探討光刺激於牙周組織產生之細胞增殖、基因表現、溫度分布與水含量的影響(I)

(1)

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

探討光刺激於牙周組織產生之細胞增殖、基因表現、溫度分布與水含量的影響(I)

研究成果報告(精簡版)

計畫類別：個別型

計畫編號： NSC 96-2221-E-011-149-

執行期間： 96 年 08 月 01 日至 97 年 07 月 31 日執行單位：國立臺灣科技大學化學工程系

計畫主持人：何明樺

報告附件：出席國際會議研究心得報告及發表論文

處理方式：本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢

中華民國 97 年 10 月 24 日

(2)

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 □ 成果報告

□期中進度報告

探討光刺激於牙周組織產生之細胞增殖、基因表現、溫度分布與水含量的影響(I)

計畫類別：□ 個別型計畫 □ 整合型計畫計畫編號：NSC96－2221－E－011－149－

執行期間：2007 年 08 月 01 日至 2008 年 07 月 31 日

計畫主持人：何明樺共同主持人：

計畫參與人員：

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：國立台灣科技大學

中華民國 97 年 10 月 27 日

(3)

可供推廣之研發成果資料表

□ 可申請專利 □ 可技術移轉日期：97 年 10 月 27 日

國科會補助計畫

計畫名稱：探討光刺激於牙周組織產生之細胞增殖、基因表現、溫度分布與水含量的影響(I)

計畫主持人：何明樺

計畫編號：NSC96－2221－E－011－149－

學門領域：工程學門

技術/創作名稱以光刺激影響牙周細胞行為表現發明人/創作人 ^何明樺

綜合實驗結果，細胞的粒線體活性、細胞增生與骨細胞特徵表現等行為表現，在藍光低能量(0.5J/cm²)刺激下，有最佳的提升效果(約為 2.5 倍)，而在紅光與黃光照射下，最適合的刺激能量則為 5 J/cm²，推測光受體分子除吸收波段不同外，對能量的需求程度也不同，因此短波長光源(藍光)利用較少的照射能量，即可刺激細胞產生特定生理反應，而紅黃光則需較高的能量。在高能量(10~20 J/cm²)刺激下，無論所使用為哪種波長對於細胞的行為表現都有抑制的情況發生。實驗中也發現，在相同能量不同功率的條件下，利用三種波長照射細胞，其生理表現皆沒有明顯的差異，因此認為在本實驗所採取的光刺激系統中，能量應為主要的決定性因素而非功率。

技術說明英文：The wavelengths used in this study included 652 (red light), 590 (yellow light) and 415 nm (blue light) and the powers were 2.71, 3.89 and 4.17 mW/cm², respectively. The energy for LED stimulus was ranged from 0.1 to 20 J/cm². The experimental outcomes indicated that the optimal stimulation energy of blue light (0.5J/cm²) can effectively promote the mitochondria activity, cell proliferation and expression of osteoblastic markers. However, the effective energy of red and yellow lights was higher (5J/cm²). The possible reason would be that photo-acceptors for lights with different wave length are different, so the required energy levels also diverse. On the other hand, to the light stimuli with high energy (10~20 J/cm²) would inhibit the cell activity and differentiation, no matter which wave length was used. The importance of stimulation power and energy was also investigated in this study. The results suggested that the irradiation energy is dominant, compared with the stimulation power.

可利用之產業及可開發之產品

醫療照護用器材

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技術特點系統化地找出可有效刺激齒槽骨細胞再生的光刺激條件

推廣及運用的價值

利用物理性非入侵、無痛且高安全性的光生物刺激治療方法，來提升造骨細胞的生長與活性

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目錄

序論 5

實驗材料與方法 6

1. 光刺激方法 6

2. 細胞培養 8

結果與討論 10

1. 光刺激能量對系統溫度之影響 10

2. 光刺激波長與能量對骨細胞行為表現之影響 11 2-1 光刺激對細胞粒線體活性之影響 12 2-2 光刺激對細胞粒線體活性之延遲效應 14 2-3 光刺激對細胞蛋白質分泌之影響 16 2-4 光刺激對細胞蛋白質分泌之延遲效應 19 2-5 光刺激對細胞增生之影響 21 2-6 光刺激對細胞增生之延遲效應 23 2-7 光刺激對骨細胞形態之影響 25 3. 光刺激功率對骨細胞行為表現之影響 28 3-1 不同功率對粒線體活性之探討 28 3-2 不同功率對細胞蛋白質分泌與細胞增生之探討 30

4. 光刺激對骨細胞特徵值之影響 33

4-1 鹼性磷酸酶活性之定量分析 34 4-2 光刺激對骨細胞礦化程度(鈣離子沉積)之影響 36

結論 40

參考文獻 41

計畫成果自評 48

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序論

隨著科技的日新月異，以及生化科技的進步，人類的生活品質逐年上升，同時壽命也隨之增加，然而此現象也造成全球人口年齡層的老化，因此相對地有越來越多的老年疾病普遍存在於社會中，其中包括骨質疏鬆症、退化性關節炎、心血管疾病及身體機能受損或退化等。

骨質疏鬆症更是近幾年來各國重視的疾病之ㄧ，主要的原因是骨質疏鬆症會引發駝背、骨折，嚴重甚至還會引發呼吸困難，研究發現罹患重度骨質疏鬆症的病患，大約會有 10~20%的人會在一年內由於併發症而死亡，更有超過一半以上的病人會有行動不變的困擾，以美國衛生單位的調查中發現，骨質疏鬆症對於社會的影響，每年約有上百萬人有骨質流失的問題，所花費的醫療費用更高達一百億美金，不但對社會造成莫大的衝擊，對於家庭更是相當大的負擔。

