第三章、 實驗設計與方法
第三節、 分析方法
一、芝麻素成份分析
利用 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)，分析芝麻 素中的組成。
二、血液分析
A. 分析血漿中葡萄糖濃度：
在芝麻素介入後每週採集尾靜脈血液，測量實驗動物空腹血糖 值。採用商業試劑組，取 10µL 的血清加入 1000µL 試劑(其中含有 phosphate buffer、MOPS buffer、phenol、4-aminophenazone、glucose oxidase 及 peroxidase)混合均勻後於 37℃下作用 10 分鐘，測量 500nm(UNICAM UV-Visible spectrometers,Tokayo,Japan)下吸光值的 變化。
B. 分析血漿中胰島素濃度：
利用 Mercodia Rat Insulin ELISA kid 進行胰島素分析。首先將商
業試劑所賦予的胰島素進行標準曲線的製作(包含的濃度有 0、
劑及血清樣本各25µg 放置於 96well ELISA microplate 中，接著各加 入50µ 的 conjugate enzyme 在室溫下 incubath 兩個小時，以 automatic washer 清洗 6 次後輕拍乾後加入 200µL 的 TMB 作為受質，15 分鐘後，
加入 stop solution 終止反應，利用 ELISA reader 在 450nm 下進行分 析。血清樣本分析出來數據代入標準曲線中與標準值進行比較，求出 實驗老鼠體內胰島素濃度(mg/dL)。
並將空腹血糖及胰島素數據代入 HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment)=fasting insulin (mU/mL) × fasting glucose (mmol/l)/22.5 後，計算體內胰島素抗性情形。當數值越低，表胰島素敏感性越高，
胰島素阻抗性越低。
C. 測量血漿中三酸甘油酯濃度：
以 fully-enzymatic GPO-PAO 法來測定。原理是利用四種酵素：
lipase、glycerol kinase (GK) 、glycerol-3-phosohate oxidase (GPO)、
peroxidase 依序與樣品中的三酸甘油酯作用，造成 3,5-dichloro-2- hydroxyl benzene-sulfonic acid (DHBS)與 4-aminoantipyrine(4-AAP)氧 化結合形一紅色物質(quinoneimine)。利用分光光度計在 500 nm 波長 下測其吸光值，再與標準溶液之吸光值對照比色而得樣品中三酸甘油 酯濃度。分析步驟如下：取血漿與標準液5µL 與反應劑 500 µL 混合
均勻，在20 ~ 25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在 500 nm 波長下 測其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色而求得樣品中三酸甘油酯 濃度。
D.血漿中游離脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)：
採用RANDOX NEFA Kit 來測定，原理是利用三種酵素：acyl CoA synthetase、acyl CoA oxidase、peroxidase 依序與樣品中的游離脂肪酸 作用，生成紫色產物，利用分光光度計在波長550 nm 下，與標準溶 液之吸光值對照比色而得樣品中游離脂肪酸濃度。分析步驟如下：取 血漿與標準液10µL 與 250 µL 的反應劑 A 混合均勻，在 37℃下水浴 10 分鐘，之後再加入反應劑 B，在 37℃下水浴 10 分鐘，以分光光度 計在波長550 nm 波長下測其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色 而得樣品中游離脂肪酸濃度。
E.血漿中總膽固醇 (Total cholesterol)：
採用 enzymatic CHOP-PAP method (Richmond., 1973)，測定原理 為利用三種酵素：cholesterol esterase、cholesterol oxidase、peroxidase 與樣品中的 cholesterol 及 cholesteryl ester 作用，生成淡紅色的
quinonoimine，利用分光光度計在 500 nm 波長下測其吸光值，再與標 準溶液之吸光值對照比色而得樣品中總膽固醇濃度。分析步驟如下：
取血漿與標準液 5µL 與反應劑 500 µL 混合均勻，在 20~25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在波長 500 nm 波長下測其吸光值，與標準溶 液之吸光值對照比色而求得樣品中總膽固醇濃度。
