國 立 交 通 大 學
生物醫學研究所
碩士論文
RcsB 蛋白質在克雷白氏肺炎桿菌 CG43
中抗酸能力所扮演的角色
Role of RcsB in acid-resistance in
Klebsiella pneumoniae CG43
研究生：林志桓
Student: Chih-Huan Lin
指導教授：彭慧玲 博士
Advisor: Hwei-Ling Peng, Ph.D
中華民國九十八年八月
August, 2009
中文摘要
已知 Rcs 雙分子訊息傳導系統參與調控細菌體中許多的生理反 應；如同許多腸內菌，此雙分子系統的反應調控蛋白 rcsB 的基因缺 損，會明顯的降低克雷白氏肺炎桿菌CG43 莢膜多醣體的生合成。我 們在此研究中探討：是否如同近期報導的大腸桿菌RcsB 蛋白，克雷 白氏肺炎桿菌 CG43 的 RcsB 也具有抗酸調控的功能，並進一步研究 其調控機制。我們發現：克雷白氏肺炎桿菌 CG43 在弱酸 (pH 4.4)適 應一小時後，其抗酸逆境 (pH 3)能力大幅提高，而 rcsB 基因的缺損 會降低其抗酸能力，但 rcsB 的啟動子活性並不受弱酸的誘導。同時， 我 們 利 用 生 物 資 訊 工 具 在 CG43 基 因 體 序 列 (http://genome.nhri.org.tw/KP/index.php)中，找出六個可能由 RcsB 所 調控的抗酸基因，其中 yfdX, hdeD-hdeB1 及 hdeB2 聚集座落於相對大 腸桿菌的酸適應島嶼 (acid fitness island)；再經 PCR 選殖以 LacZ 來 報告這六個啟動子的活性，結果發現 cfa 及 yfdX 在 rcsB 缺損株的表 現明顯下降；然而，cfa 或 yfdX 基因缺損突變株的抗酸能力，與野生 株差異不大；我們發現只有在靜置培養下，yfdX 的基因缺損才會降低 克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力。而在靜置培養下分析 hdeD-hdeB1,yfdX 及 hdeB2 的啟動子活性，我們發現 rcsB 或 kvhA 的基因缺損都會
降低上列啟動子的活性。最後，我們利用二維電泳比較分析 CG43 和 rcsB 基因缺損株的蛋白質體，結果發現在中性環境下 (pH 7.5)， 沒有看到表現量差異很大的蛋白質點；而在酸適應條件下 (pH 4.4)，
發現有 2 個蛋白質點在 CG43S3ΔrcsB 的二維電泳膠上消失，另有 3 個蛋白質點的表現量，則在 CG43S3ΔrcsB 分別下降了 2.18, 1.90 及 1.52 倍。我們將進一步鑑定其蛋白質 ID，以了解是哪些蛋白質提高 了抗酸能力。綜合以上結果，RcsB 在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 於震 盪培養條件下，會調控未知的蛋白質來提高抗酸能力；而在靜置培養 下，則可能藉由調控基因 hdeD-hdeB1, yfdX 及 hdeB2 的表現來提高其 抗酸能力，同時，位於此可能的酸適應島嶼中的雙分子訊息傳導系統 KvhAS 也參與調控 HdeD, HdeB1, YfdX 及 HdeB2 的抗酸能力。
Abstract
The Rcs two component signal transduction system controls a variety of physiological functions in bacteria. Deletion of the response regulator gene rcsB in Klebsiella pneumoniae CG43, a highly encapsulated clinical isolate, resulted in reduction of the CPS production as reported for many enterobacteria. Recently, an involvement of RcsB in the acid resistance regulation has been reported in Escherichia coli. If K.
pneumoniae RcsB plays a similar role is investigated and the regulatory
mechanism also analyzed in this study. The resistance to acidic stress (pH 3.0) apparently increased for K. pneumoniae CG43 after an adaption under the weak acidic environment (pH 4.4). Deletion of rcsB reduced the bacterial survival under the acid stress treatment. However, the acid adaptation had no inducing effect for the expression of rcsB. Homologous gene search in CG43 genome (http://genome.nhri.org.tw/KP/index.php) using bioinformatic tools revealed six putative RcsB-dependent acid resistance genes. Among them, yfdX, hdeD-hdeB1 and hdeB2 genes were found to be clustered within the putative AFI (acid fitness island). The putative promoters were PCR amplified and cloned into the LacZ reporter plasmid pLacZ15. The activity measurement showed that the expression of cfa or yfdX was reduced in the rcsB deletion mutant. Deletion of cfa or
yfdX had no effect on acid resistance ability of K. pneumoniae. Only
ability could be observed for the yfdX deletion mutant. Thus, the promoter activity of yfdX, hdeD-hdeB1, or hdeB2 was analyzed under static culture. The result showed that deletion of rcsB or kvhA reduced the promoter activity of these genes. Finally, comparative proteome analysis of CG43S3 and CG43S3ΔrcsB using two-dimensional electrophoresis was also employed. No significant change of expression fold was found under the growth at pH 7.5. While under the acidic condition (pH 4.4), 2 protein spots only present on the 2D gel of CG43S3 and 3 proteins with decreased expression level (-2.18, -1.90 and -1.52 fold, respectively) in CG43S3ΔrcsB were observed. The proteins ID will be resolved in the near future. To sum up, RcsB appears to regulate some unknown proteins for acid resistance response under shaking culture. Under static culture with micro-aeration, expression of yfdX, hdeD-hdeB1 and hdeB2 was positively regulated by RcsB to increase the acid resistance activity. Moreover, the 2CS KvhAS located on the putative AFI is probably also involved in regulation of the acid resistance ability conferred by YfdX, HdeD, HdeB1 or HdeB2 in K. pneumoniae CG43.
