因為在中性環境下，我們沒有看到CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB，有 表現量差異很大的蛋白質，所以我們改在酸性環境下進行二維電泳實 驗。細菌隔夜培養後，20 倍稀釋至新鮮的 LB 培養液 (pH 7.5)中，培 養3 個小時後，再將菌體移至 pH 4.4 的 LB 培養液適應 1 小時，再收 其可溶性蛋白質進行二維電泳。結果發現，在酸性環境下，CG43S3 與CG43S3ΔrcsB
，
有表現量差異很大的蛋白質 (圖十六，圖十七，表 六)。如表六所示，點 772, 972 及 973 在 CG43S3ΔrcsB 的表現量分別 下降2.18, 1.90 及 1.52 倍；而點 817 及 832 則在 CG43S3ΔrcsB 中完全消失。
討論
腸內菌為了順利通過胃部的酸性環境，通常會具備多套的抗酸機 制。在大腸桿菌中，已知最少具有四套 AR 系統：其中第 1 套 AR 系 統在其穩定生長期時表現且受到葡萄糖的抑制，而 RpoS 及 CRP 會參 與調控這套系統；而第 2 至第 4 套 AR 系統則需要特定的氨基酸來執 行功能 (9, 58)；另外，大腸桿菌還具有一組由 12 個基因組成的酸適 應島嶼，大部分的酸適應島嶼基因的表現量會在酸性環境下提高，而 突變掉某些酸適應島嶼基因，則會造成大腸桿菌失去在pH 2 的環境 下存活的能力 (46)。而關於克雷白氏肺炎桿菌抗酸機制的研究，目 前只知道 fur 及 yfiD 基因缺損會降低克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力 (65, 70)，其餘相關機制目前仍不清楚。
Rcs 系統自 1985 年，在大腸桿菌被發現後，目前在大腸桿菌及 沙門氏菌已有相當多的研究；而在克雷白氏肺炎桿菌中，亦有同源基 因存在，但目前 Rcs 系統在克雷白氏肺炎桿菌的研究，只知道其參與 莢膜多醣體的生合成，在 rcsB 基因缺損突變株中，其莢膜多醣體的 生成量會減少 (36)。關於 Rcs 系統的分子活化訊號，目前仍不清楚；
有文獻指出，大腸桿菌在低溫 (20℃)，且存在葡萄糖或高濃度鋅 (1 mM ZnCl2)的環境下，會活化此套系統的表現 (26)；而多種與包膜 壓力有關的因子，及 djlA、lolA、ompG 此三個基因的過量表現，也 會活化此套系統 (10, 12, 14, 15, 34, 37)。我們分析比較克雷白氏肺炎 桿菌、大腸桿菌及沙門氏菌Rcs 系統的基因組成 (gene organization)，
SoftBerry 去比對
三種細菌RcsB 預測的啟動子序列，卻發現可能參與調控的轉錄因子 (transcription factor)不盡相同 (附錄二)，暗示 Rcs 系統在三種細菌中 參與的生理調控可能不完全相同。在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB 的 表現可能會受到 RpoH2, LexA, NagC 及 Ihf 的調控；而在大腸桿菌 中，RcsB 的表現可能會受到 ArgR 的調控；而在沙門氏菌中，RcsB 的表現可能會受到ArgR2, SoxS 及 GcvA 的調控。
近期有文獻指出，在大腸桿菌中，rcsB 基因缺損，會降低其谷氨 酸依賴型抗酸能力 (10)；而克雷白氏肺炎桿菌亦屬於腸內菌，且有 rcsB 的同源基因存在，因此我們懷疑，RcsB 在克雷白氏肺炎桿菌中，
亦與抗酸能力有關；所以我們首先測試，在克雷白氏肺炎桿菌中，
RcsB 是否也與谷氨酸依賴型抗酸能力有關；結果不管是在 CG43S3 或CG43S3ΔrcsB 中，不論是否加入谷氨酸，細菌都無法存活於 pH 2.5 的 M9 培養液中；造成這結果的原因可能為，在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中，沒有類似的抗酸系統存在，所以無法利用谷氨酸來達到抗 酸的能力；同時我們也利用大腸桿菌的 gadABC 基因序列，在已知的 克雷白氏肺炎桿菌CG43 基因體序列搜尋，並未發現同源基因存在，
此結果也支持上述的推論。
