造骨細胞( Osteoblast )能夠製造膠原蛋白與分泌骨基質，是提供骨骼中有機成份 的重要來源，同時參與骨頭的生長與重塑作用(Bone Remodeling)。造骨細胞除了分泌 第一型膠原蛋白( Type I Collagen )，同時還能分泌鹼性磷酸酶( Alkaline Phosphatase，
ALP )與其他重要的蛋白酵素，這些酵素除了可作為骨細胞分化與發展的指標外，也 能促進細胞進行礦化作用，以形成硬骨組織。
鹼性磷酸酶是一位於細胞膜外表面的醣蛋白，一般認為鹼性磷酸酶與骨骼形成有 關，是最早能促使骨骼礦化的酵素，此酵素除了能當作骨分化的基準外，同時也能作 為骨細胞正常活性與代謝的指標；而其他如連骨素( Osteopontin，OPN )、骨骼涎蛋白 ( Bone Sialoprotein，BSP )或骨鈣素（Osteocalcin，OCN）等酵素，能夠幫助粘附鈣離 子與磷離子，以形成氫氧基磷灰石，並可以把有機質與無機質連結起來，當骨骼中出 現這些酵素則表示礦化已經開始，除了幫助造骨細胞鈣化形成骨細胞( Osteocyte )，
同時也是骨細胞增生的特徵值。因此本實驗想藉由鹼性磷酸酶的定量分析與定性染 色，與 Von-Kossa 染色分析法，了解光刺激是否能夠促進骨細胞分化及礦化程度(鈣 離子沉積)的發展，以幫助骨骼的生成。
4-1 鹼性磷酸酶活性之定量分析
圖二十四、二十五為三種波長利用不同能量照射(功率為 3.89 mW/cm2)，光照後 第3~11 天探討骨細胞分泌鹼性磷酸酶活性之定量表現；實驗前先將濃度為 1×105 cells / ml 的細胞植入培養皿中進行培養，並貼附 24 小時後進行光照實驗。實驗組與控制 組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將所量測之ALP 活性對細胞數進行平均(N0與Ni
分別為為控制組及實驗組之ALP 吸光值除以細胞數量後所得的數值，即 N0=OD 控制組 /cell number、Ni=OD實驗組/ cell number )，圖中星號( * )的 P-value 為實驗組與控制組之 相互比較，井號( # )的 P-value 為能量 0.5 與 5 J/cm2之相互比較。
ALP 活性的表現是骨細胞分化過程中重要的指標，早期的骨先驅細胞並不會分 泌ALP 酵素，當骨母細胞分化成骨細胞時，細胞所分泌的 ALP 濃度會逐漸增加【Ozawa et al., 1998】，實驗中(圖 4-23~圖 4-25)發現老鼠骨細胞(UMR-106)的 ALP 濃度在培養 後第 3~7 天有增加的現象發生，尤其到第七天有最大表現，在此之後細胞所分泌的 ALP 濃度則有慢慢下降的趨勢，此一結果顯示光照刺激並不會提早 ALP 的表現趨 勢。雖然骨細胞在經由光照後所分泌之 ALP 濃度最高峰沒有特別提早或延緩的現象 發生，不過相較於未照光的控制組則發現，在中低能量的刺激下，ALP 最大值在經 過光刺激後皆有增加的現象，顯示光刺激能有效促進骨細胞分泌更多的ALP 酵素。
從結果發現，三種波長在能量0.5 與 5 J/cm2照射後第5~9 天，都有明顯促進骨 細胞分泌更多的ALP 酵素，尤其紅光與黃光在能量 5 J/cm2的時候有最佳的提升效果 (紅光 5 J/cm2在光照後第7~9 天效果最佳；黃光 5 J/cm2在光照後第5~9 天效果最佳)，
藍光則是在低能量0.5 J/cm2光照後第5~9 天的促進效果最佳，推測可能的原因為細 胞能夠吸收此藍光波段，又由於藍光的光子能量較強，也就是說所需要提供給電子的 能量較少，因此藍光在低能量時就能有效加速細胞產生能量，進而刺激細胞分泌更多 的 ALP 酵素，幫助細胞分化為成熟的骨細胞。相對地，細胞吸收紅光與黃光時則需 要較大的能量以促進電子的傳遞；過去也有學者利用照射的砷化鎵鋁雷射(830nm)刺 激老鼠骨細胞，在能量為3.84 J/cm2時發現在光照後第9、12、15 天，細胞所分泌的
ALP 酵素皆有明顯增加的現象，因此學者認為光刺激能夠幫助骨細胞的分化與增生，
同時還能促進骨骼的生長與修復【Ueda et al.,2003】。雖然光治療的醫學應用發展約有 三、四十年之久，不過隨著近幾年來光電技術日漸成熟，因此在本實驗探討較新發展 的發光二極體對於細胞表現的影響(紅光 652nm、黃光 590nm 與藍光 415nm)，從上述 數據，可發現當能量大小足夠且適當時，類骨細胞(UMR-106)內的光受體分子在這三 種波長照射下能夠有明顯的吸收，同時使用適當的光刺激能量可以提升粒線體中電子 躍遷與電子傳遞速度，除了能夠增加細胞的行為表現，同時還能促進細胞分泌在分化 及發展過程中所需要的酵素。
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