對於骨質疏鬆症而言，普遍應用於患者的治療，除了多攝取鈣質、多運動、注意飲食均衡之外，以目前醫療技術而言，常利用化學藥物來刺激骨生成或抑制骨質的流失，並降低骨折發生的機率，雖然這些化學藥物的治療，對於病患有一定程度上的幫助，但是藥物治療除效率較低外，對於患者又常有副作用；若以手術方式進行骨骼修復，對於患者可能需要更長的復健時間、較大的醫療開銷，甚至會有感染的風險存在。

1971年學者Mester提出「光生物調節作用」( Photobiomodulation )，利用低能量雷射光源刺激燒燙傷實驗老鼠，結果發現能夠有效地促使老鼠之表皮傷口癒合【Mester , 1971】，

奠定之後更多人投入此研究與發展，其醫療研究範圍涵蓋甚廣，包括以低能量的光源刺激細胞，能夠加速細胞的生長、促進蛋白質合成以及加速傷口的癒合等，目前也有越來越多文獻發現，骨細胞經由低能量雷射刺激後，能夠促進骨細胞DNA的合成、提升膠原纖維的分泌、促進細胞分泌ALP與骨鈣素、增加細胞數量…等。

有鑑於此，本實驗希望利用物理性非入侵、無痛且高安全性的光生物刺激治療方法，

來提升造骨細胞的生長與活性。由於光刺激所使用的雷射能量高、操作不便，儀器的價格也相當昂貴，有更多的學者希望能夠找尋代替雷射的光源，以探討有關光刺激生物的研究；

近幾年來隨著光電產業的蓬勃發展，發光二極體(LED)的問世也越來越多元，因此在實驗中刺激細胞的光源，想藉由體積小、發熱少、操作方便、價格便宜、波長選擇性大及能夠照射大面積傷口等優點的發光二極體，來進行光刺激細胞的研究，除了能夠找出適合促進成骨細胞生長與骨頭修復的條件外，同時也能夠探討光刺激效應之機制，假以時日能夠將新型的治療方法，廣泛應用於更多骨質疏鬆症的病患身上。

(7)

實驗材料與方法

本實驗中所進行光照射細胞所使用的發光二極體(LED)光源，為國立台灣科技 大學化工所洪儒生教授所提供。所使用的發光二極體元件有兩組，其中一組光源每個元件有16 個 LED 燈泡，其中紅光元件波長為 652nm、電壓為 2V、電流為 320mA；

黃光元件波長為590nm、電壓為 2V、電流為 320mA；藍光元件波長為 415nm、電壓為3.4V、電流為 320mA；而另一組光源則有有 12 個 LED 燈泡(見附錄一)。

如下圖一所示，第一組光源在金屬板的正面將三種波長元件，全都利用並聯的方式連接起來，其中紅光與黃光共有九個LED 元件，藍光則有六個 LED 元件，其總功率約為 3.89 mW/cm²；圖 3-1(b) 發光二極體元件後面除了塗抹散熱膏，並於金屬板的背後加裝一個風扇，增加光照射實驗中散熱的功能，以防止LED 元件溫度的升高，而影響到發光二極體元件波長的改變，以及細胞的生長。組裝好的發光二極體陣列，將光源與風扇連接至可調式的電源供應器，並手動調整發光二極體與風扇元件所驅使的電壓電流，以進行光刺激實驗。

圖一 LED 電路系統正面－光源元件

1. 光刺激方法

如表一，刺激細胞的發光二極體之光源波長為紅光 652nm、黃光 590nm 和藍光 415nm，光照射細胞的刺激能量由公式可得知，光照射之總能量(J/cm²)為輸出功率 (mW/cm²)乘以所刺激的時間(s)，在本實驗中所刺激的能量為 0.1、0.5、1、5、10 以及20 J/cm²，因此可以利用不同發光二極體的輸出功率，改變刺激的照射時間，如此一來便可以修正實驗所需要的照射能量，以進行光刺激細胞的實驗，同時探討適合細胞生理表現的光刺激參數。

(8)

表一、LED 光照元件

紅光 (652nm) 黃光(590nm) 藍光(415nm)

功率

( mW/cm² ) 2.71 2.71 4.17

功率

( mW/cm² ) 3.89 3.89 3.89

刺激能量

( J/cm² ) 0.1、0.5、1、5、10、20

61

(9)

2. 細胞培養

本實驗是利用類骨細胞(UMR-106)來進行光刺激的實驗，以進一步了解細胞在經過光生物的調節作用後，所產生的影響與細胞的生理反應，盡可能找出能夠促進細胞生長、增加細胞活性或是促進骨細胞礦化之最適合參數。實驗中使用紅光、黃光以及藍光等三種不同的波長，進行光刺激細胞之反應，並改變光照所需之時間，來達到刺激細胞所需的總能量(如表二)，實驗後觀測並比較在不同照射波長、功率、能量與培養天數，光刺激效應對於細胞的增生效果、蛋白質濃度、活性以及骨細胞生長指標的影響與差異性。

觀測方法包括光刺激細胞後第 1、3、5、7 天，使用 MTT assay 來測量細胞粒線體之活性；由BCA kit 來測定經過光照後，細胞分泌蛋白質濃度之變化，同時算數光照細胞所影響的細胞之增長；並於光照後第3~11 天進行 ALP 定量分析與 ALP 定性染色，以了解骨細胞的分化與發展，第7、10、14 進行 Von-Kossa 鈣鹽沉積染色，探討細胞在經由光刺激後所產生的光生物調節作用，對於細胞生長與骨骼礦化之影響。