如圖一所示，CG43S3ΔrcsB 其抗酸能力較 CG43S3 下降許多，所 以我們推測，弱酸誘導克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力，而RcsB 扮演 必要的角色。如圖二所示，CG43S3ΔrcsA 的抗酸能力並沒有明顯的下 降，所以我們推測，在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB 是形成同型二聚 體，而調控抗酸基因的表現。而酸適應後抗酸能力的提高，有可能是 因為弱酸刺激了RcsB 的表現量，而增加下游抗酸基因的表現；但在
弱酸環境下 rcsB 啟動子的活性，並沒有明顯的增加 (圖三)，所以弱 酸可能活化了 Rcs 系統，因而增加磷酸化的 RcsB，而提高抗酸基因 的表現量。
在弱酸環境下，cfa 及 yfdX 啟動子活性，在 Z01ΔrcsB 中明顯的 降低 (圖五)，可以確認 cfa 及 yfdX 的表現受到 RcsB 的調控。但是，
CG43S3Δcfa 及 CG43S3ΔyfdX 酸適應後的抗酸能力，並沒有明顯下降 (圖九)。我們推測造成CG43S3Δcfa 抗酸能力未下降的可能原因為：
Cfa 的功能為環丙烷脂肪酸 (cyclopropane fatty acid)合成酶，可以將 細胞膜上非飽和脂肪酸轉換成飽和脂肪酸，而降低氫離子通透性，因 而提高抗酸的能力 (58)；而在克雷白氏肺炎桿菌中，可能還有類似 Cfa 功能的因子存在，或是有其他存在於細胞質的抗酸基因，可以將 外界進入菌體內的氫離子排出菌體外，而達到抗酸的目的。而造成 CG43S3ΔyfdX 抗酸能力未下降的可能原因為：在此培養條件下，yfdX 的表現量並不高，所以其缺損突變株並不會看到影響。在靜置培養條 件下，yfdX 的表現量明顯高出許多，而此時 CG43S3ΔyfdX 抗酸能力 則有明顯的下降 (圖十二)。
我們利用生物資訊工具找到的6 個基因當中，有兩個基因 hdeB2 及 hdeD 是屬於大腸桿菌 AFI 中的基因，而這些基因都位於 kvhAS 基 因的兩側；kvhAS 與 evgAS 具有高度的同源性 (39)，且 EvgAS 在大 腸桿菌中，已知與抗酸相關 (40)，而其鄰近尚有 yfdX 基因存在，而 yfdX 亦被報導會受到 EvgA 的正向調控 (45)，因此，我們預測，這 一系列的基因，可能形成克雷白氏肺炎桿菌的酸適應島嶼 (圖十)。
但 hdeB2 及 hdeD-hdeB1，其啟動子在酸適應的情況下，並沒有明顯
的活性 (圖五)，因此我們在靜置培養下，測定這些啟動子的活性，
結果這些啟動子的活性，均有明顯的增加，且同時受到 RcsB 及 KvhA 的調控 (圖十一)。為了確定這些基因的確與抗酸相關，我們建構其 基因缺損突變株，並在上述條件測試其抗酸能力；hdeB1, hdeD 及 hdeB2 基因缺損突變株仍在建構中，yfdX 基因缺損突變株在前述實驗 已經獲得，且其抗酸能力較 CG43S3 下降許多，因此可以確認 yfdX 的確與抗酸相關；我們預測 hdeB1, hdeD 及 hdeB2 基因缺損突變株，
也會影響其抗酸能力；因為 HdeB 為伴隨蛋白 (chaperone)，可以在酸 性環境下保護蛋白質不被破壞，並可以在環境回復為中性時，幫助蛋 白質回復為可溶狀態 (43)；而 HdeD 目前雖然不知其確切功能為何，
如何影響抗酸能力，但有文獻指出，hdeD 基因缺損會降低大腸桿菌 在高菌體密度 (2 x 108 ~ 4 x 108 CFU/ml)的抗酸能力 (46)。而 YfdX 目前也不知其確切功能為何，但在大腸桿菌中，yfdWXUVE 為一操作 子，而目前已知 YfdW (現更名為 Frc)為 formyl-CoA:oxalate CoA transferase，而 YfdU (現更名為 Oxc)為 thiamine-dependent oxalyl-CoA decarboxylase，這兩個酵素為草酸鹽分解代謝的成對 (coupled)酵素，
