層析法簡介

層析法(Chromatography)之原理乃是利用不同物質在不同相態 的選擇性分配，以移動相(普遍為液體或氣體)對固定相(大多為多孔的 固體或覆蓋在固體支持物上的液體)中的混合物進行沖提，使混合物 中不同的物質產生不同的移動速度，而達到分離的效果與分析之目 的。

層析法起源於 1903 年[10]，由俄羅斯植物學家 Mikhail Tswett，

首次發表了有關層析的演說，其內容為利用一支填充有細顆粒碳酸鈣 的管柱來分離綠色葉子中的葉綠素與葉黃素等各種植物色素，此實驗 的操作方法是將不同植物色素化合物之混合溶液通過細顆粒之碳酸 鈣管柱，而被分離的物質在管柱中顯現出有顏色的層帶，這也是他命 名此法為「層析法」的由來；由於當時尚未發展出線上偵測(on-line detection)技術，故當時的科學家僅能倚靠肉眼來觀察樣品在管柱中分 離的情形。

接著，層析學便以驚人的速度快速發展；1952 年時，A. J. P.

Martin 和 R. L. M. Synge 更因為在層析領域的偉大貢獻而得到諾貝爾 化學獎。在許多研究中，層析法總是扮演不可或缺的一角，令人驚嘆 的是於 1937 至 1972 年間，共有十二個諾貝爾獎其內容與層析法密不

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可分[3]，由此可見層析法對科學界的重要性。

層析法又可依照層析機制、移動相與固定相種類、操作形式來 分類：

(1) 液相層析機制

 吸附層析(adsorption chromatography)，乃是利用固定相與不同 物質分子吸附能力的差異而達到混合物的分離效果，其機制 為移動相分子與物質分子競爭固定相吸附中心的過程。

 分配層析(partition chromatography)，是層析法中最常使用的 機制，其原理乃是利用不同物質於固定相與移動相間之滯留 程度不同而達分離效果，其機制為物質分子在動靜兩相間之 分配係數不同而達到分離。

 離子交換層析(ion exchange chromatography)，乃是利用不同 物質與固定相之間發生離子交換的能力差異來達到分離目的。

離子交換層析的固定相大多為離子交換樹脂，樹脂分子結構 中存在許多可以電解的活性中心，待測樣品中的離子會與這 些活性中心發生離子交換，達到離子交換平衡，從而在移動 相與固定相之間形成分配。其機制為固定相的固有離子與不 同物質中的離子間相互爭奪固定相中的離子交換中心。

 膠體滲透層析(gel permeation chromatography)，又稱為分子篩

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選層析(size exclusion chromatography)，其中的固定相支持物 是人工合成的交聯聚合物，在水中膨脹後成為凝膠，不同的 交聯度內部孔徑不同，交聯度小的孔徑大，交聯度大的孔徑 小。只有小於孔徑的待測物質分子可通過孔徑，由於小分子 所經過的孔徑最多，因此路徑最長，會最晚被沖提出來。

 親和層析(affinity chromatography)，常用於生物化學實驗中，

其原理乃是利用分子與其配體間特殊且可逆性的親和作用而 達到分離目的。

(2) 移動相與固定相種類

依移動相不同可粗分為氣相層析與液相層析，其中更可以移動相 與固定相兩相細分為氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析 等等。

(3) 操作形式

 管柱層析(column chromatography)，將固定相固定於管柱內，

使樣品沿一個方向而達到分離。

 纸層析(paper chromatography)，利用濾紙做為液體樣品的載體，

再以移動相沖提，以達到分離目的。

 薄層層析(thin layer chromatography)，將適當顆粒大小的吸附 劑於鋁片上鋪層薄層，再以和紙層析相似的方法進行樣品的

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分離和鑑定。

在經過了將近一世紀的研究後，層析法成為分析化學中應用很 廣泛且發展很迅速的一個研究領域，同時，層析法的新技術與新方法 依然層出不窮。

而目前最常為各實驗室所用的層析法為「分配型液相層析法」。

早期的分配型液相層析法，為以直徑 1 到 5 公分，填充固定相長度約 50 至 500 公分之玻璃管柱進行分析操作，而其固定相為塗佈有吸附 性液體之固態顆粒，且為獲得合理之流速，固定相之粒徑需採用 150 到 200 μm 之粒徑較大的顆粒。