致謝
2006 年 11 月 29 日，我在交通大學生物科技研究所甄試入學口 試時，碰到了彭慧玲老師，當時老師為其中一位口試老師，不過我落 榜了；之後我再度報考交通大學生物醫學研究所，於2007 年 4 月 17 日口試時，我再度碰到了彭老師。也許這就是所謂的緣分吧，我兩次 口試都碰到了彭老師，放榜後，我順利考上了生物醫學研究所，因為 老師的識人，讓我得以進入彭家這個大家庭，接受老師的指導。 兩年的時間真的過的很快，轉眼間，我即將帶著滿滿的收穫，踏 出校園，步入社會，往自己人生的下一個目標邁進。這兩年的生活， 最感謝的人是我的指導教授彭老師，每週跟老師討論讓我收穫許多， 除了可以練習講出自己對實驗的看法之外，在跟老師討論的過程中， 也對自己的實驗有了新的想法，或是解決一些實驗上的困惑，能夠遇 到這樣一位不可多得的好老師，心中充滿了無限感激。 感謝清華大學張晃猷老師以及張老師實驗室的夥伴，在實驗上給 予諸多的建議及幫助。 感謝長庚大學鄧致剛老師以及交通大學楊昀良老師，在百忙之中 撥冗擔任我的口試委員，用心的修正我論文中的錯誤及指點我實驗中 未曾想過的盲點。 感謝實驗室的大夥，因為有你們，這本論完才可以順利完成，也 因為你們，這兩年的生活才會如此多采多姿。思緒縝密的新耀學長， 在我剛進實驗室時，耐心的指導我，讓我可以順利進行我的研究；永遠年輕的丸子學姊，總是在我失意時給我力量，也給我實驗上許多建 議及幫助；擁有好歌喉的健誠學長，在我實驗遇到瓶頸時，細心的與 我討論，幫我解決問題；溫柔美麗的靜柔及亮亮學姊，時常關心著我 的生活；好同學小珊，總是聽我抱怨東抱怨西，一同分享喜怒哀樂； 積極負責的顗峰及雅雯，不吝嗇的跟我分享一些實驗上的技巧；陽光 運動男孩哲充，耐心的與我討論實驗，義氣的載我去坐客運，還有， 你跳的 SORRY SORRY，實在是堪稱經典中的經典；不愛說話的承 哲，慷慨的分享好吃的五穀雜糧麵包；開朗的佩君及家華，實驗室有 妳們，總是可以聽到豪邁的笑聲；骨子裡帶著諧星特質的朝彥，總是 帶來歡樂；熱心的洗髮精，幫我張羅回家的車票；崴云、品瑄以及豪 君，為實驗室注入新的生命力。因為你們，我的碩班生涯才充滿精彩， 謝謝你們，伴我一同寫下人生美好的一頁。 還有感謝吳東昆老師以及廖光文老師實驗室的成員，無私的提供 我支援，給予我實驗上的幫助。 最後要感謝我親愛的家人，因為你們默默的付出及全力相挺，我 的碩班生涯才會如此順遂。也感謝小欣，妳跟我說的話，我都有聽進 去，都有記在心裡，也因為妳，我才可以順利完成我的論文。 最後，我即將邁向人生的另一段旅程，我會繼續努力，因為機會 是留給準備好的人，與大家共勉！ 志桓 民國九十八年八月一日筆於交通大學竹銘館分子調控實驗室
目錄
中文摘要... i Abstract ... iii 致謝...v 目錄... vii 表目錄... viii 圖目錄... ix 縮寫表... xi 前言...1 材料與方法...6 結果...13 討論...21 參考文獻...27表目錄
表一：本研究所使用的菌株...33 表二：本研究所使用的質體...34 表三：本研究所使用的引子...36 表四：可能由RcsB 所調控的抗酸基因...37 表五：CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB 在中性環境下表現量有差異的蛋白質 ...38 表六：CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB 在酸性環境下表現量有差異的蛋白質 ...39圖目錄
圖一：rcsB 基因缺損降低克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力 ...40 圖二：rcsA 基因缺損對克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力沒有影響 ...41 圖三：rcsB 啟動子的活性不受 pH 值的影響 ...42 圖四：可能由RcsB 所調控的抗酸基因啟動子區示意圖...43 圖五：rcsB 基因缺損降低 cfa 及 yfdX 啟動子的活性 ...44 圖六：建構 cfa 基因缺損突變株...45 圖七：建構 yfdX 基因缺損突變株 ...46 圖八：cfa 或 yfdX 基因缺損對細菌的生長沒有影響 ...47 圖九：cfa 或 yfdX 基因缺損對克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力沒有明顯影響 ...48 圖十：酸適應島嶼...49圖十一：rcsB 或 kvhA 基因缺損降低 hdeB2, hdeD-hdeB1 及 yfdX 在靜置培養下啟 動子的活性...50 圖十二：rcsB, kvhA 或 yfdX 基因缺損降低克雷白氏肺炎桿菌在靜置培養下的抗酸 能力...51 圖十三：不同長度的 yfdX 啟動子在 rcsB 或 kvhA 基因缺損株下的活性 ...52 圖十四：不同長度的 kvhA 啟動子在 rcsB 基因缺損株下的活性 ...53 圖十五：克雷白氏肺炎桿菌在中性環境下的蛋白質表現圖譜...54 圖十六：克雷白氏肺炎桿菌在酸性環境下的蛋白質表現圖譜...55 圖十七：克雷白氏肺炎桿菌在酸性環境下表現量差異很大的蛋白質...56 圖十八：RcsB 在抗酸調控的可能相關機制...57 附錄一：Rcs 系統的訊息傳遞路徑...58 附錄二：Rcs 系統的基因組成及 rcsB 啟動子序列預測的轉錄因子 ...59
附錄三：草酸鹽分解代謝的成對反應及其所需的酵素...60 附錄四：rcsB 基因缺損降低克雷白氏肺炎桿菌對氧化壓力的抗性 ...61
縮寫表
ACN acetronitrile AFI acid fitness island AR acid resistance
ArcA aerobic respiration control regulator ATP adenosine triphosphate
bp base pair
CFU colony forming unit CPS capsular polysaccharide CRP cyclic AMP recepror protein DNA deoxyribonucleic acid
DTT dithiothreitol
Evg Escherichia virulence gene
GABA γ−aminobutyric acid IAA idoacetamide
Kvh Klebsiella virulence gene homologue
LB Luria-Bertani LPS lipopolysaccharide
MALDI-TOF matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight
ONPG ο-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside PCR polymerase chain reaction
Rcs regulator of capsular synthesis SDS sodium dodecyl sulfate
SPI Salmonella pathogenicity island
TCS two component system TFA trifluoroacetic acid
前言
克雷白氏肺炎桿菌 (Klebsiella pneumoniae)為常見的伺機性病原 菌，常造成社區感染及院內感染 (56)。臨床上，克雷白氏肺炎桿菌 常在免疫不全的病人身上造成敗血症、肺炎、尿道感染、腦膜炎，及 特定部位的化膿性感染 (73)。而在台灣的糖尿病病人身上，由肝膿 瘍導致的嚴重併發症則與克雷白氏肺炎桿菌有高度的相關性 (67)。 克雷白氏肺炎桿菌屬革蘭氏陰性菌，外被大量的莢膜多醣體包 覆，使其菌落具有高度的黏性 (1)。這層密集絲狀的莢膜構造包覆在 菌體表面，可保護菌體免受多型態有核顆粒細胞 (polymorphonuclear granulocytes)的吞噬，及血清因子的毒殺作用 (54, 55, 69)。據此多醣 體的多樣構造，可將克雷白氏肺炎桿菌分成77種莢膜血清型 (51)， 以小鼠腹腔注射模式分析顯示：K1及K2血清型具有最高的毒性 (48)；最近的文獻指出：K1及K2血清型的克雷白氏肺炎桿菌與肝膿瘍 的發生有高度的相關性 (72)。除了莢膜多醣體，克雷白氏肺炎桿菌 還具有黏附蛋白、螯鐵系統、脂多醣體 (LPS)及抗血清因子等致病因 子 (56)。 細菌感染成功的關鍵在於其是否有能力可以在不利的環境中生 存及複製，而這些不利的環境存在著時常變動的挑戰，例如：氧氣的 濃度、pH 值的變化，及滲透壓的改變等，而細菌藉由改變基因的表 現來對抗這些挑戰。雙分子系統 (two component system, TCS)廣泛分 佈於所有細菌中，在細菌生理中扮演多樣性的調控角色，例如：壓力抵抗、毒性調控、能量代謝、養分取得，及群體感應 (quorum sensing) 等 (11, 20, 41, 53, 59, 63)。TCS 包含感受蛋白及反應調控子，當感受 蛋白感受到外界特定訊號時，會利用高能的三磷酸腺苷 (ATP)將本身 保留的組氨酸殘基自我磷酸化，之後，此磷酸根會傳給反應調控子上 特定的天門冬氨酸殘基，而被磷酸化的反應調控子，則因結構變化會 提高對特定目標DNA 序列黏合的能力，而調控此基因的表現 (3, 41)。
Rcs (Regulator of Capsular Synthesis)系統亦屬於 TCS 的一種，最 早被發現參與大腸桿菌 (Escherichia coli)莢膜多醣體生合成的調控 (25)。相較於一般典型的 TCS，Rcs 系統除了具有感受蛋白 RcsC、反 應調控子RcsB，還具有包含組氨酸的磷酸根傳遞蛋白 RcsD、附屬調 控子RcsA，及鑲嵌在外膜上的脂蛋白 RcsF。而活化 Rcs 系統的方式 除了可藉由環境中的訊號直接刺激 RcsC 之外，亦可藉由刺激 RcsF， 而將訊號傳遞給 RcsC 後，再活化 Rcs 系統。而當 RcsC 接受到外來 的訊號後，會自我磷酸化組氨酸殘基，再將此磷酸根傳遞給本身的天 門冬氨酸殘基，此磷酸根會再傳遞給 RcsD 上的組氨酸殘基，最後磷 酸化RcsB 上特定的天門冬氨酸殘基。而被磷酸化後的 RcsB，則會形 成 同 型 二 聚 體 (homodimer) ， 或 與 RcsA 形 成 異 型 二 聚 體 (heterodimer)，而分別調控下游目標基因的表現 (附錄一) (8, 41, 42)。 關於Rcs 系統的分子活化訊號，目前仍不清楚；有文獻指出，大 腸桿菌在低溫 (20℃)，且存在葡萄糖或高濃度鋅 (1 mM ZnCl2)的環 境下，會活化此套系統的表現 (26)；而多種與包膜壓力 (envelope stress)有關的因子，及 djlA、lolA、ompG 此三個基因的過量表現，也 會活化此套系統 (10, 12, 14, 15, 34, 37)。在大腸桿菌中，Rcs 系統能
調控至少5%的基因體 (genome) (42, 57)，這些基因包括莢膜多醣體 及鞭毛的生合成 (21, 25)，及一些位於細胞質週緣區 (periplasm)與壓 力反應有關的基因 (16)。另外，RcsB 會藉由調控兩個重組酶 FimB、 FimE 的轉錄來控制第一型線毛的表現 (60)；及藉由調控兩個與細胞 分 裂 有 關 的 基 因 ftsA 、 ftsZ 來 控 制 細 胞 分 裂 (7) 。 在 沙 門 氏 菌 (Salmonella)中，IgaA 則會負向調控 Rcs 系統，避免此系統過渡活化 (22, 23, 44, 68)。RcsB 會在 S. typhi 不同的致病階段，分別調控侵入蛋 白、鞭毛及莢膜多醣體 (Vi 抗原)的表現，進而改變 S. typhi 的侵入能 力 ， 以 適 應 各 階 段 的 不 同 環 境 (2, 66) ； 在 S. enterica serovar Typhimurium 中，Rcs 系統會誘導莢膜的生合成，持續活化 Rcs 系統， 會增加莢膜的生合成，並減弱 S. enterica 對 BALB/C 老鼠的毒性 (24)；而 RcsB 也會藉由調控鞭毛操作子 (flhDC)來抑制鞭毛的表現 (6, 68)；另外 Rcs 系統也會調控下列基因的表現：對老鼠造成持續感染 相關的 ydeI 基因、修飾脂多醣體 lipid A 部分有關的 ugd 基因 (19, 29)、與毒性相關的操作子 srfABC 及毒性基因 SPI-2 (22, 68)；而近期 有文獻指出，在 S. enterica 中，未被磷酸化的 RcsB，亦可正向調控 毒性基因 spvA 的表現 (44)。而在克雷白氏肺炎桿菌的研究中，只知 Rcs 系統參與調控莢膜多醣體的生合成，我們發現克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3ΔrcsB 的莢膜多醣體生成量減少，且其菌落失去黏性 (36)。 腸內菌經過胃部的酸性環境，其抗酸 (acid resistance)能力是造成 後續感染的一個重要因子，因此，腸胃道的致病菌均具備特定的抗酸 機制，使得少量的菌體得以在胃酸環境中生存，進而進入較鹼性的腸 內環境，大量複製而造成感染。目前已知大腸桿菌有四套AR 系統：
第1 套 AR 系統在其穩定生長期 (stationary phase)時表現且會受到葡 萄糖的抑制，已知 RpoS 及 CRP 會參與調控這套系統 (9, 58)；其他 三套 AR 系統則不受到葡萄糖的抑制，但需要特定的氨基酸 (amino acid)來執行其抗酸的功能：第 2 套 AR 系統需要谷氨酸 (glutamate)， 第 3 套 AR 系統需要精氨酸 (arginine)，而第 4 套 AR 系統則需要離 氨酸 (lysine)。這些氨基酸依賴型抗酸系統是利用成對的脫羧酶 (decarboxylase)及轉運蛋白 (antiporter)來達到保護菌體的目的，藉脫 羧酶將氨基酸脫去一個羧基，並消耗菌體內的氫離子 (proton)，提高 菌體內的pH 值，而達到抗酸的目的，而脫羧後的產物再藉由轉運蛋 白運至菌體外。第 2 套 AR 系統的谷氨酸脫羧酶為 GadA 及 GadB， 其轉運蛋白為GadC；第 3 套 AR 系統中的精氨酸脫羧酶為 AdiA，其 轉運蛋白為AdiC；第 4 套 AR 系統中的離氨酸脫羧酶為 CadA，而其 轉運蛋白為CadB (9, 17, 28, 30, 49, 58)。在 2007 年有文獻指出，大腸 桿菌的RcsB 可以調控第 2 套谷氨酸依賴型抗酸系統，rcsB 基因缺損 會大幅降低其谷氨酸依賴型的抗酸能力，同時也降低 gadA 及 gadBC 的表現；然而，經活化 RcsCD 傳導路徑或表現過量的 RcsA 來增加 RcsB 的活性，卻降低該抗酸能力。因此，RcsB 在該抗酸系統扮演雙 向調控的角色 (10)。 除了上述四套AR 系統外，在大腸桿菌的基因體中，尚有一組由 12 個基因組成的酸適應島嶼 (acid fitness island, AFI)，座落於染色體 78.8 min，這 12 個基因分別為 slp, dctR, yhiD, hdeB, hdeA, hdeD, gadE,
mdtE, mdtF, gadW, gadX 及 gadA。在酸性環境下生長時，大部分的
失去在pH 2 的環境下存活的能力 (46)。 克雷白氏肺炎桿菌亦屬於腸內菌，有關其抗酸能力的研究極少； 本實驗室先前研究發現，fur 或 yfiD 基因缺損，會降低克雷白氏肺炎 桿菌的抗酸能力 (65, 70)。但其他關於克雷白氏肺炎桿菌的抗酸機 制，目前則不是非常清楚，相關的抗酸系統是否存在於克雷白氏肺炎 桿菌中，仍需進一步研究。 本研究中，我們希望探討在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中，RcsB 對其抗酸能力是否扮演重要的角色及其調控機制。首先，我們先確定 在克雷白氏肺炎桿菌CG43 中，rcsB 基因缺損是否影響其抗酸能力； 接著利用生物資訊 (bioinformatics)工具，預測可能由 RcsB 所調控的 抗酸基因，其作法為：首先參考大腸桿菌的相關文獻，找出跟抗酸相 關的基因；接著，在已知的克雷白氏肺炎桿菌 CG43 基因體序列 (http://genome.nhri.org.tw/KP/index.php)比對 (blastp)，搜尋上述基因 的 同 源 基 因 ； 並 進 一 步 利 用 網 頁 SoftBerry (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) ， 及 已 知 的 RcsB 結 合 序 列 (GAnnnnnC) (4)，找出可能由 RcsB 所調控的抗酸基因，並建構其啟 動子報告質體，分別在 CG43 及 rcsB 基因缺損突變株中，測定這些 啟動子的活性，確定這些基因是否受到RcsB 的調控；同時，也將藉 二維電泳分析比較 CG43 及 rcsB 基因缺損突變株的蛋白質體，進一 步分離鑑定受 rcsB 基因缺損影響表現的蛋白質。最後，將建構相關 的基因缺損突變株，進而說明這些基因與抗酸的關係及RcsB 在抗酸 調控的機制。
材料與方法
菌株、質體及生長環境
本研究所使用的菌株及質體分別列於表一及表二。克雷白氏肺炎 桿菌CG43 是由長庚紀念醫院林口分院分離的臨床分離株。菌株震盪 或靜置培養於37℃，已加入適當抗生素的 Luria-Bertani [LB：10 g/L 胰蛋白腖 (tryptone)、5 g/L 酵母萃取物 (yeast extract)及 10 g/L 氯化 鈉 (sodium chloride)]培養液或培養基。而使用的抗生素及濃度分別 為：鏈黴素 (streptomycin) 500 μg/ml、氨比西林 (ampicillin) 100 μg/ml、氯黴素 (chloramphenicol) 35 μg/ml、卡那毒素 (kanamycin) 25 μg/ml 及四環黴素 (tetracycline) 12.5 μg/ml。
基因重組技術
基因重組實驗參考標準流程 (31)。質體 DNA 使用 High-Speed Plasmid Mini Kit (Geneaid)抽取；限制酶及 DNA 修飾酵素分別購置 New England Biolab (Beverly, MA)或 MBI Fermentas (Hanover, MD)， 並且依照供應商建議的方式使用。而 PCR 使用的酵素為 Blend Taq-PLUS- (COSMO)；PCR 產物及 DNA 片段則使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid)抽取。而 PCR 所使用的引子 (primer) 由生工公司 (MDBio)合成並詳列於表三。谷氨酸依賴型抗酸能力評估
本分析方法根據以下文獻並修飾部分步驟 (9)；細菌在含有 0.4% 葡萄糖的LB (LBG)培養液隔夜培養後，1000 倍稀釋至預熱，且含有 0.4%葡萄糖的 M9 (pH 2.5, adjusted with HCl)培養液中，培養液中不加 或加入1.5 mM 谷氨酸，培養 0、0.5、1、2、4 小時後，分別將測試 菌液稀釋至適當濃度並均勻塗布於LB 固態培養基上；存活率是根據 在 0.5、1、2、4 小時後，每毫升存活的菌數 (CFU)比上 0 小時每毫 升的菌數的比值。其他型抗酸能力評估
待測菌株分別採取震盪或靜置培養方式測試抗酸能力；震盪培養 方式根據以下文獻 (27)並修飾部分步驟；細菌在 LB 培養液隔夜培養 後，20 倍稀釋加入新鮮的 LB 培養液中，並再培養 3 個小時，之後將 菌體移至pH 4.4 的 LB 培養液中，適應 1 小時，最後移至 pH 3.0 的 M9 培養液中，培養 45 分鐘或 1 小時；而靜置培養方式為，細菌在 LB 培養液靜置培養 20 小時後，移至 pH 3.0 的 M9 培養液中靜置培養 45 分鐘或 1 小時；之後分別將以上兩種測試菌液稀釋至適當濃度並 均勻塗布於LB 固態培養基上；存活率是根據在 45 分鐘或 1 小時後， 每毫升存活的菌數和0 小時每毫升菌數的比值；每次獨立實驗以三重 覆數據求得平均值及標準差，呈現的數據為三次獨立實驗中具代表性 的一次。啟動子報告質體建構
將各基因預測的啟動子片段或截短片段，利用 PCR 增幅後，接 入yT&A 選殖載體中，再次轉殖至 pLacZ15 (39)報告質體中，使這些 啟動子片段與缺乏啟動子的 lacZ 報告基因黏合，再藉由β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)活性評估，以測定這些啟動子的活性。β-半乳糖苷酶活性評估
本分析方法根據Miller (47)的方法修訂：待測菌株以適當方式培 養後，取 100 μl 的待測菌液，加入含有 900 μl 的 Z buffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mMβ-mercaptoethanol) ， 17 μl 的 0.1% SDS 及 35 μl 的 三 氯 甲 烷 (chloroform)的混合液中，並於 30℃水浴槽靜置 10 分鐘，再加入 200 μl 的 4 mg/ml 的 ONPG，混合均勻後，靜置於 30℃水浴槽直到黃色 清晰可見，最後，再加入500 μl 1 M Na2CO3以終止反應，最後，使 用分光光度計 (Spectronic 20 Genesys)讀取在波長 420 nm 下的吸光值 (OD420)；每次獨立實驗以三重覆數據求得平均值及標準差，呈現的數 據為三次獨立實驗中具代表性的一次。
基因缺損突變株建構
基因缺損突變株建構方法採取同源基因互換方式；利用 PCR 增 幅要缺損的目標基因前後約1000 bp 的 DNA 片段，再將此兩片段結 合，並接入自殺性質體pKAS46 (62)中，再將此質體利用電穿孔方式(electroporation) 送 入 E. coli S17-1λpir ； 之 後 ， 利 用 接 合 作 用 (conjugation)將此質體送入克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 中，再利用含 有 ampicillin 及 kanamycin 的 M9 固態培養基選出該質體經由同源互 換作用，而成功插入染色體中的接合體 (transconjugant)；隨機選取該 接合體的 5 顆單一菌落，於 LB 培養液 37℃隔夜培養後，利用 PCR 檢查該質體確實成功插入染色體中；任選一株質體成功插入染色體中 的接合體，於含有streptomycin 的 LB 培養液 37℃培養 8 小時後，稀 釋至適當濃度，並均勻塗布於含有streptomycin 的 LB 固態培養基上， 隔夜培養後，用牙籤隨機挑選至少 50 顆單一菌落，同時劃於含有 streptomycin 或 kanamycin 及 ampicillin 的 LB 固態培養基上，挑選對 streptomycin 具有抗性，且對 kanamycin 及 ampicillin 沒有抗性的菌 落，最後PCR 檢查，帶有預期突變片段大小的菌株即為突變株。
生長曲線量測
細菌在 LB 培養液隔夜培養後，將其稀釋至新鮮的 LB 培養液 (OD600約為 0.15)，再置於 37℃培養，並在不同的時間點測量其在波 長 600 nm 下的吸光值。抗氧化壓力能力評估
待測菌株分別採取震盪或靜置兩種培養方式測試抗氧化壓力能 力；細菌在LB 培養液隔夜培養後，20 倍稀釋至新鮮的 LB 培養液中， 並再培養至OD600為0.6~0.7，之後吸取 1 毫升菌液至乾淨且滅過菌的空試管中，再加入適量的雙氧水 (H2O2)，使其最終濃度為 30 mM， 並培養 35 分鐘；或將細菌在 LB 培養液靜置培養 20 小時後，吸取 1 毫升菌液至乾淨且滅過菌的空試管中，再加入適量的雙氧水，使其最 終濃度為40 mM，並靜置培養 35 分鐘；之後分別將以上兩種測試菌 液稀釋至適當濃度並均勻塗布於LB 固態培養基上；而控制組則為相 同的培養方式但未加入雙氧水；存活率是根據實驗組每毫升所存活的 菌數比上控制組每毫升的菌數的比值；每次獨立實驗以三重覆數據求 得平均值及標準差，呈現的數據為三次獨立實驗中具代表性的一次。
二維電泳實驗
我們分別採取以下兩種方法培養細菌並收取可溶性蛋白質進行 二維電泳實驗；細菌隔夜培養後，20 倍稀釋至新鮮的 LB 培養液 (pH 7.5)中，並再培養至對數中期 (mid-log phase, OD600＝0.6~0.7)；或將 隔夜培養後的細菌 20 倍稀釋至新鮮的 LB 培養液 (pH 7.5)中，再培 養3 個小時，再將菌體移至 pH 4.4 的 LB 培養液適應 1 小時；細菌培 養好後，隨即移至超高速離心瓶，並以超高速 (30000 rpm)離心 30 分 鐘，將菌體離心下來，接下來以wash buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM sucrose，)清洗三次，再以 lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5) 清洗一次；將菌體清洗好後，以3 ml 的 lysis buffer 懸浮菌體，隨即 以反覆冷凍解凍並輔以超音波震碎儀 (sonication)打破菌體，之後再 以超高速 (30000 rpm)離心 40 分鐘，去除不可溶的部分；離心後的上 清液以核酸酶 (DNase, RNase)，37℃作用 45 分鐘，作用完後以 15000的microcon (Millipore)以去除雜質；處理好的樣本以 Bradford 方式 (5) 測定蛋白質濃度，並將 250 μg 的蛋白質定量分裝，分裝好的樣本以 冷凍乾燥法乾燥並冰於-80℃冰箱保存備用。