F.高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)：
取大白鼠血漿 200µL 置於超高速離心管中，以密度 1.006 g/mL 之sodium bromide (NaBr) 溶液 300µL 來調整溶液密度，混合後以超 高速離心機80000 rpm，4℃，離心 4 小時，可得密度小於 1.006 g/mL 浮於上層部分200µL，即為極低密度脂蛋白 (VLDL)。再以密度 1.1485 g/mL 之 NaBr 溶液 200µL 來調整溶液密度，混合後以超高速離心機 80000 rpm，4℃，離心 4 小時，可得密度介於 1.006-1.063 g/mL 浮於 上層部分200µL，即為低密度脂蛋白 (LDL)。最後以密度 1.4305 g/mL 之 NaBr 溶液 200µL 來調整溶液密度，混合後以超高速離心機 80000 rpm，4℃，離心 4 小時，可得密度介於 1.063-1.21 g/mL 浮於上層部 分200µL，即為高密度脂蛋白 (HDL)。分別利用 Enzymatic CHOP-PAP 法分析低、高密度脂蛋白膽固醇濃度。
G.血漿中瘦體素(Leptin)
利用 TiterZyme EIA rat leptin kit 進行血漿中 Leptin 濃度分 析。首先將商業試劑所賦予的瘦體素進行標準曲線的製作(包含的濃 度有0、56 pg/mL、113 pg/mL、225 pg/mL、450 pg/mL、900 pg/mL、
1800 pg/mL 及 3600 pg/mL)。之後取的標準試劑及血漿樣本各 100µg 放置於96well ELISA microplate 中，輕拍 plate 使其混合後，將 plate 密封置於37℃下一小時，之後在每個 well 中加入 400µg 的 Wash beffer 反覆沖洗7 次，且最後一次要確定 well 中 Wash buffer 的清除後，除 了Blank 外在每個 well 中加入 100µg Labled antibody solution，再將 plate 密封置於 37℃下 30 分鐘，之後同樣在每個 well 中加入 400µg Wash beffer 進行 9 次反覆沖洗，之後加入 100µg TMB substrate，置於 黑暗室溫中30 分鐘，加入 100µg Stop solution 後，利用 ELISA reader 進行 450nm 的測量，並同時利用 570nm 測量以進行校正。血漿樣本 分析出來數據代入標準曲線中與標準值進行比較，求出實驗老鼠體內 瘦體素濃度(pg/mL)。
三、肝臟脂質分析 A.肝臟脂質萃取：
將冷凍的肝臟取出解凍，依 Folch 氏法(1957)，取 0.5 克的肝臟，
加入6 mL 萃取液[chloroform/methanol = 2/1 (v/v)]，使用組織均質機 (polytron)將肝臟均質化，使用濾紙過濾肝臟均質液到 15 mL 塑膠離 心管中；將萃取液定量至10 mL，加入 2 mL 0.05% CaCl2並震盪均勻，
於4℃、3500 rpm 條件下離心 3 分鐘。離心後，去除上層液，再以萃 取液[chloroform- /methanol/water = 3/48/47 (v/v/v)]定量至 12 mL 並震 盪均勻，同樣於4℃、3500 rpm 條件下離心 3 分鐘。離心後，去除上 層液，並先以 methanol 定量至 9 mL，最後再以萃取液[chloroform- /methanol = 2/1 (v/v)]定量至 10 mL，並儲存於-20℃下保存。
B. 肝臟三酸甘油酯 (Liver triglycerides)：
測量肝臟三酸甘油酯之前處理及萃取方法如上肝臟脂質萃取所 述。
分析步驟如下：分析當日，取肝臟萃取液200µL 至玻璃試管中，
並至於真空乾燥箱中抽乾去除有機溶劑。加入反應劑500 µL 混合均 勻，在20 ~ 25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在 500 nm 波長下測
其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色而求得樣品中三酸甘油酯濃 度。
C. 肝臟膽固醇濃度 (Liver cholesterol)：
肝臟膽固醇之前處理及萃取方法如肝臟脂質萃取所述。
分析步驟如下：分析當日，取肝臟萃取液200µL 至玻璃試管中，
並至於真空乾燥箱中抽乾去除有機溶劑。加入反應劑 500µL 混合均 勻，在20 ~ 25℃下水浴 10 分鐘，以分光光度計在波長 500 nm 波長 下測其吸光值，與標準溶液之吸光值對照比色而求得樣品中總膽固醇 濃度。