表二發光二極體功率、能量與光照時間之對照表

紅光黃光藍光

2.71 mW/cm²

3.89 mW/cm²

2.71 mW/cm²

3.89 mW/cm²

4.17 mW/cm² 0.1 J/cm² 37s 25 s 37s 25 s 25 s 24s 0.5 J/cm² 185s 125 s 185s 125 s 125 s 120s

1 J/cm² 369s 250 s 369s 250 s 250 s 240s 5 J/cm² 1845s 1250 s 1845s 1250 s 1250 s 1200s 10 J/cm² 3690s 2500 s 3690s 2500 s 2500 s 2400s 20 J/cm² 7380s 5000 s 7380s 5000 s 5000 s 4800s 實驗前一天，先將所需要之細胞以 PH 約為 7.4 的 PBS 緩衝溶液清洗過後，再更換新的細胞培養液，讓細胞能夠處於一個比較健康的環境下生長。實驗的時候先利用血球計數器，算數約1×10⁵個細胞加入3.5cm 細胞培養皿中，並加入約 2ml 的新鮮培養液，放入恆溫（37℃）之細胞培養箱後，使細胞貼附約 24 小時；於顯微鏡下確定細胞皆貼附於細胞培養皿上，再進行實驗的時候，將所要進行刺激的細胞培養皿噴完酒精後，拿到避光之無菌操作台內，再利用設計好的發光二極體陣列進行光照實驗(圖二)。

實驗中先將細胞將分成兩部份，其中一組是未照光的控制組，實驗進行時只會更換新鮮培養液，而不做任何的光刺激，另外一組為照光的實驗組，在實驗進行期間使用不同的光照波長與能量刺激細胞，並於光照後每隔2 天更換一次細胞所需要的培養

(10)

液，最後對於細胞的生理表現情形進行數據處理與分析。

本實驗使用αMEM 為培養細胞的培養液，進行老鼠骨細胞的培養。αMEM 培養液中含有 10 % 胎牛血清 (FBS) 與 1 % 的抗生素 (penicillin-streptomycin-amphotercin)，將細胞置入 37℃，含 5 % 二氧化碳的細胞培養箱中進行培養，大約二到三天左右，更換一次新的培養液。細胞表現分析包括 MTT 測試、細胞貼附面積測量、蛋白質分泌量測試、Alkaline phosphatase （ALPase）定性染色、ALPase 定量分析與細胞鈣化染色、細胞數目分析與電子顯微鏡分析。

圖二 LED 光照實驗設備

(11)

結果與討論

1. 光刺激能量對系統溫度之影響

人類是屬於恆溫動物，全身的平均溫度大約 37±0.5℃左右，當人類體溫太低時可能造成細胞活性下降，但是溫度太高也可能造成細胞生長與代謝受到影響，嚴重還會造成死亡；研究指出，當動物細胞培養溫度過高時，細胞活性有明顯的被抑制情形，

甚至造成DNA 變性或蛋白質結構被破壞【Luo et al., 2000；Dinh et al., 2001；Rylander et al.,2005】。本研究中所使用的照射光源為發光二極體，光是一種能量，在刺激細胞的時候，除了提供光受體分子能量並促進電子在粒線體呼吸鏈的傳遞外，同時也可能在光照中產生熱能，因此需要探討光照過程中，系統是否由於溫度的上升而影響細胞的活性與生長情況。

若以熱量公式來估算， H( cal ) = m ( g ) × s (cal/g- ) ℃ × ∆T ( )℃ ，其中假設實驗中所使用的發光二極體最大能量為20J，約為 4.78 cal，質量為 9.61 g(直徑為 3.5cm，

液面高度為1cm 之培養皿)，培養液比熱假設與水相同皆約為 1 cal/g-℃，因此系統最大的溫度上升約為 0.5℃，由資料中顯示，細胞所處的環境溫度是在可容許的範圍，

因此系統中溫度不會影響細胞死亡而導致光照實驗中有所誤差。

同時本實驗也利用低功率的發光二極體照射細胞培養液，改變光照射時間，並利用熱電偶式測溫計( Thermocouple )量測總光照能量對於溫度之關係變化(見 3.7.7)。從圖三中可發現，細胞培養液在三種波長的照射下，當照射能量提升至5 J/cm²後，溫度才有比較明顯的增加趨勢，尤其是以波長較長的紅光(652nm)溫度上升最多，不過由光照能量刺激細胞，所造成的溫度變化皆在細胞可容許的範圍內( <0.5℃)，因此證實實驗中所使用的低能量光源刺激細胞時，並不會產生明顯的熱效應而影響細胞蛋白質之變性，或是造成細胞生長受到影響。

(12)

36.8 36.9 37 37.1 37.2 37.3 37.4 37.5

0.1J 0.5J 1J 5J 10J 20J

Energy(J/cm^2)

Temperature (℃)

Red (652nm) Yellow (590nm) Blue (415nm)

圖三光刺激能量對溫度之變化

經由以上的研究結果與過去文獻比較可得知，由於實驗中所使用的光源刺激功率甚低，照射能量範圍也低於10² J/cm²，使得光源照射在細胞或組織上，並不會造成有明顯的溫度上升變化( 0.1℃~0.5 )℃ ，所產生的熱效應溫度不足以破壞細胞內部的結構

【Basford , 1989】，同時推測光生物調節作用所引發的細胞行為表現，為光化學反應所引起的效應。

2. 光刺激波長與能量對骨細胞行為表現之影響

從光刺激生物的研究中發現，細胞色素C氧化酵素對於範圍在330~860nm波長有明顯的吸收現象，尤其最大吸收波峰發生在620、680、760和820nm處的紅光與近紅外光區，光敏素( Porphyrin )在短波長400nm左右的藍光區也有最大的吸收波峰【Karu , 1999】，過去文獻已證明紅光波段(620~780nm)能夠促進DNA與蛋白質的合成、提升細胞的活性與數量，以及幫助傷口的癒合【Karu et al.,1995；Hawkins et al., 1998；