在層析法發展初期，科學家們早已了解到減小固定相粒子的尺 寸可以增加管柱效率，並於 1960 年中，發展出利用粒徑 50 μm 固定 相材料所填充而成之管柱，在 1960 年末，製造及應用直徑小至 3-10 μm 的固定相的技術才被發展出來[11-13]。在過去四十年裡，分配型 液相層析法所用之固定相材料已發展出許多改進方式以達更佳的分 離效果，例如從固定相合成與化學修飾法改進[14]、改變固定相間不 同化學鍵結方式以增加選擇性[15] 增加固定相之化學穩定性[16]使 用直徑小於 2μm 之固定相材料[17-20]、以及將所用固定相形狀改為 規則球狀等方式[21-23]，利用以上所發展出之固定相，可大幅減短分 析所需時間，並可提供更佳之分離效率。然而欲使用以上固定相製作

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出分離效率較佳之管柱，則需要可耐高壓條件下操作的儀器設備，因 而，層析管柱便由古典液相層析法中所使用的簡單玻璃管柱轉變為不 鏽鋼管等耐高壓管柱取代[24-25]。同時，線上偵測樣品流動訊號的偵 測系統便也開始發展起來[26]。

除改良固定相材料外，近年來許多研究偏好使用管柱內徑較小 之管柱，以減少沖提溶劑以及固定相材料之使用，增加質量靈敏度，

以及與質譜儀更高的相容性，此種窄內徑(narrow-bore)管柱之內徑約 為 2.1 毫米或 1.0 毫米[27-31]。然而，儘管使用窄內徑管柱具有上述 之優點，卻有文獻指出[32]，在使用窄內徑時，其效率卻不如使用一 般常用的內徑 4.6 毫米之管柱，因此目前分離常用管柱內徑仍以 4.6 毫米為主。

需注意的是，在使用上述所提到的直徑小於 2μm 之固定相材料 時，雖可使分離效率提高並提供較快之分離速度，使得分離所需時間 大幅減短，但此種粒徑較小之固定相，卻會造成分離時背壓(back pressure)增大，根據文獻[33-34]，當粒徑尺寸降低 2 倍，其增加之背 壓會上升 4 倍，甚至在填充效率極佳之管柱，當粒徑尺寸降低 2 倍時，

其增加之背壓則會高達 8 倍[35]；傳統之液相層析儀器設備可提供在 約 414 bar (6000 psi)壓力條件下操作，在使用直徑小於 2 μm 的固定 相時，則需搭配可提供更高壓，約 1000 bar(14500 psi)條件下操作之

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儀器設備[36-39]。除背壓問題外，使用粒徑尺寸小之固定相，其高流 速之優點卻伴隨著溫度升高之問題[19, 40-41]，以及由儀器與管路等 原因產生之管柱外效應(extra-column effect)[42-45]所造成之波峰變寬，

因此，目前液相層析法發展之重點，除致力於提升管柱分離效率，並 提供較短之分析時間外，解決管柱外效應問題，實驗條件之溫度與壓 力控制，以及儀器設備之改良，皆為重要考量因素。

液相層析法一般所用的偵測器，屬於單通道偵測器，通常銜接 於管柱出口，流經偵測器的樣品訊號通常以「時間對訊號強度值」的 方式記錄。在以上所述的耐高壓之不鏽鋼管柱開始使用後，液相層析 管柱就如同個黑盒子似的，將樣品、移動相以及固定相包覆於其內，

分離的結果仰賴樣品流出管柱抵達管柱外偵測器時所接收到的訊號，

然後再對所得訊號進行研究與探討，故樣品在管內的真實流動情形便 無法直接觀察到了。在操作者無法直接觀察到液相層析管柱中的分離 情形之下，爾後所發展出來解釋樣品分離現象的說法，可能因此而產 生錯誤。