且反應中會消耗氫離子 (附錄三)；此機制類似大腸桿菌中 AR2 至 AR4 的抗酸機制，利用特定的氨基酸來消耗菌體內的氫離子，而達到 抗酸的目的；而 yfdWXUVE 是否會在酸性環境下提高草酸鹽的分解代 謝，則需作進一步的研究 (64)。而在克雷白氏肺炎桿菌中，YfdX 目 前也不知其功能為何，我們利用網頁 Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)，
也無法比對到任何的保留區域 (conserved domain)；而在克雷白氏肺 炎桿菌基因體中，我們也找到 YfdV 的同源基因，目前 YfdV 預測的
功能為一輸送蛋白 (transporter)，至於在克雷白氏肺炎桿菌中，YfdXV 如何去調控抗酸能力，則需作進一步研究。
YfdX 啟動子的活性，在靜置培養下會大幅升高，我們進一步分 析其啟動子序列，可以發現有一個可能的 ArcA 結合位置存在，而在 大腸桿菌中，已知 ArcA 會調控 yfiD 的表現，而 YfiD 會減低酸性代 謝物的累積 (71)，因此，ArcA 也參與抗酸的調控。而在克雷白氏肺 炎桿菌中，ArcA 是否會參與 yfdX 的表現，則需作進一步研究。但由 本研究結果可知，在靜置培養下，hdeB1, hdeD, yfdX 及 hdeB2 這些抗 酸基因會受到RcsB 及 KvhA 的調控，且 yfdX 亦有可能受到 ArcA 的 調控，這也許與在人體內，大多數環境為氧氣濃度較低的狀態有關，
因此需要較複雜的調控來調控這些抗酸基因的表現。
在二維電泳實驗中，首先在中性環境下，比較分析 CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 的蛋白質電泳圖譜，雖然有找到差異的點，但其差異量 都小於1.5 倍；CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 在中性環境時，莢膜多醣體 的表現，有明顯的差異 (36)，但我們在蛋白質表現電泳圖譜卻沒有 看到差異量很大的蛋白質；這也許是因為，蛋白質表現量有些許差異 即可造成莢膜多醣體表現量的改變，或是蛋白質表現量的差異雖然不 大，但其活性有顯著差異，因此造成莢膜多醣體表現量的改變；也有 可能是因為，我們收取可溶性的蛋白質進行二維電泳，而表現量差異 很大的蛋白質為不可溶的，因此就無法在二維電泳中看到這些蛋白 質。接下來，我們在酸性環境下，比較分析CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 的蛋白質電泳圖譜，分析比較後，可以找到兩個蛋白質 (Match ID:
832, 817)在 CG43S3ΔrcsB 完全消失及三個蛋白質 (Match ID: 772, 972,
973)在 CG43S3ΔrcsB 表現量下降超過 1.5 倍，進一步分析比對，我們 也發現消失的兩個蛋白質，在中性環境下CG43S3 的電泳膠片中也沒 有出現 (圖十七)，所以我們推論這兩個蛋白質必須在弱酸環境且 RcsB 存在的情況下才會表現；而這些蛋白質可能就是造成 CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 在酸適應後，抗酸能力有差異的蛋白質；我們將進 一步鑑定這些蛋白質的 ID，以了解在弱酸適應後，是哪些蛋白質受 到RcsB 的調控，而提高了抗酸能力。
根據本研究得到的結果，我們推論出RcsB 在調控的可能相關機 制 (圖十八)：弱酸會誘導 RcsB 調控未知的蛋白質，而提高抗酸能力。
而靜置培養下會誘導 RcsB 調控酸適應島嶼中的基因 HdeB1, HdeD, YfdX 及 HdeB2 的表現，而提高抗酸能力，同時 KvhA 亦扮演必須的 角色。
Rcs 系統在大腸桿菌及沙門氏菌，目前已有相當多的研究，參與 相當多的生理調控；而在克雷白氏肺炎桿菌中，目前只知其參與調控 莢膜多醣體的生合成。本研究證實，在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB
Rcs 系統在大腸桿菌及沙門氏菌，目前已有相當多的研究，參與 相當多的生理調控；而在克雷白氏肺炎桿菌中，目前只知其參與調控 莢膜多醣體的生合成。本研究證實，在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB