的電泳圖，衍生物在 pH 值 2 ~ 4 緩衝溶液中沒有電滲流的作用，其分 離機制是依據衍生物帶電荷密度差異導致遷移速率不同。然而，當緩衝 溶液 pH 值由 4 提升至 7，電滲流效應使譜峰的總遷移速率增加，但在 pH 值大於 4 的磷酸鹽緩衝溶液並沒有發現衍生物的螢光訊號。由於衍 生物在 pH 值大於 4 的緩衝液中會產生光誘導電子轉移效應 (photo- induced electron transfer, PET) 造成淬熄 (quench) 現象[81-87]。
圖 4-18 描述衍生物產生光誘導電子轉移的機制：當緩衝液 pH 值高 於 4 時，piperazine 上的氮原子存在一孤對電子 (即 free donor)，當螢光 團被光源 (hv1) 激發後，電子躍遷至較高的能階 (LUMO)，此時未成對 的電子有很大的機率與電子予體產生交換而鍵結成穩定的能態，這使得 激發態電子躍遷回基態的過程受到阻礙，無法產生螢光；然而在緩衝液 pH 低於 4 時，piperazine 上的氮原子進行質子化，當 free donor 與氫離 子鍵結產生穩定的 bound donor，光誘導電子轉移過程無法進行，激發態 電子順利躍遷回基態 (HOMO) 並放出螢光 (hv2)。
第四章 結果與討論
Migration Time (min)
5 10 15 20 25
第四章 結果與討論
圖 4-10 譜峰面積與催化劑反應濃度之趨勢圖
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8
Peak area (1×106)
Concentration CTPP/DPDS (mM)
NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate
第四章 結果與討論
Migration Time (min)
Fluorescence
第四章 結果與討論
圖 4-12 譜峰面積與衍生試劑-羧酸比值之趨勢圖
0 20 40 60 80 100 120
0 2 4 6
Peak area (1×106 )
Molar ratio (NBD-PZ-NH2/acid)
NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate
第四章 結果與討論
Migration Time (min)
Fluorescence
第四章 結果與討論
圖 4-14 譜峰面積與衍生時間之趨勢圖
0 60 120 180 240 300
0.0 2 4 6 8
Peak area (1×106 )
Time (min)
NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate
第四章 結果與討論
圖 4-15 微波衍生與室溫下衍生的比較 a. 微波衍生 3 分鐘 b. 室溫反應 3 小時 毛 細 管 ：全長 60 cm，有效長度 50 cm，內徑 50 m 背景溶液 ：30 mM NaH2PO4；30 mM Na2HPO4；pH = 2.00 分 析 物 ：200 g/L 混合物 [H2O:ACN:buffer = 1:3:6]
(1:NBD-PZ-NH-lactate, 2:NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate) 進樣長度 ：1.9 mm (虹吸進樣：高度 30 cm，進樣 5 秒)
偵測波長 ：560 nm 電 壓：15 kV PMT 電壓：-900 V
b.
a.
0.3 V
1 2
NBD-PZ-NH2
1
2
Fluorescence
Migration Time (min)
5 10 15 20 25
第四章 結果與討論
Migration Time (min)
0.4 V
第四章 結果與討論
圖 4-17 譜峰面積與 pH 值之趨勢圖
1 2 3 4 5 6 7
0 2 4 6 8 10
Peak area (1×106 )
pH
NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate
第四章 結果與討論
圖 4-18 衍生物光電子轉移示意圖
第四章 結果與討論
檢量線製作：
總結以上條件測試，衍生反應以 15 mM 催化劑溶液，2 mM NBD- PZ-NH2，室溫衍生 3 小時或微波衍生 3 分鐘，緩衝溶液 pH 值維持在 2.0，
以此條件作真實樣品衍生及偵測。我們分別配製分析物 NBD-PZ-NH-3- hydroxybutyrate 及 NBD-PZ-NH-lactate 800、400、100、60 及 30 g/L，
進行檢量線的製作，以譜峰面積對濃度作圖，可得到圖 4-19 檢量線。由 圖可知系統對於 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 及 NBD-PZ-NH-lactate 的偵測極限分別為 8 g/L (7.68 × 10-8 M)、10 g/L (1.11 × 10-7 M)，譜峰 面積與濃度也有很明顯的線性關係 (NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate, y = 11889 x + 60145, R2 = 0.9981; NBD-PZ-NH-lactate, y = 11255 x +174740, R2 = 0.9990)。
第四章 結果與討論
圖 4-19 3-羥丁酸、乳酸衍生物之檢量線 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate , y = 11889x+60145, R2 = 0.9981 NBD-PZ-NH-lactate , y = 11255x+174740, R2 = 0.9990
Peak area (1×106 )
0 200 400 600 800 1000
0 2 4 6 8 10
g/L
NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate NBD-PZ-NH-lactate
第四章 結果與討論
4-5 真實樣品中乳酸、3-羥丁酸的測定
本實驗選擇的真實樣品為尿液和唾液。前處理步驟起先是利用有機 溶劑使蛋白質析出，經過離心去除蛋白後，再將上層澄清液以減壓抽氣 的方式除去多餘的有機溶劑，最後再將去蛋白後的唾 (尿) 液稀釋即可 進行衍生，衍生過程如下：取稀釋後的唾 (尿) 液 50 µL，加入 100 µL 15 mM 催化劑 TPP/DPDS ，最後再加入 50 µL 2 mM NBD-PZ-NH2衍生試 劑，在室溫下暗處靜置 3 小時衍生，或是以 800 W 微波爐加熱 3 分鐘微 波衍生，待衍生完成後，以 buffer 稀釋至 500 µL 即配製成唾 (尿) 液稀 釋 400 倍的樣品。詳細步驟參見 3-6 節。
在唾液的應用中，我們利用 4-4 節找到的最佳條件進行毛細管區帶 電泳分析，由圖 4-20 顯示，在此分離模式中，分析物與大多數唾液雜質 已分離的相當良好。之後 spike 3 mg/L 50 L 的 NBD-PZ-NH-lactate 和 NBD-PZ-NH-3-hydroxybutyrate 得到圖 4-20 (b)，從圖 4-20 (a)中我們可以 定出 NBD-PZ-NH-lactate，並推算出唾液中乳酸原有濃度大約是 49 ± 16 mg/L 左右。比較進食前後的唾液樣品，由圖 4-21 (b) 可看出進食後的 唾液樣品中由於葡萄糖濃度上升增加轉糖酵素代謝速率，代謝物乳酸濃 度上升至 192 ± 48 mg/L (圖 4-25)。
考量尿液樣品成分複雜，我們在緩衝溶液中添加-環糊精改善衍生 物分離度[88]，由於-環糊精對不同分析物形成內包錯合物能力有差異，
考量尿液樣品成分複雜，我們在緩衝溶液中添加-環糊精改善衍生 物分離度[88]，由於-環糊精對不同分析物形成內包錯合物能力有差異，