Corazza et al., 2007】；Vinck等人提到利用綠光(480~580nm)刺激，能夠增加纖維母細胞的細胞數量【Vinck et al., 2003】，因此細胞色素C氧化酵素在這些波段可能因吸收能量而被活化，也就是說細胞的生理行為有可能因此被改變或促進。

從文獻中得知影響細胞表現的光照射參數眾多，其中包括光照波長、能量、功率等，因此本實驗利用紅光652nm、黃光 590nm 以及藍光 415nm 三種不同波長的發光二極體來進行光照，並探討在不同刺激能量及輸出功率刺激下，對於細胞行為表現在不同培養天數下之影響。

(13)

2-1 光刺激對細胞粒線體活性之影響

實驗前先將濃度為1×10⁵ cells / ml 的老鼠骨細胞(UMR-106)植入培養皿中進行培養，讓骨細胞貼附24小時後開始進行光照實驗，並於光照後第1~5天利用MTT assay 探討細胞粒線體活性，在不同波長與能量刺激下之變化(光照功率皆為3.89J/cm²)。實驗組與控制組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均(N0與Ni分別為為控制組及實驗組之MTT吸光值除以細胞數量後所得的數值，即 N0=OD^控制組/cell number、Ni=OD^實驗組/ cell number )，數據中的比值是將光照實驗組除以未照光的控制組之平均值(Ratio= Ni / N0)，圖中之P-value 則為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

從圖四光照後一天所量測的細胞活性得知，利用較低能量0.1J/cm²區域照射，在此光照能量的三種波長刺激下，皆並未對細胞活性產生顯著性的影響。能量提升至 0.5~5J/cm²的時候發現，細胞活性在三種波長照射下開始有明顯的提升效果，尤其在能量0.5 J/cm²時，藍光的刺激對有粒線體活性最好的促進表現( P<0.01 )。當光源刺激的能量增加至1~5J/cm²時得知，紅光與黃光照射下的細胞活性有最佳的促進效果，同時活性也隨著能量增多而有所提升。但是當能量提升至10~20 J/cm²的時候，發現細胞的活性都有明顯被抑制，而且能量越高，對於細胞活性的抑制程度也相對越大，過去學者也曾經利用高能量9.375~12.5 J/cm²的紅外光(1064nm)，刺激人類牙周纖維母細胞，發現細胞的活性同樣也有明顯被抑制的現象發生【Chen et al., 2005】，所以認為細胞在高能量刺激下，反而會有負面的效果。因此在不同光照波長與不同刺激能量照射下，所影響細胞粒線體活性的機制，將在下面段落一起做討論。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.1 0.5 1 5 10 20

Energy ( J/cm^2 )

Ratio of Cell Viability

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* * **

**

*

* ****

**

* *

** P<0.01

* P<0.05

*

圖四光照後第 1 天進行波長與能量對骨細胞粒線體活性影響之量測。

數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

(14)

圖五分別為光照後第三天與第五天，波長與能量對骨細胞粒線體活性影響之量測。結果發現細胞活性在光照後第三、五天的趨勢彼此相仿，在低能量 0.5 J/cm²刺激下，三種波長對細胞活性都有明顯促進效果( P<0.05 )，表示細胞在光刺激後的生理表現能有持續性存在，其中又以藍光對於細胞活性的提升效果較其他兩種波長最佳，

此結果與照射一天後所得之趨勢相同。當能量提升至5 J/cm²的時候發現，三種波長對於細胞活性的提升也有相當明顯的促進效果，特別是在黃光的刺激下有最好的表現。實驗中利用高能量10 J/cm²刺激，發現光照後第三、五天細胞的活性似乎有被抑制，推測可能的原因是高能量照射細胞時，對於粒線體或細胞結構有破壞的影響，造成後來細胞在生長的過程中，細胞活性發展來的比未光照的細胞慢，顯見光刺激無論是抑制或是促進的效果都具有延續性。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 5 10

Energy ( J/cm^2 )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* **

**

*

**

*

**

** P<0.01

* P<0.05

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 5 10

Energy ( J/cm^2 )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

*

**

*

**

*

**

*

**

** P<0.01

* P<0.05

圖五波長與能量對骨細胞粒線體活性影響之量測(上圖: 光照後第 3 天；下圖: 光照後第 5 天)。數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

(15)

綜合光刺激細胞活性之影響發現，細胞在實驗中所使用的三種波長照射下，當所光照能量為0.1J/cm²時，推測可能是由於所使用的光照能量甚低，無法提供光受體電子足夠的能量來進行提昇與傳遞，所以細胞活性似乎都沒有明顯太大的改變。但是若用太高的光刺激能量(10J/cm²)照射細胞，推測由於電子獲得太多能量時，會在細胞中產生過多活性氧物種(Reactive oxygen species，ROS)，其自由基離子反應性高且穩定性差的，可能會與金屬離子結合，並抑制以金屬離子為中心的酵素活性，阻礙電子在粒線體呼吸鏈中的傳遞，降低細胞的活性【Karu , 1999】。

當所使用的三種波長刺激能量提升到 0.5~5 J/cm²時，發現細胞粒線體活性相較於未光照的控制組，皆有相當明顯的提升作用( P<0.05 )，特別在藍光波段的最佳能量為0.5 J/cm²，而紅光與黃光區的最佳照射能量則為5 J/cm²。過去文獻曾使用不同波段的光源刺激人類子宮頸部腫瘤細胞(HeLa Cell)【Karu et al., 1984】，發現細胞在短波長的藍光刺激下，利用較低能量(10 J/m²)即可促進核酸的合成，而在黃光與紅光等較長波長照射下，需要將能量提升至100 J/m²才有較明顯的效果。因此我們推測光受體分子內的官能基對於吸收波段有不同的敏感度，故所需求的能量程度也不同，由資料中發現光敏素(Porphyrin)在藍光區的莫爾吸收係數約為 10⁴~10⁵[M^-1cm^-1]，屬於強吸收

【Milgrom,1997】，但是過渡金屬銅離子對於所吸收之波段屬於弱吸收，其之莫爾吸收係數皆小於10³[M^-1cm^-1]【Skoog,1997】，換言之，細胞光受體分子在專一波長吸收下，由於細胞內細胞色素C 氧化酵素( Cytochrome C Oxidase )的光敏素(Porphyrin)，

對於實驗中所使用藍光波段有較敏感的吸收，因此利用足夠的低能量進行光照即可提升π-π* 電子能階越遷；反之，在紅光與黃光波段刺激下，所影響的光受體分子的過渡金屬對光源的吸收敏感度較低，因此必須提高照射能量才能更有效幫助電子的越遷。

2-2 光刺激對細胞粒線體活性之延遲效應

實驗前先將濃度為1×10⁵ cells / ml 的老鼠骨細胞(UMR-106)植入培養皿中進行培養，讓骨細胞貼附24小時後開始進行光照實驗，並探討細胞粒線體於光照後1~7天，

在不同波長與能量刺激下之持續效應(光照功率皆為3.89J/cm²)。實驗組與控制組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均(N0與Ni分別為為控制組及實驗組之MTT吸光值除以細胞數量後所得的數值，即N0=OD^{控制組}/cell number、Ni=OD^實驗組/ cell number )，數據中的比值是將光照實驗組除以未照光的控制組之平均值(Ratio= Ni / N0)，圖中之P-value 則為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

圖六分別是利用光照為 0.5 及 5 J/cm²的中低能量刺激細胞，並觀測粒線體活性的持續效果。從數據中發現，三種波長在中低能刺激下，對於骨細胞活性皆有明顯的提升，可能原因如 4.2.1-1 所述，細胞能夠吸收這些專一的波長，在藍光波段下利用 0.5 J/cm²即可提升電子的能階與傳遞，因此細胞活性相較於紅光與黃光，在光照後第

(16)

一天就有較明顯的促進作用；至於在紅光與黃光波段下的光能較低，所以將能量提升至5 J/cm²刺激下，電子能階才有更明顯的提升效果，所以紅光和黃光的促進作用則比藍光好，尤其在中能量5 J/cm²刺激下，又以黃光對於細胞的的促進效果最佳。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Culture Time After Irradiation ( Days )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (415nm)

**

** **

*

** **

** *

** P<0.01

* P<0.05

* *

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

** *

*

**

* **

*

* *

** P<0.01

* P<0.05

*

圖六光刺激骨細胞粒線體活性之延遲影響(上圖:光照能量 0.5 J/cm²；下圖: 光照能量 5 J/cm²)。數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

因此在粒線體活性的延遲效應結果中發現，細胞在適當光刺激參數(中低能量)照射後前三天，相較於未照光的控制組之細胞活性大多都有慢慢明顯的增加，尤其三種波長在中低能量光照後第三天皆有最佳的表現，不過當細胞在照射後第五天與第七天時則發現，粒線體活性值皆趨於較平緩的定值，尤其在光照後第七天實驗組與控制組的粒線體活性比值有接近的趨勢，甚至促進細胞活性的影響已經消失，過去也有文獻利用能量為1 J/cm²的紅光雷射(632.8nm)刺激人類類骨細胞發現，粒線體活性隨著培養時間增多而增加，在光刺激後第十四天有最大值，之後活性也趨於緩和【Arisu et al.,

(17)

2006】，因此推斷細胞經由光刺激後，前期能夠提升粒線體中光受體分子的能階，不但促進電子在呼吸鏈中的傳遞，同時促進粒線體產生 ATP 及提高細胞的活性，但是當光刺激結束的後期，光受體分子的電子沒有光能的刺激，而無法越遷至較高能階的激發態，因此與未照光的控制組相比，光照後的細胞活性會隨著培養時間增加，之後慢慢趨於平緩。

由圖七發現，細胞在三種波長高能量10 J/cm²刺激下，於光照後第一天，粒線體活性相較於未光照的控制組皆有受到抑制的現象產生，如上面章節所述，有可能利用太高的光刺激能量(10J/cm²)照射細胞，細胞會產生過多自由基離子，其反應性高且穩定性差的，導致細胞活性或結構遭受抑制及破壞，因此細胞在高能量光照後的活性，

皆來的比沒有光刺激的控制組差。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* * *

*

* * **

** P<0.01

* P<0.05

*

* *

圖七光刺激骨細胞粒線體活性之延遲影響，光照細胞之能量為 10J/cm²。數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

2-3 光刺激對細胞蛋白質分泌之影響

實驗前先將濃度為1×10⁵ cells / ml 的老鼠骨細胞(UMR-106)植入培養皿中進行培養，讓骨細胞貼附24 小時後開始進行光照實驗，並於光照後第1~5天探討細胞蛋白質分泌，在不同波長與能量刺激下之變化(光照功率皆為3.89J/cm²)。實驗組與控制組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將所量測之蛋白質濃度對細胞數進行平均(N0與Ni分別為為控制組及實驗組之BCA吸光值除以細胞數量後所得的數值，即N0=OD^控制組/cell number、Ni=OD^實驗組/ cell number )，數據中的比值是將光照實驗組除以未照光的控制組之平均值(Ratio= Ni / N0)，圖中之P-value 則為實驗組與控制組相互比較之參數。

