全管柱偵測系統之發展

在進行各類的流體實驗如流動注入分析法、液相層析、氣相層 析和毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)時，一般使用銜接於管 柱出口之單通道偵測器來對通過之樣品進行偵測。流經偵測器的樣品 訊號通常以「時間對訊號強度值」的方式記錄，然後再對所得訊號進 行研究與探討。然而，有些科學家認為以上所述的單通道偵測器並非 唯一觀察流體行為之偵測系統，因此開始發展出多通道偵測

(multi-channel detection, MCD)系統，亦即全管柱偵測系統，這種系統 可以瞬間同時的偵測大範圍的樣品訊號，若要完整的研究層析分離行 為的話，全管柱型的偵測器比單通道偵測器更為恰當。

於 1988 年由 Evans 和 McGuffin，發表第一篇有關多通道偵測 系統之研究[54]，利用雙通道偵測器來觀察螢光樣品在毛細管中的流 動行為，藉著觀察分析物在兩偵測點間的趨勢，可排除分析管柱中所 謂的管柱外效應對樣品產生的影響。之後，Rowlen et al.設計了一組 解析度更高的多通道偵測系統[55]，將十四組紫外光感二極體

(UV-sensitive photodiode)架設在玻璃材質的層析管柱外，用來即時觀

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察樣品在層析管柱中進行沖提時的遷移分佈情形，對這種偵測系統，

作者命名其為全管柱偵測(whole-column detection,WCD)系統，但在這 套偵測系統開發出來前，作者在 1986 年便以電腦模擬的方法來表現 全管柱偵測器觀察流體行為的結果[56]，並且提出使用全管柱偵測系 統的優點及其潛力等論述；延續電腦模擬的研究之後，作者著手開發 WCD 系統，並且以實驗數據來證實使用 WCD 的確對高效能液相層 析(high-performance liquidchromatography, HPLC)有相當地優勢與價 值，其列舉出來可能的優勢如下：

 WCD 系統可以真實的記錄樣品於管柱前端、尾端等不同位置的 分佈與流析時間。

 藉由 WCD 系統所獲得的數據，可在尚未進行樣品沖提前幫助準 確預測實驗結果。

 更精確的得到滯留因子。

 可測量移動相與固定相間平衡的速度。

 可透過實驗證明滯留因子在線性層析(linear chromatography)或非 線性層析(non-linear chromatography)過程中的改變狀況。

當 WCD 系統的用法及優勢被提出後，相當多的分離科學者開 始改良這套偵測系統，捨棄先前所使用的分離式光能轉換器(discrete photon transducer)，改以電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)為

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訊號接受器，CCD 為一種陣列式的光電耦合檢像器，上有許多排列 整齊的電容能感應光線，並將影像轉變成數位訊號，在擷取影像時，

有類似傳統底片的感光作用，常被應用於數位相機、光學掃描器與攝 影機等感光元件。CCD 的使用大幅增進了 WCD 系統的效能，其陣列 式的電路排列除了大幅提升偵測器空間解析度外，影像擷取的效果還 可以讓使用者觀察到更生動真實的樣品流動過程，但是由於市售 CCD 尺寸上的限制，所以在這套技術發展初期，是用於觀察小範圍 毛細管內的樣品流動情形，其中又以觀察毛細管導電聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)實驗中樣品流體行為之研究最為常見。

第一次以 WCD 系統來觀察毛細管等電聚焦系統的科學家是 Wu 等人[57]，作者以雷射光源激發管內樣品使其放光，然後以全管柱影 像偵測(whole-column imaging-detection,WCID)技術獲得樣品在毛細 管內的分佈影像，其觀察視窗為 15 mm；隨後，作者以不同的偵測機 制來觀察 CIEF 的實驗結果，以提升 WCID 的應用性，例如螢光偵測 法及吸收光偵測法[58-63]。在 WCD 系統的發展史中，CCD 的裝置與 使用方法多有不同，有些學者是以 CCD 直接收集光訊號然後轉換成 電訊號來進行研究分析，有些則是將 CCD 搭配光學設計的零件來獲 得更寬廣之觀察範圍的訊號，例如使用數位攝影鏡頭來收集樣品移動 影像，Nilsson 等人就是以 CCD 攝影機來記錄毛細管電泳實驗中的

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DNA 片段的螢光影像[64, 65]。甚至有科學家使用 WCD 系統來獲得 部分實驗參數後，透過五公分之觀察視窗，便可預測在 CIEF 實驗中，

分離一百五十種樣品之混合物的分析結果[66]。

在 WCD 技術開始發展後，便有科學家以具透光性之玻璃材質 的層析管柱來進行分離實驗，並使用錄影影像(video-imaging)擷取的 偵測方法來觀察填充固定相後的玻璃管柱內樣品位移的情形，Tamura 等人以 CCD 攝影鏡頭來直接記錄發螢光樣品在逆相高效能層析 (reversed-phase high performance liquid chromatography)玻璃管柱中的 分離過程影像[67, 68]。Guiochon 等人也設計了一套 WCD 系統，用 來收集層析系統中樣品沖提過程中的影像訊號[69-71]，並且指出一般 HPLC 管柱中常用來防止固定相流失的擋板(frit)也會對樣品在空間上 的波形產生影響。以上所介紹的這些 WCD 系統，都是以影像收集的 方法獲得在玻璃管柱內樣品位移過程中的空間濃度分佈，然後再進一 步地將影像結果透過軟體轉換成數位訊號來進行分析處理，這樣的技 術較先前所提的以光能轉換器為訊號收集器的偵測方法，大幅提升了 其空間解析度，並且可以獲得物質遷移過程中的三維資訊：樣品遷移 時間、樣品濃度強度(peak height)、樣品分佈範圍(peak width)，藉由 獲得更多樣品在層析過程中的動態層析資訊(dynamic chromatography information)，將有助於分析管柱內所發生的層析流體行為，進而改善

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實驗條件來達到分離效率提升的目標。

本實驗室組裝設計了一套可同時整合「直接獲取分析訊號」、「高 解析度」、「大範圍觀測視窗」等裝置優勢之 WCD 系統，並設計一耐 高壓玻璃管柱，可大範圍(21 cm)的觀察分析物在一般常用的 HPLC 實驗條件下之分離過程，藉由同時獲得管柱內、外之實驗數據，並可 獲得管柱內空間及時間之實驗數據，對部分有疏失之層析理論進行修 正[9, 73-75]。

而本篇論文將使用此具多項優點的 WCD 系統來觀測樣品於吸 附型管柱之管內吸附機制與濃度分布，藉由同時獲得管柱內、外之實 驗數據，和獲得管柱內空間及時間之實驗數據，來驗證 Pai 的郵包模 型理論。