3D 5D 7D 9D 11D
Culture Time After Irradiation ( Days )
Specific ALP Concentration ( mg / cell )
0J 0.5J
5J 10J
*
*
** *
*
*
**
**
*
# #
*
圖二十四 紅光(652nm)刺激下，骨細胞鹼性磷酸酶活性之變化，圖中星號( * ) 的P-value 為實驗組與控制組之相互比較，井號( # )的 P-value 為 能量0.5 與 5 J/cm2之相互比較。
( * : P<0.05；# : P<0.05；** : P<0.01)
0
Culture Time After Irradiation ( Days ) Specific ALP Concentration ( mg / cell )
0J 0.5J
Culture Time After Irradiation ( Days )
Specific ALP Concentration ( mg / cell )
0J 0.5J
P<0.05；# : P<0.05；** : P<0.01)4-2 光刺激對骨細胞礦化程度(鈣離子沉積)之影響
積，似乎都有被抑制的情形發生，此一現象與上一個章節骨細胞在光刺激後分化時所 分泌的鹼性磷酸酶(ALP)趨勢相符合，推斷細胞在適當的光刺激參數照射後，除了可 以促進粒線體電子傳遞與活性增加，提升細胞生產能量的速度，不但可以幫助細胞合 成核酸及蛋白質，促進細胞的增生作用等生理反應，同時還能刺激骨細胞在發展期間 分泌更多促進分化所需的酵素；過去也有學者利用波長 830nm 的低能量雷射(能量 3.82 J/cm2)來刺激老鼠類骨細胞，實驗中也是利用 Von-Kosaa 染色來探討鈣離子的沉 積，證實光照後的確可以促進骨細胞的礦化表現，因此學者認為低能量光刺激能促使 骨細胞分化與骨形成【Ozawa et al.,1998】。
0 J/cm2 0.5 J/cm2 5 J/cm2 10 J/cm2
7 天
10 天
14 天
圖二十六 紅光 (652nm)刺激下，骨細胞鈣離子沉積之表現，光照功率為 3.89J/cm2(黑褐色為鈣離子之沉積，紅色為背景染色)
0 J/cm2 0.5 J/cm2 5 J/cm2 10 J/cm2
7 天
10 天
14 天
圖二十七 黃 光 (590nm) 刺 激 下 ， 骨 細 胞 鈣 離 子 沉 積 之 表 現 ， 光 照 功 率 為 3.89J/cm2(黑褐色為鈣離子之沉積，紅色為背景染色)
0 J/cm2 0.5 J/cm2 5 J/cm2 10 J/cm2
7 天
10 天
14 天
圖二十八 藍 光 (415nm) 刺 激 下 ， 骨 細 胞 鈣 離 子 沉 積 之 表 現 ， 光 照 功 率 為 3.89J/cm2(黑褐色為鈣離子之沉積，紅色為背景染色)
結論
1. 在利用低功率的發光二極體照射系統研究中發現，當三種波長的光照能量提升至 5 J/cm2後，對系統溫度變化才有比較明顯的增加作用，又以波長較長的紅光 (652nm)溫度上升最多，不過由光照能量所造成的溫度變化皆在細胞可容許的範圍 內( <0.5℃)，因此證實實驗中所使用的低能量光源刺激細胞時，並不會產生明顯 的熱效應而影響細胞的生長與行為。
2. 骨細胞經由光刺激後最佳的生理表現，於藍光波段下最適合的能量為 0.5 J/cm2， 而紅光與黃光波段則為5 J/cm2，因此認為細胞在適當的光照波長與能量刺激下，
能夠提升粒線體中光受體分子電子躍遷與傳遞速度，讓細胞產生更多的能量以供 給使用，除了能夠提升細胞粒線體活性，並表現在生理反應，還能刺激細胞分泌 酵素，以促進骨細胞的生成與發展。
3. 在固定光照能量而改變功率的實驗中則發現，細胞在不同功率刺激下(紅光；2.71 與3.89 mW/cm2；黃光；2.71 與 3.89 mW/cm2；藍光；3.89 與 4.17 mW/cm2)，細 胞的生理表現皆沒有太大的差異性，因此推斷在本實驗所採用之光照系統中，能 量應為主要決定性因素而非功率。
4. 在延遲效應的研究中指出，粒線體的活性、蛋白質合成與細胞增生等生理表現，
在藍光0.5 J/cm2以及紅、黃光5 J/cm2刺激下，相較於未照光的控制組而言，都有 明顯被促進的效果發生，而粒線體活性表現在光照後第三天有最明顯的提升作 用，不過細胞所分泌的蛋白質濃度和細胞數量的增加，則要到光照後第五天才有 最明顯的表現，因此認為當細胞受到光刺激後，粒線體是最早被影響的部份，當 細胞獲得能量後將進行一連串包括核酸合成、蛋白質合成、細胞增生或細胞貼附 等生理反應，同時還有可能刺激骨細胞分泌更多在分化過程中所需要的酵素，以 幫助骨細胞的生成與發展。
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