(18)

圖八與圖九為三種波長在不同能量刺激後第1~5 天，細胞所分泌之的蛋白質濃度變化。由細胞粒線體活性測試中發現，在使用低能量 0.1 J/cm²刺激下，可能所提供的能量無法有效增加電子在粒線體中的傳遞，對於細胞活性並沒有明顯的改變，也因此相較於未光照的控制組而言，無法促進細胞產生更多的能量以促使細胞合成更多的蛋白質，此一結果與文獻相較，發現在測定老鼠骨頭膠原蛋白量之合成研究中，利用紅外光904nm 的低能量 0.23J/cm²刺激下，照光的實驗組都與未照光的控制組並沒有明顯的差異【Thawer et al., 1999】。然而，由於細胞內的光敏素能夠在藍光波段(415nm 左右)有較敏感的吸收，因此利用能量 0.5 J/cm²的時候，細胞的活性以及蛋白質的合成在光照後第一天就有明顯提升效果，不過蛋白質分泌在紅光與黃光低能量照射下，

必須等到培養後第三天才有比較明顯的增加。

利用光照能量 5 J/cm²刺激下，細胞在三種波長照射後第1~5 天，皆能有效促使細胞合成蛋白質，其中又以波長較長的紅光與黃光效果較好，推測可能的原因為在此紅光與黃光波段刺激下，能量提升至較高的 5J/cm² 能量才能更有效促進電子傳遞，

並幫助細胞進行蛋白質的合成，過去也有學者發現，利用能量4 J/cm²的紅光(680nm) 發光二極體刺激老鼠骨細胞，能夠促進細胞的增生與蛋白質的合成【Whelan et al., 2001】，但是在短波長藍光中能量 5J/cm²刺激下所影響的光敏素，也許此照射能量對於細胞而言太高因而無法有最佳的表現。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.1 0.5 1 5 10 20

Energy ( J/cm^2 )

Ratio of protein concentration / cell

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* *

** P<0.01

* P<0.05

*

* **

**

圖八光照後第 1 天進行波長與能量對骨細胞蛋白質分泌影響之量測。

數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

同樣由圖八與圖九中也發現，細胞在高能量 20J/cm² 照射後第一天或是高能量 ( 10~20 J/cm²)照射後第三、五天，相較於未照光的控制組而言，明顯有被抑制的現象

(19)

發生，可能的原因推測是由於所使用的刺激能量太大，因此造成細胞內自由基離子的增加，不穩定的自由基離子除了會造成細胞粒線體活性受到抑制，甚至造成核酸或蛋白質的結構被破壞【Karu et al., 1999】，因此細胞所分泌的蛋白質濃度有減少的趨勢。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 5 10

Energy ( J/cm^2 )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

**

** **

*

** P<0.01

* P<0.05

**

*

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 5 10

Energy ( J/cm^2 )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* **

*

* * *

** P<0.01

* P<0.05

圖九波長與能量對骨細胞蛋白質分泌影響之量測(上圖: 光照後第 3 天；下圖: 光照後第 5 天)。數據中將所量測之粒線體活性對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

(20)

2-4 光刺激對細胞蛋白質分泌之延遲效應

實驗前先將濃度為 1×10⁵ cells / ml 的老鼠骨細胞(UMR-106)植入培養皿中進行培養，讓骨細胞貼附24 小時後開始進行光照實驗，並探討細胞蛋白質分泌與增生數量於光照後1~7 天，在不同波長與能量刺激下之持續效應(光照功率皆為 3.89J/cm²)。

實驗組與控制組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將所量測之蛋白質濃度對細胞數進行平均(N0 與 Ni 分別為為控制組及實驗組之 BCA 吸光值除以細胞數量後所得的數值，即N0=OD^控制組/cell number、Ni=OD^實驗組/ cell number )，數據中的比值是將光照實驗組除以未照光的控制組之平均值(Ratio= Ni / N0)，圖中之 P-value 則為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

***

*

** P<0.01

* P<0.05

* *

*

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Culture Time After Irradiation ( Days ) Ratio of protein concentration / cell

Blue (415nm)

Yellow (590nm)

Red (652nm)

^*

* *

*

* * *

*

** P<0.01

* P<0.05

* *

*

圖十光刺激骨細胞蛋白質之延遲影響(上圖:光照能量 0.5 J/cm²；下圖:

光照能量5 J/cm²)。數據中將所量測之蛋白質濃度對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

圖十分別為利用三種波長在中低能量0.5 與 5 J/cm²刺激後，細胞蛋白質濃度在

(21)

第1~7 天的變化。從數據中發現，在低能量 0.5 J/cm²三種波長照射下，細胞的蛋白質濃度在培養第三天後皆有明顯提升的效果，特別是在波長415nm 的藍光效果最佳，

細胞所分泌的蛋白質在光照後第一天就有明顯的增加( P<0.05 )；而在中能量 5 J/cm² 的刺激下，細胞蛋白質濃度增加的情形則在紅光及黃光有最明顯的效果。從圖十也發現，細胞在中低能量光刺激後蛋白質濃度，也隨著培養時間增多，蛋白質濃度特別在光照後第五天會有最佳的表現效果，並於第七天後趨於一定值。圖十一則為利用高能量10J/cm²刺激後，細胞蛋白質濃度於培養第1~7 天的變化，從數據中發現，無論使用哪種波長在能量10 J/cm²照射下，細胞所分泌的蛋白質濃度有明顯被抑制的情形發生，同時相較於未照光的控制組發現，蛋白質濃度似乎並沒有隨著培養天數增多而有所增加，這與細胞粒線體活性在高能量光照後的現象相似。

因此推論在中低能量(0.5~5 J/cm²)的刺激下，本實驗細胞光受體分子能夠吸收適當的波長與能量，有效提昇電子能階並促進電子傳遞，當光照時期粒線體活性能被有效地提升，因此出現較高的活性，但是當光照結束後粒線體將所獲得的光能轉換成細胞所需的化學能，並表現在核酸或蛋白質合成等細胞生理反應，因此在數據中蛋白質增加趨勢會在細胞培養較後期表現出來。而細胞在高能量(10J/cm²)照射下，細胞內會有過多的自由基離子，不但對於粒線體的活性有所抑制，對於核酸或蛋白質結構造成 損害，因此在數據中利用三種波長高能量刺激下，皆會抑制細胞合成蛋白質。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* * *

*

** P<0.01

* P<0.05

* * * * *

圖十一光刺激骨細胞蛋白質之延遲影響，光照細胞之能量為10 J/cm²。數據中將所量測之蛋白質濃度對細胞數進行平均，其比值為光照實驗組除以未照光的控制組之平均值，圖中 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

(22)

2-5 光刺激對細胞增生之影響

實驗前先將濃度為1×10⁵ cells / ml 的老鼠骨細胞(UMR-106)植入培養皿中進行培養，並讓骨細胞貼附24 小時後開始進行光照實驗，並於光照後第1~5天利用探討細胞的增生，在不同波長與能量刺激下之變化(光照功率皆為3.89J/cm²)。實驗組與控制組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將光照實驗之細胞數量，組除以未照光的控制組細胞數量之平均值，圖中之P-value 則為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.1 0.5 1 5 10 20

Energy ( J/cm^2 )

Ratio of Cell Numbers

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

*

* *

** P<0.01

* P<0.05

*

圖十二光照後第 1 天進行波長與能量對骨細胞增生影響之量測。數據中將光照實驗之細胞數量，除以未照光的控制組細胞數量之平均值，圖中之P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

圖十二為光刺激骨細胞培養後第一天，細胞數量增生的表現。比照上面章節探討光刺激對於細胞粒線體活性與蛋白質合成的表現，從數據中可發現光照後第一天的細胞增生表現在低能量0.5 J/cm²的照射下，只有利用波長為415nm 的藍光刺激才有明顯的增加現象( P<0.05 )；當照射能量提升至中能量 5 J/cm²時，利用紅光與黃光刺激下，細胞的數量相較於未照光的控制組也有明顯的提升趨勢( P<0.05 )；實驗中高能量 20 J/cm²的刺激下，三種波長可能對於細胞的活性或是功能有所損害，因此細胞數量有減少的趨勢；由於細胞增生的時間約為20 小時，因此在其他光照參數下細胞增生的影響幅度都不太大。

圖十三分為光刺激骨細胞培養後第三和五天，細胞數量增生的表現。從數據中發現，細胞在中低能量0.5 和 5 J/cm²刺激下，三種波長皆能夠有效促進細胞的增生，

尤其在低能量0.5 J/cm²時候，藍光促進細胞增生的現象最佳，並以光照後第 5 天有最好的表現發生，而細胞在中能量5 J/cm²照射下，紅光及黃光的效果來的比藍光好，

(23)

這些現象與粒線體活性及蛋白質合成，似乎也有相似的趨勢，過去也有學者使用能量 1.2J/cm²的氦氖雷射(630nm)刺激人類骨細胞【Arisu et al., 2006】，或 3 J/cm²的紅光 (780nm)刺激老鼠骨細胞【Fujihara et al., 2006】，皆能夠有效促進細胞貼附與增生，因此認為細胞在適當的波長與能量下進行光刺激，對於細胞的生理表現能夠有促進效果。推測可能的原因如上述章節所說，在適當的藍光波段下可以提升光敏素的電子躍遷，而在黃光及紅光照射下，波長主要被細胞色素 C 氧化酵素的過渡金屬所吸收，

因此適合光生物調節作用的能量在不同波長下也會有所差異；細胞增生表現與蛋白質合成有相同的趨勢，起因於初期粒線體被活化後，細胞能夠產生更多能量，而反映在細胞表現部份則較晚發生。

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 5 10

Energy ( J/cm^2 )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

**

*

**

*

**

*

** P<0.01

* P<0.05

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.5 5 10

Energy ( J/cm^2 )

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

**

*

**

* *

** P<0.01

* P<0.05

*

圖十三波長與能量對骨細胞增生影響之量測(上圖: 光照後第 3 天；下圖:

光照後第5 天)。數據中將光照實驗之細胞數量，除以未照光的控制組細胞數量之平均值，圖中之 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

(24)

在光刺激骨細胞培養後第三和五天，利用高能量 10 J/cm² 照射細胞中得知(圖 4-11)，細胞數量相較於未照光的控制組，皆有明顯被抑制的現象發生，過去也有學者利用能量為10 和 16 J/cm²的紅光氦氖雷射(632.8nm)進行光刺激反應，發現也會抑制人類皮膚細胞的生長【Hawkins et al., 1998】，或利用波段介於紅光及紅外光區的雷射刺激骨母細胞，在高能量10 J/cm²會抑制細胞數量的生長【Renno et al., 2007】，因此推斷不同的細胞在高能量光源刺激下，可能產生過多穩定性差的自由基離子，不但抑制粒線體呼吸鏈中電子的傳遞，同時還可能影響細胞膜結構而失去完整性，造成細胞內部物質的流失，使得細胞膜內的運輸受到破壞或者細胞膜上的酵素失去原有的功能與作用，導致細胞整體的傷害或死亡【Karu , 1999】。

2-6 光刺激對細胞增生之延遲效應

實驗前先將濃度為 1×10⁵ cells / ml 的老鼠骨細胞(UMR-106)植入培養皿中進行培養，讓骨細胞貼附24 小時後開始進行光照實驗，並探討細胞蛋白質分泌與增生數量於光照後1~7 天，在不同波長與能量刺激下之持續效應(光照功率皆為 3.89J/cm²)。

實驗組與控制組量測重複三次以上(n 3)≧ ，數據中將光照實驗之細胞數量，組除以未照光的控制組細胞數量之平均值，圖中之P-value 則為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

圖十四分別為利用中低能量 0.5 及 5 J/cm²刺激後，細胞數量在第1~7 天的變化趨勢。從數據中發現，細胞在三種波長的中低能量刺激下，培養第三天後皆有明顯提升的效果( P<0.05 )，特別是在低能量 0.5 J/cm²的藍光與中能量5 J/cm²的紅光及黃光效果最佳，光照後第一天細胞數量就有明顯的增加效果，並於第五天細胞增生的數量會有最大值，此現象與細胞分泌蛋白質有相仿的趨勢，推斷可能是光照結束後粒線體將獲得的光能轉換成細胞所需的化學能，並在培養後期表現在蛋白質合成與增生等細胞生理反應，而之後細胞的增生比例也隨著培養時間增多而趨於一定值，過去也有學者利用能量為3.82J/cm²的砷化鋁鎵雷射(830nm)，刺激老鼠骨母細胞，研究發現能夠有效促進光照後細胞的增生，並在光照後第 9 天數量趨於一穩定值【Ozawa et al., 1998】。

圖十五分別為利用高能量10J/cm²刺激後，細胞數量在第1~7 天的變化。從數據中發現，細胞數量在三種波長的刺激下，相較於未經過光刺激的細胞而言都有明顯的下降，並且細胞的增生無法隨著培養時間增多而增加，這與細胞活性與蛋白質合成在高能量光照後的現象相似，因此推斷細胞在高能量照射下，粒線體的活性被抑制，或是細胞結構與功能遭受破壞，所以細胞分泌蛋白質或增生表現相對於控制組來的差。

(25)

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

** **

* *

** P<0.01

* P<0.05

**

** *

*

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* * *

*

**

** P<0.01

* P<0.05

*

** **

圖十四光刺激骨細胞增生之延遲影響(上圖：能量 0.5 J/cm²；下圖：能量 5 J/cm²)。數據中將光照實驗之細胞數量，除以未照光的控制組細胞數量之平均值，圖中之 P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

(26)

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1 3 5 7

Blue (415nm) Yellow (590nm) Red (652nm)

* * * * * *

** P<0.01

* P<0.05

* * *

圖十五光刺激骨細胞增生之延遲影響(刺激能量 10 J/cm²)。數據中將光照實驗之細胞數量，除以未照光的控制組細胞數量之平均值，圖中之P 值為實驗組與控制組相互比較之統計參數。

2-7 光刺激對骨細胞形態之影響

圖十六至圖十八為利用不同波長與能量刺激骨細胞，光照後利用光學顯微鏡所拍攝的細胞形態，放大倍率為200 倍(Scale bar : 50µm)。由照片中發現，相較於未照光的控制組，在經由三種波長光源中低能量(0.5 和 5 J/cm²)照射下，細胞形態似乎有較好的延展以及貼附情形，過去有學者使用能量3 J/cm²的紅光雷射(780nm)刺激老鼠骨細胞【Fujihara et al., 2006】，同樣能夠有效促進細胞的貼附狀況；但是當光照能量提升至10 J/cm²的時候，細胞形態略有萎縮的情況發生，過去文獻利用高能量為10 J/cm² 的近紅外光雷射(1064nm)刺激人類類骨細胞，發現細胞的形態也有縮小的趨勢，甚至有細胞無法貼附或是死亡的現象發生【Arisu et al., 2006】。

表三至表五則為在不同波長與能量照射下，利用軟體 Image-J 來計算骨細胞延展面積的改變情形。在數據中發現，細胞在中低能量(0.5 與 5 J/cm²)的刺激下，細胞的延展面積似乎都有增加的趨勢，但是細胞在高能量(10 J/cm²)的刺激下，細胞的面積卻反而縮小，與前面粒線體活性、蛋白質合成以及細胞的增生趨勢相仿，因此推斷當細胞粒線體活性會被增加，除了幫助細胞產生更多的能量，這同時也促進了細胞的生理反應，細胞貼附行為的被促進便是其中之ㄧ，細胞貼附狀態的提升將有助於細胞生長與發展。從文獻中可得知【Qiu et al., 1998】，細胞主要藉由本身所分泌的細胞基質蛋白質來進行貼附，如纖維網蛋白(fibronectin)或膠原蛋白(collagen)，因此在此之細胞貼附行為應與先前之蛋白質分泌互為因果關係，當蛋白質合成的功能被促進時，意味著同樣也會幫助細胞貼附與增生，但是光刺激給予過多的能量時，則會造成細胞蛋白質結構被破壞，導致細胞細胞增生與貼附情況也會受到抑制。

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圖十六紅光(652nm)刺激下，光照後之細胞形態，光照功率為

3.89J/cm²，光照能量為：(a) 0 J/cm² (b)0.5 J/cm² (c)5 J/cm² (d)10 J/cm²，Scale bar : 50µm

圖十七黃光(590nm)刺激下，光照後之細胞形態，光照功率為 3.89J/cm²，光照能量為：(a) 0 J/cm² (b)0.5 J/cm²

(c)5 J/cm² (d)10 J/cm²，Scale bar : 50µm

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