待要進行二維電泳時，將樣本自-80℃冰箱取出，並以 250 μl rehydration buffer (2 M thiourea, 7 M urea, 2% CHAPS, 1% IPG buffer, 0.002% bromophenol blue, 0.28% DTT)溶解樣本，並以 15000 rpm 離心 20 分鐘以去除不可溶的物質，之後將樣本加入 holder 中，再將 strip (pH 4-7, 13cm)輕輕放入，加入適量的專用礦物油，並蓋上蓋子；再將 holder 放 置 於 IPGphor (GE Healthcare) 進 行 等 電 點 聚 焦 (isoelectric focusing)；待聚焦完畢後，將 strip 小心取出並浸泡於含有 1% DTT 的 equilibration buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS, 0.002% bromophenol blue)15 分鐘，再將 strip 移至含有 2.5% IAA 的 equilibration buffer 浸泡 15 分鐘；將 strip 處理完畢後，直接以 12.5％的聚丙烯酰胺膠體 (polyacrylamide gel)進行二維電泳。電泳完 畢後，以 Sypro Ruby (Invitrogen)染色，再以 Typhoon 9200 (GE Healthcare)進行掃瞄。
二維電泳膠片分析比對
電泳膠片利用ImageMaster 2D platinum 6.0 (GE Healthcare)軟體 進行蛋白質點的偵測、膠片配對及蛋白質點的定量，並使用 student
t-test 來比較 CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 膠片上蛋白質點的相對體積
膠內酵素分解 (in-gel digestion)
本實驗方法參考以下文獻 (61)，並作部分修飾；將有差異的蛋 白質點從電泳膠片挖下，加入100 μl wash buffer (50％ ACN, 25 mM NH4HCO3)清洗 15 分鐘，移除液體後加入 100 μl 100％ ACN，使膠
體脫水至皺縮狀，移除 ACN 後加入 50 μl 50 mM NH4HCO3浸泡5 分
鐘，使膠體再水化 (rehydration)，之後再加入 50 μl 100％ ACN 混合 均勻並浸泡15 分鐘，移除液體後再加入 100 μl 100％ ACN，使膠體 脫水至皺縮狀，移除溶液並風乾；最後，加入3 μl 含有 20 ng/μl trypsin (promega) 的 25 mM NH4HCO3溶液，並在 4℃靜置 1 小時，使 trypsin
完全進入膠體內，並加入適當體積的溶液 (25 mM NH4HCO3)以避免 膠體乾掉，再將膠體置於37℃隔夜作用後，加入 2 μl 含有 100% ACN 及1％ TFA 的溶液，超音波震盪 10 分鐘，以將胜肽 (peptide)自膠體 中萃取出來，重複以上步驟三次，再將三次所得到的產物混合在一 起，得到的萃取物送至清大生命科學系進行 MALDI-TOF 質譜分析以 鑑定蛋白質。
結果
谷氨酸依賴型抗酸能力測試
在 2007 年有文獻指出，在大腸桿菌中，rcsB 基因缺損突變株， 會大幅降低其谷氨酸依賴型抗酸能力 (10)；因此，我們首先確定在 克雷白氏肺炎桿菌中，rcsB 是否也扮演相關的調控角色。結果發現： 不論是否加入谷氨酸，在pH 2.5 的 M9 培養液培養 0.5 小時後，CG43S3 或CG43S3ΔrcsB 的存活率都相當低，幾乎無法存活。rcsB 基因缺損降低克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力
當測試克雷白氏肺炎桿菌的谷氨酸依賴型抗酸能力時，細菌在 pH 2.5 的 M9 培養液中幾乎無法存活，無法看出差異。因此我們參考 文獻 (27)的方法；在細菌培養好後，先在 pH 4.4 的 LB 培養液適應 1 小時後，再移至pH 3.0 的 M9 培養液中，測試其抗酸能力。結果如圖 一，當細菌經過弱酸的LB 培養液適應後，其抗酸能力大幅提高，而 CG43S3ΔrcsB 其抗酸能力則較 CG43S3 下降許多；而當我們在 CG43S3ΔrcsB 送入會表現 rcsB 的質體 pHY123 後，其抗酸能力則回 復至與CG43S3 相當。rcsA 基因缺損不會影響克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力
因為 RcsB 會與 RcsA 形成異型二聚體，進而調控目標基因的表 現，因此，我們想要確認 RcsA 是否也參與調控抗酸能力。結果如圖二，CG43S3ΔrcsA 其抗酸能力並沒有明顯下降，而與 CG43S3 相當。
rcsB 的表現不受 pH 值的影響
因為 CG43S3 在酸適應後，其抗酸能力明顯提高許多，且 rcsB 與抗酸能力有明顯的相關性，因此，我們懷疑 rcsB 的表現，在酸性 環境下會提高，進而提高CG43S3 的抗酸能力，所以我們利用帶有 rcsB 預測啟動子片段的報告質體pHY064，並在不同 pH 值下測定其活性。 結果如圖三，不論在 pH 7.0, pH 5.5 或 pH 4.4 的條件下，rcsB 的表現 量都非常低，並沒有顯著差異。利用生物資訊工具預測可能由 RcsB 調控的抗酸基因
因為 rcsB 的表現並不會受到 pH 值的影響，所以我們懷疑 rcsB 跟抗酸能力有關，可能是藉由調控下游基因的表現，進而調控克雷白 氏肺炎桿菌的抗酸能力。所以我們利用生物資訊工具預測可能由 RcsB 調控的抗酸基因；首先，我們參考相關文獻 (45, 58)，找出大腸 桿菌中跟抗酸相關的基因，總共挑選出14 個基因 (表四)；該文獻作 者是利用微晶片 (microarray)或基因缺損方式來推測該基因可能與抗 酸有關；接著，利用protein blast 比對已知的克雷白氏肺炎桿菌 CG43 基因體序列 (http://genome.nhri.org.tw/KP/index.php)，共找出 10 個同 源 基 因 ； 進 一 步 利 用 網 頁 SoftBerry (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)分析上述 10 個基因 5 端未轉錄 的序列，確定該序列可能為一啟動子，並在該序列搜尋是否含有RcsB結合序列 (GAnnnnnC) (4)，其中有 8 個基因的啟動子序列包含 RcsB 結合序列，而其中 adiA 及 adiC 可能為氨基酸依賴型抗酸系統，因為 先前實驗發現克雷白氏肺炎桿菌可能沒有類似的抗酸系統，所以我們 先挑選其他 6 個基因出來研究，分別為 cfa, hdeB2, hdeD, ydeP (KPN_01825), yfdX 及 yhiO，其相關敘述列於表四，而基因大小及預 測到的RcsB 結合序列，則如圖四所示。
rcsB 基因缺損降低 cfa 及 yfdX 啟動子的活性
為了確認上述6 個基因是否會受到 RcsB 的調控，我們利用引子 放大其預測的啟動子片段，並接入pLacZ15 (39)中，進而得到帶有該 基因啟動子片段的質體 Pcfa，PhdeB2，PhdeD-hdeB1，PydeP，PyfdX及 PyhiO，
再將上述質體利用接合作用送入Z01 及 Z01ΔrcsB 中；將以上待測菌 株培養好後，先在 pH 4.4 的 LB 培養液適應 1 小時後，再進行啟動子 活性測試。結果如圖五，cfa 及 yfdX 啟動子在 rcsB 基因缺損的條件下， 其活性會較野生菌株低，而其他 4 個基因的啟動子活性，則沒有看到 明顯差別。
建構 cfa 及 yfdX 基因缺損突變株
因為 cfa 及 yfdX 啟動子活性會受到 RcsB 的調控，且其在大腸桿 菌中與抗酸相關，所以我們想確認，在克雷白氏肺炎桿菌CG43 中， cfa 及 yfdX 是否也與抗酸相關，所以建構其基因缺損突變株。利用 PCR並 接 入 自 殺 性 質 體 pKAS46 (62) 中 ， 分 別 得 到 質 體 pCH014 及 pCH015，再利用接合作用分別將質體送入克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 中，利用同源互換作用而得到基因缺損突變株。引子 CH028/CH031 用來確認 cfa 基因缺損突變株，而引子 CH024/CH027 則用來確認 yfdX 基因缺損突變株 (圖六，圖七)。
cfa 或 yfdX 基因缺損不會影響細菌的生長
在獲取 CG43S3Δcfa 及 CG43S3ΔyfdX 突變株後，我們首先確認cfa 或 yfdX 基因缺損是否會影響細菌的生長。結果如圖八，cfa 或 yfdX
基因缺損均不會影響細菌的生長。
cfa 或 yfdX 基因缺損不會影響克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力
在確認 cfa 或 yfdX 基因缺損不會影響細菌的生長後，我們測試 cfa 或 yfdX 基因缺損是否會影響細菌的抗酸能力。結果如圖九，不論 是CG43S3Δcfa 或 CG43S3ΔyfdX，其抗酸能力均沒有明顯下降，而與 CG43S3 相當。在克雷白氏肺炎桿菌中預測相對酸適應島嶼的基因組
利用生物資訊工具預測到的抗酸基因中，hdeB1, hdeB2 及 hdeD 均屬於大腸桿菌中酸適應島嶼的基因，且其均位於 kvhAS 的兩側；根 據序列比對分析結果，kvhAS 與 evgAS 具有高度的同源性 (39)，而 EvgAS 在大腸桿菌中，已知與多重抗藥性、抗酸及抗熱相關 (13, 40,
50)；所以我們預測 kvhAS 此套 TCS，亦與抗酸有關，且與鄰近的抗 酸基因，形成克雷白氏肺炎桿菌的酸適應島嶼 (圖十)。
rcsB 或 kvhA 基因缺損降低 hdeB2, hdeD-hdeB1 及 yfdX 啟動
子的活性
因為酸適應島嶼的基因 hdeB2 及 hdeD-hdeB1，其啟動子在有氧 且經過酸適應的情況下，均沒有明顯的活性 (圖五)，因此我們在靜 置培養下，測定這些基因啟動子的活性；同時，並確認這些啟動子的 表現是否會受到 kvhA 的調控。結果如圖十一，hdeB2, hdeD-hdeB1 及
yfdX 啟動子的活性，在靜置培養下，均有明顯的增加，且同時受 rcsB
及 kvhA 基因缺損的影響。
rcsB, kvhA 或 yfdX 基因缺損降低克雷白氏肺炎桿菌在靜置培
養下的抗酸能力
因為 rcsB 或 kvhA 基因缺損，均會降低 hdeB2, hdeD-hdeB1 及 yfdX 在靜置培養下啟動子的活性，所以我們測定 rcsB 或 kvhA 基因缺損， 是否會影響克雷白氏肺炎桿菌在靜置培養下的抗酸能力；同時，因為 yfdX 在靜置培養下，其啟動子活性有明顯的增加，所以我們也測定 yfdX 基 因 缺 損 ， 是 否 也 會 影 響 其 抗 酸 能 力 。 結 果 如 圖 十 二 ， CG43S3ΔrcsB, CG43S3ΔkvhA 及 CG43S3ΔyfdX
，
其在靜置培養下的抗 酸能力，均較CG43S3 低；而當我們在 CG43S3ΔrcsB 送入會表現 rcsB 的質體 pHY123 後；或是在 CG43S3ΔkvhA 送入會表現 kvhA 的質體pKvhAcPP 後，其抗酸能力均有回復的現象。
截短的 yfdX 啟動子依然受到 RcsB 及 KvhA 的調控
因為 yfdX 啟動子的活性同時受到 RcsB 及 KvhA 的調控，而參考 圖四的結果及相關文獻 (32)，可知其啟動子序列有 4 個可能的 RcsB 結合位置及1 個可能的 EvgA 結合位置；為了確定這些可能的結合位 置是否有其功能存在，我們建構不同長度的啟動子序列，並在 Z01, Z01ΔkvhA 及 Z01ΔrcsB 中，測定這些啟動子的活性。結果如圖十三， 當我們將第一個可能的 RcsB 結合位置去除，或是截短部分的 EvgA 結合位置，其活性依然都受到RcsB 及 KvhA 的調控。kvhA 啟動子的活性不受 RcsB 的調控
因為 hdeB2, hdeD-hdeB1 及 yfdX 其啟動子的活性，同時受到 RcsB 及 KvhA 的調控，所以我們懷疑 RcsB 可能經由調控 KvhA 的表現， 進而調控 hdeB2, hdeD-hdeB1 及 yfdX 的表現；所以我們在 Z01 及 Z01ΔrcsB 中，測定不同長度的 kvhA 啟動子活性。結果如圖十四，PkvhA-1
及PkvhA-2其啟動子活性，在CG43 及 rcsB 基因缺損突變株中沒有明顯
差別，而包含部分KvhA 編碼區 (coding region)的啟動子 pA15, pF15, pE15，則沒有明顯活性。
克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB 在中性環境下
沒有表現量差異很大的蛋白質
另 外 ， 我 們 同 時 利 用 二 維 電 泳 ， 分 析 比 較 CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 的蛋白質體，以找出由 RcsB 調控的蛋白質。細菌隔夜 培養後，20 倍稀釋至新鮮的 LB 培養液 (pH 7.5)中，並再培養至對數 中期 (mid-log phase, OD600＝0.6~0.7)，再收其可溶性蛋白質進行二維 電泳，我們首先使用pH 3-10 的 strip 進行二維電泳，結果發現，大部 分的蛋白質都位於 pH 4-7 的位置，因此為了增加解析度，我們改用 pH 4-7 的 strip 進行實驗。結果發現，雖然 CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB 的蛋白質表現圖譜有些差異，但大部份差異量都小於 1.5 倍 (圖十 五，表五)。克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB 在酸性環境下
有表現量差異很大的蛋白質
因為在中性環境下，我們沒有看到CG43S3 與 CG43S3ΔrcsB，有 表現量差異很大的蛋白質，所以我們改在酸性環境下進行二維電泳實 驗。細菌隔夜培養後，20 倍稀釋至新鮮的 LB 培養液 (pH 7.5)中，培 養3 個小時後，再將菌體移至 pH 4.4 的 LB 培養液適應 1 小時，再收 其可溶性蛋白質進行二維電泳。結果發現，在酸性環境下，CG43S3 與CG43S3ΔrcsB，
有表現量差異很大的蛋白質 (圖十六，圖十七，表 六)。如表六所示，點 772, 972 及 973 在 CG43S3ΔrcsB 的表現量分別 下降2.18, 1.90 及 1.52 倍；而點 817 及 832 則在 CG43S3ΔrcsB 中完全討論
腸內菌為了順利通過胃部的酸性環境，通常會具備多套的抗酸機 制。在大腸桿菌中，已知最少具有四套 AR 系統：其中第 1 套 AR 系 統在其穩定生長期時表現且受到葡萄糖的抑制，而 RpoS 及 CRP 會參 與調控這套系統；而第 2 至第 4 套 AR 系統則需要特定的氨基酸來執 行功能 (9, 58)；另外，大腸桿菌還具有一組由 12 個基因組成的酸適 應島嶼，大部分的酸適應島嶼基因的表現量會在酸性環境下提高，而 突變掉某些酸適應島嶼基因，則會造成大腸桿菌失去在pH 2 的環境 下存活的能力 (46)。而關於克雷白氏肺炎桿菌抗酸機制的研究，目 前只知道 fur 及 yfiD 基因缺損會降低克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力 (65, 70)，其餘相關機制目前仍不清楚。 Rcs 系統自 1985 年，在大腸桿菌被發現後，目前在大腸桿菌及 沙門氏菌已有相當多的研究；而在克雷白氏肺炎桿菌中，亦有同源基 因存在，但目前 Rcs 系統在克雷白氏肺炎桿菌的研究，只知道其參與 莢膜多醣體的生合成，在 rcsB 基因缺損突變株中，其莢膜多醣體的 生成量會減少 (36)。關於 Rcs 系統的分子活化訊號，目前仍不清楚； 有文獻指出，大腸桿菌在低溫 (20℃)，且存在葡萄糖或高濃度鋅 (1 mM ZnCl2)的環境下，會活化此套系統的表現 (26)；而多種與包膜 壓力有關的因子，及 djlA、lolA、ompG 此三個基因的過量表現，也 會活化此套系統 (10, 12, 14, 15, 34, 37)。我們分析比較克雷白氏肺炎 桿菌、大腸桿菌及沙門氏菌Rcs 系統的基因組成 (gene organization)， SoftBerry 去比對三種細菌RcsB 預測的啟動子序列，卻發現可能參與調控的轉錄因子 (transcription factor)不盡相同 (附錄二)，暗示 Rcs 系統在三種細菌中 參與的生理調控可能不完全相同。在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB 的 表現可能會受到 RpoH2, LexA, NagC 及 Ihf 的調控；而在大腸桿菌 中，RcsB 的表現可能會受到 ArgR 的調控；而在沙門氏菌中，RcsB 的表現可能會受到ArgR2, SoxS 及 GcvA 的調控。