D. 肝臟中游離脂肪酸濃度：
將肝臟脂質萃取液稀釋五倍，取 20µL 稀釋後的肝臟脂質萃取液 置於通風廚中使溶劑揮發，之後分析方法同血漿游離脂肪酸。
四、肝臟細胞質中脂質代謝相關酵素活性 A.肝臟細胞質液製備
依 Erickson 等人的方法製備細胞質液(Erickson et al., 1978)。將肝 臟加入5 倍體積且冰冷之 0.1M potassium phosphate(PH=7.4)緩衝液中 (緩衝液中含有 1mM dithio-threitol 以及 10mM nicotinamide)，並在水 浴中以均質機(CAT. No. 099C K64)進行磨碎，於 4℃，12000×g 下離 心15 分鐘，取上清液，在於 4℃，105000×g 下離心 60 分鐘之後，取 得之上清液即為細胞質液，儲存於-80℃待日後分析。
B.肝臟細胞質液蛋白質測定
將細胞質液取出解凍後，以去離子水分別稀釋 6、8、10 倍後將 BSA 標準容易(Prod#23209)依序稀釋濃度成 2、1.5、1、0.75、0.5、
0.25、0.125、0.025 與 0mg/mL，取稀釋樣品及序列稀釋 BSA 標準溶 液25µL 分別注入 96 well ELISA microplate 中，再加入 200µL Working reagent【BSA Protein Assay Reagent A(Prod# 23228)：BSA Protein Assay Reagent B(Prod# 23224)=50：1】，於 37℃下反應 30 分鐘後再於室溫 下冷卻15 分鐘。以 ELISA reader 讀取 562nm 之吸光值。再根據標準 取線來計算肝臟細胞質液樣品的蛋白質濃度。
C.肝臟 Fatty acid synthase(FAS)活性測定 1. 原理
採用 Nepokroeff 等學者之方法(Nepokroeff et al., 1975)，在 37℃
環 境 下 ， 提 供 脂 肪 酸 合 成 酶 作 用 時 所 需 之 基 質 malonyl-CoA 、 acetyl-CoA 及 NADPH 等。利用脂肪酸合成酶反應時需消耗 NADPH 而造成 340nm 吸光值的變化差異，即可求得肝臟細胞質液中脂肪酸 合成酶的酵素活性。
2. 藥品配製
(1)0.2M potassium phosphate buffer(pH=7.1)
取 2.7218g 的 KH2PO4(Sigma-JT-3256)，溶於 100mL 的二次水中，
儲存於4℃備用。
(2)20mM Dithiothreitol
取 0.03085g 的 DTT(Sigma-D5545)，溶於 10mL 的二次水忠，儲 存於4℃備用。
(3)0.25mM acetcyl CoA
取 3.036mg 的 acetyl CoA(Sigma A-2056)，溶於 15mL 的二次水 中，儲存於-20℃備用。
(4)60 mM EDTA-2Na
取 0.2233g EDTA-2Na(Sigma JT-8993-01)，溶於 10Ml 二次水忠，
儲存於4℃備用。
(5)6mM NADPH
取 68.8mg 的 NADPH(Sigma N-7505)，溶於 15Ml 二次水中，儲 存於4℃備用。
(6)0.39 mM Malonyl-CoA
0.0067g 的 Malonyl-CoA(Sigma-M4263)，溶於 20Ml 二次水中，
儲存於-20℃。
3.活性分析
藥品 sample(µL) 0.2M potassium phosphate buffer(pH=7.1) 163.3 20 mM dithiothreitol 16.7 0.25 mM acetyl-CoA 20 60 mM EDTA-2Na 16.7 0.39 mM malonyl-CoA 33.3 Cytosol 33.3 Total 300
根據上表依序加入酵素反應物質於96well ELISA microplate 中混合均 勻後再加入 16.7µL 6 mM NADPH，震盪混合均勻後，反應溫度為
37℃。掃描 340mm 時的吸光值，每 30 秒讀取一次吸光值，共歷時 5 分鐘。
4.酵素比活性計算
酵素比活性(n mole.min mg protein)
=【V/(E×d×p×v】× A△ 340nm/ t△ V=酵素反應液總容積(mL) v=肝臟酵素測定液容積(mL)
p=肝臟酵素測定液蛋白質濃度(mg protein/mL) d=光路徑(光路徑=1cm)
E=光子吸光係數(E=6.2mL/µ mole.cm) A
△ 340nm/ t=△ 單位時間內，酵素反應液於340nm 時的吸光值變化
D.肝臟過氧化體 ACC(acetyl-CoA carboxylase)活性測定 1.原理