近期有文獻指出，在大腸桿菌中，rcsB 基因缺損，會降低其谷氨 酸依賴型抗酸能力 (10)；而克雷白氏肺炎桿菌亦屬於腸內菌，且有 rcsB 的同源基因存在，因此我們懷疑，RcsB 在克雷白氏肺炎桿菌中， 亦與抗酸能力有關；所以我們首先測試，在克雷白氏肺炎桿菌中， RcsB 是否也與谷氨酸依賴型抗酸能力有關；結果不管是在 CG43S3 或CG43S3ΔrcsB 中，不論是否加入谷氨酸，細菌都無法存活於 pH 2.5 的 M9 培養液中；造成這結果的原因可能為，在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中，沒有類似的抗酸系統存在，所以無法利用谷氨酸來達到抗 酸的能力；同時我們也利用大腸桿菌的 gadABC 基因序列，在已知的 克雷白氏肺炎桿菌CG43 基因體序列搜尋，並未發現同源基因存在， 此結果也支持上述的推論。 如圖一所示，CG43S3ΔrcsB 其抗酸能力較 CG43S3 下降許多，所 以我們推測，弱酸誘導克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力，而RcsB 扮演 必要的角色。如圖二所示，CG43S3ΔrcsA 的抗酸能力並沒有明顯的下 降，所以我們推測，在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB 是形成同型二聚 體，而調控抗酸基因的表現。而酸適應後抗酸能力的提高，有可能是 因為弱酸刺激了RcsB 的表現量，而增加下游抗酸基因的表現；但在
弱酸環境下 rcsB 啟動子的活性，並沒有明顯的增加 (圖三)，所以弱 酸可能活化了 Rcs 系統，因而增加磷酸化的 RcsB，而提高抗酸基因 的表現量。 在弱酸環境下，cfa 及 yfdX 啟動子活性，在 Z01ΔrcsB 中明顯的 降低 (圖五)，可以確認 cfa 及 yfdX 的表現受到 RcsB 的調控。但是， CG43S3Δcfa 及 CG43S3ΔyfdX 酸適應後的抗酸能力，並沒有明顯下降 (圖九)。我們推測造成CG43S3Δcfa 抗酸能力未下降的可能原因為： Cfa 的功能為環丙烷脂肪酸 (cyclopropane fatty acid)合成酶，可以將 細胞膜上非飽和脂肪酸轉換成飽和脂肪酸，而降低氫離子通透性，因 而提高抗酸的能力 (58)；而在克雷白氏肺炎桿菌中，可能還有類似 Cfa 功能的因子存在，或是有其他存在於細胞質的抗酸基因，可以將 外界進入菌體內的氫離子排出菌體外，而達到抗酸的目的。而造成 CG43S3ΔyfdX 抗酸能力未下降的可能原因為：在此培養條件下，yfdX 的表現量並不高，所以其缺損突變株並不會看到影響。在靜置培養條 件下，yfdX 的表現量明顯高出許多，而此時 CG43S3ΔyfdX 抗酸能力 則有明顯的下降 (圖十二)。 我們利用生物資訊工具找到的6 個基因當中，有兩個基因 hdeB2 及 hdeD 是屬於大腸桿菌 AFI 中的基因，而這些基因都位於 kvhAS 基 因的兩側；kvhAS 與 evgAS 具有高度的同源性 (39)，且 EvgAS 在大 腸桿菌中，已知與抗酸相關 (40)，而其鄰近尚有 yfdX 基因存在，而
yfdX 亦被報導會受到 EvgA 的正向調控 (45)，因此，我們預測，這
一系列的基因，可能形成克雷白氏肺炎桿菌的酸適應島嶼 (圖十)。 但 hdeB2 及 hdeD-hdeB1，其啟動子在酸適應的情況下，並沒有明顯
的活性 (圖五)，因此我們在靜置培養下，測定這些啟動子的活性， 結果這些啟動子的活性，均有明顯的增加，且同時受到 RcsB 及 KvhA 的調控 (圖十一)。為了確定這些基因的確與抗酸相關，我們建構其 基因缺損突變株，並在上述條件測試其抗酸能力；hdeB1, hdeD 及 hdeB2 基因缺損突變株仍在建構中，yfdX 基因缺損突變株在前述實驗 已經獲得，且其抗酸能力較 CG43S3 下降許多，因此可以確認 yfdX 的確與抗酸相關；我們預測 hdeB1, hdeD 及 hdeB2 基因缺損突變株， 也會影響其抗酸能力；因為 HdeB 為伴隨蛋白 (chaperone)，可以在酸 性環境下保護蛋白質不被破壞，並可以在環境回復為中性時，幫助蛋 白質回復為可溶狀態 (43)；而 HdeD 目前雖然不知其確切功能為何， 如何影響抗酸能力，但有文獻指出，hdeD 基因缺損會降低大腸桿菌 在高菌體密度 (2 x 108 ~ 4 x 108 CFU/ml)的抗酸能力 (46)。而 YfdX 目前也不知其確切功能為何，但在大腸桿菌中，yfdWXUVE 為一操作 子，而目前已知 YfdW (現更名為 Frc)為 formyl-CoA:oxalate CoA transferase，而 YfdU (現更名為 Oxc)為 thiamine-dependent oxalyl-CoA decarboxylase，這兩個酵素為草酸鹽分解代謝的成對 (coupled)酵素， 且反應中會消耗氫離子 (附錄三)；此機制類似大腸桿菌中 AR2 至 AR4 的抗酸機制，利用特定的氨基酸來消耗菌體內的氫離子，而達到 抗酸的目的；而 yfdWXUVE 是否會在酸性環境下提高草酸鹽的分解代 謝，則需作進一步的研究 (64)。而在克雷白氏肺炎桿菌中，YfdX 目 前也不知其功能為何，我們利用網頁 Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)， 也無法比對到任何的保留區域 (conserved domain)；而在克雷白氏肺 炎桿菌基因體中，我們也找到 YfdV 的同源基因，目前 YfdV 預測的
功能為一輸送蛋白 (transporter)，至於在克雷白氏肺炎桿菌中，YfdXV 如何去調控抗酸能力，則需作進一步研究。
YfdX 啟動子的活性，在靜置培養下會大幅升高，我們進一步分 析其啟動子序列，可以發現有一個可能的 ArcA 結合位置存在，而在 大腸桿菌中，已知 ArcA 會調控 yfiD 的表現，而 YfiD 會減低酸性代 謝物的累積 (71)，因此，ArcA 也參與抗酸的調控。而在克雷白氏肺 炎桿菌中，ArcA 是否會參與 yfdX 的表現，則需作進一步研究。但由 本研究結果可知，在靜置培養下，hdeB1, hdeD, yfdX 及 hdeB2 這些抗 酸基因會受到RcsB 及 KvhA 的調控，且 yfdX 亦有可能受到 ArcA 的 調控，這也許與在人體內，大多數環境為氧氣濃度較低的狀態有關， 因此需要較複雜的調控來調控這些抗酸基因的表現。 在二維電泳實驗中，首先在中性環境下，比較分析 CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 的蛋白質電泳圖譜，雖然有找到差異的點，但其差異量 都小於1.5 倍；CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 在中性環境時，莢膜多醣體 的表現，有明顯的差異 (36)，但我們在蛋白質表現電泳圖譜卻沒有 看到差異量很大的蛋白質；這也許是因為，蛋白質表現量有些許差異 即可造成莢膜多醣體表現量的改變，或是蛋白質表現量的差異雖然不 大，但其活性有顯著差異，因此造成莢膜多醣體表現量的改變；也有 可能是因為，我們收取可溶性的蛋白質進行二維電泳，而表現量差異 很大的蛋白質為不可溶的，因此就無法在二維電泳中看到這些蛋白 質。接下來，我們在酸性環境下，比較分析CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 的蛋白質電泳圖譜，分析比較後，可以找到兩個蛋白質 (Match ID: 832, 817)在 CG43S3ΔrcsB 完全消失及三個蛋白質 (Match ID: 772, 972,
973)在 CG43S3ΔrcsB 表現量下降超過 1.5 倍，進一步分析比對，我們 也發現消失的兩個蛋白質，在中性環境下CG43S3 的電泳膠片中也沒 有出現 (圖十七)，所以我們推論這兩個蛋白質必須在弱酸環境且 RcsB 存在的情況下才會表現；而這些蛋白質可能就是造成 CG43S3 及 CG43S3ΔrcsB 在酸適應後，抗酸能力有差異的蛋白質；我們將進 一步鑑定這些蛋白質的 ID，以了解在弱酸適應後，是哪些蛋白質受 到RcsB 的調控，而提高了抗酸能力。 根據本研究得到的結果，我們推論出RcsB 在調控的可能相關機 制 (圖十八)：弱酸會誘導 RcsB 調控未知的蛋白質，而提高抗酸能力。 而靜置培養下會誘導 RcsB 調控酸適應島嶼中的基因 HdeB1, HdeD, YfdX 及 HdeB2 的表現，而提高抗酸能力，同時 KvhA 亦扮演必須的 角色。 Rcs 系統在大腸桿菌及沙門氏菌，目前已有相當多的研究，參與 相當多的生理調控；而在克雷白氏肺炎桿菌中，目前只知其參與調控 莢膜多醣體的生合成。本研究證實，在克雷白氏肺炎桿菌中，RcsB 參與抗酸的調控，而其調控的可能相關機制如圖十八所示。另外，本 研究也證明 Rcs 系統與氧化壓力抗性的調控有關，實驗發現 rcsB 基 因缺損突變株，會降低對氧化壓力的抗性 (附錄四)，而其調控的詳 細機制，則須作進一步的研究。至於 Rcs 系統在克雷白氏肺炎桿菌 中，是否還參與其他生理的調控，則需作進一步的研究。
參考文獻
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表一：本研究所使用的菌株
細菌菌株 基因型或相關特性 來源或 參考文獻
E. coli:
JM-109 RecA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 rolA1 thi Δ(lac-proAB)
Laboratory stock S17-1λpir Tpr Smr recA, thi, pro, hsdR－
M＋ [PR4-2-Tc::Mu:Kmr Tn7](pir) (18) K. pneumoniae: CG43 K2 serotype (52) CG43S3 rspl mutant, Smr (52) CG43S3ΔrcsB rcsB mutant in CG43S3, Smr (36)
CG43S3ΔrcsA rcsA mutant in CG43S3, Smr Laboratory
stock
Z01 lacZ mutant in CG43S3, Smr (39)
Z01ΔrcsB rcsB mutant in Z01, Smr Laboratory
stock
Z01ΔkvhA kvhA mutant in Z01, Smr Laboratory
stock
CG43S3Δcfa cfa mutant in CG43S3, Smr This study
表二：本研究所使用的質體
質體 相關特性 來源或
參考文獻
yT＆A PCR cloning vector，Apr Yeastern Biotech
Co.
pKAS46 Suicide vector，rpsL，Kmr Apr (62)
pLacZ15 A derivative of pYC016 (35), containing a promoterless lacZ from K. pneumoniae
CG43S3, Cmr (39)
pRK415 broad-host-range IncP cloning vector, mob＋, Tcr
(33)
pKvhAcTA 698 bp PCR product carrying kvhA cloned into yT&A, Apr (65)
pKvhAcPP BamHI/EcoRI digested fragment of pKvhAcTA cloned into pCPP45, Tcr (65)
pA15 467 bp PCR product carrying putative kvhA promoter cloned into pLacZ15, Cmr (38) pF15 379 bp PCR product carrying putative kvhA promoter cloned into pLacZ15, Cmr (38) pE15 180 bp PCR product carrying putative kvhA promoter cloned into pLacZ15, Cmr (38) pCPP45 broad-host-range cloning vector with the partition region from RK2 plasmid, Tcr Dr. David Bauer at
Cornell University
質體 相關特性 來源或 參考文獻
pHY064 424 bp PCR product carrying putative rcsB promoter cloned into pLacZ15, Cmr Laboratory stock
PhdeD-hdeB1 417 bp PCR product carrying putative hdeD-hdeB1 promoter cloned into pLacZ15, Cmr Laboratory stock
PyfdX 417 bp PCR product carrying putative yfdX promoter cloned into pLacZ15, Cmr Laboratory stock
Pcfa 322 bp PCR product carrying putative cfa promoter cloned into pLacZ15, Cmr This Study
PhdeB2 409 bp PCR product carrying putative hdeB2 promoter cloned into pLacZ15, Cmr This Study
PydeP 330 bp PCR product carrying putative ydeP promoter cloned into pLacZ15, Cmr This Study
PyhiO 396 bp PCR product carrying putative yhiO promoter cloned into pLacZ15, Cmr This Study
pCH012 two about 1kb DNA fragments flanking the yfdX cloned into yT＆A, Apr This Study
pCH015 EcoRI/XbaI digested fragment of pCH012 cloned into pKAS46, Kmr Apr This Study
pCH013 two about 1kb DNA fragments flanking the cfa cloned into yT＆A, Apr This Study
pCH014 EcoRI/XbaI digested fragment of pCH013 cloned into pKAS46, Kmr Apr This Study
pCH017 283 bp PCR product carrying putative yfdX promoter cloned into yT&A, Apr This Study
PyfdX-2 BamHI/BglII digested fragment of pCH017 cloned into pLacZ15, Cmr This Study
pCH018 216 bp PCR product carrying putative yfdX promoter cloned into yT&A, Apr This Study
PyfdX-3 BamHI/BglII digested fragment of pCH018 cloned into pLacZ15, Cmr This Study
PkvhA-1 409 bp PCR product carrying putative kvhA promoter cloned into pLacZ15, Cmr This Study