依 據 Numa 之 方 法 (Numa et al., 1965) ， 提 供 acetyl-CoA carboxylase 反應所需物質，包括 Acetyl-CoA、NADPH、ATP 及 KHCO3
等 ， 肝 臟 細 胞 質 液 中 acetyl-CoA carboxylase 活性以每分鐘消耗 NADPH 量表示。
3. 藥品配製
(1)50 mM Tris-HCl Buffer (pH=7.4)
取 0.788g Tris-HCl(Sigma-4103)，溶於 100mL 二次水中，以 NaOH 調整pH 值為 7.4，定容到 50mL 於 4℃冰箱中保存。
(2)10 mM MgCl2
取 0.0305g MgCl2(Sigma JT-2444)，溶於 15Ml 二次水中，於 4℃
冰箱中保存。
(3)10 mM potassium citrate
取 0.0324g potassium citrate(Sigma JT-3066)，溶於 10mL 二次水 中，於4℃冰箱中保存。
(4)3.75 mM Glutathione
取 0.0058g Glutathione(Sigma G-4251)，溶於 5Ml 二次水中，於 4℃
冰箱中保存。
(5)12.5 mM KHCO3
取 0.0188g KHCO3，溶於15mL 二次水中，於 4℃冰箱中保存。
(6)0.675 mM bovine serum albumin(BSA)
取 0.22mL BSA(Sigma F-6178)，溶入 5mL 二次水中，於 4℃冰箱
中保存。
(7)0.125 mM acetyl CoA
取 1.1mg acetyl CoA(Sigma A-2056)，加入 10mL 二次水中，於 4℃
冰箱中保存。
(8)10 mM NADPH
0.1115g NADPH(Sigma N-7505)，溶於 15mL 二次水中，於 4℃冰 箱中保存。
(9)3.75 mM ATP
取 0.0517g adenosine 5’-triphosphate(Sigma a-3377)，溶於 25mL 的二次水中，於4℃冰箱中保存。
3.活性分析
藥品 sample(µL) 20mM tris-HCl buffer(pH=7.4) 156.4 10 mM MgCl2 25.1 10 mM potassium citrate 12.4 3.75 mM glutathione 6.3 12.5 mM KHCO3 18.8 0.675mM bovine-serum albumin 6.3
0.125mM acetyl-CoA 12.4 3.75mM ATP 37.5 Cytosol 37.5 Total 331.3
根據上表依序加入酵素反應物質於96well ELISA microplate 中混合均 勻後再加入18.75µL 10mM NADPH，震盪混合均勻後，反應溫度為 37℃。掃描 340nm 時的吸光值，每 30 秒讀取一次吸光值，共歷時 5 分鐘。
4. 酵素比活性計算
酵素比活性(n mole/min/mg protein)
=【V/(E×d×p×v】× A△ 340nm/ t△ V=酵素反應液總容積(mL) v=肝臟酵素測定液容積(mL)
p=肝臟酵素測定液蛋白質濃度(mg protein/mL) d=光路徑(光路徑=1cm)
E=光子吸光係數(E=6.2mL/µ mole.cm) A
△ 340nm/ t=△ 單位時間內，酵素反應液於340nm 時的吸光值變化
五、肝臟粒線體中脂質代謝相關酵素活性 A.肝臟粒線體萃取液製備
依據Bieber 等學者的方法(Bremer et al., 1972)，將肝臟加入 10 倍體積 且冰冷之 buffer 1(pH=7.5)中(buffer 1 中含有 0.25M sucrose 以及 0.2mM EDTA)，並在冰浴中以均質機(CAT. No. 099C K64)磨碎，於 4℃，750×g 下離心 12 分鐘，上述動作重複兩次後去除上清液，並將 沉澱物溶於 5-10 倍體積且冰冷的 buffer2(buffer2 中含有 70mM sucrose、220mM mannitol、2mM HEPES，pH 以及 1mM EDTA)中即 為肝臟粒線體萃取液。
B.肝臟粒線體萃取液蛋白質測定
細胞質液取出解凍後，以去離子水分別稀釋 6、8、10 倍後將 BSA 標準容易(Prod#23209)依序稀釋濃度成 2、1.5、1、0.75、0.5、0.25、
0.125、0.025 與 0mg/mL，取稀釋樣品及序列稀釋 BSA 標準溶液 25µL 分別注入96 well ELISA microplate 中，再加入 200µL Working reagent
0.125、0.025 與 0mg/mL，取稀釋樣品及序列稀釋 BSA 標準溶液 25µL 分別注入96 well ELISA microplate 中，再加入 200µL Working reagent