第四章 材料方法
三、 分析方法
(一) 腎臟、心臟均質液蛋白質濃度測定 1. 原理
以 Lowry et al.(1951)的方法進行蛋白質定量，此方法是利用 coomassie brilliant blue G-250 會與蛋白質結合的特性。G-250 與蛋白質結合後，G-250 的 顏色會從紅色轉變成藍色，此時在 595nm 的波長下會有吸光值。此定量方法 的優點為 G-250 與蛋白質結合所需的時間很短(2 分鐘)，且結合的 G-250-蛋白 質複合物可在溶液中維持較長的時間。具有方便快速而靈敏(sample 量只需 10ng)的優點。
2. 實驗步驟
(1) 配製標準品，濃度配製如【表 4-6】
【表 4-6】蛋白質測定的標準品配製
(2) 將腎臟及心臟均質液稀釋至適當的倍數
(3) 將標準品與均質液樣品取10μl 依序加入 96 孔盤 (4) 稀釋 Bio-Rad 染劑(Bio-Rad 原液：二次水＝1：4) (5) 每個 well 加入200μl 的稀釋染劑
(6) 在室溫下混合，經震盪器處理 5 分鐘
編號 S0 S1 S2 S3 S4 S5
BSA(μl) 0 10 20 30 40 50
二次水(μl) 100 90 80 70 60 50
濃度(mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
27
(7) 用 ELISA reader 測定 OD595nm吸光值
3. 標準曲線與計算方法
將標準品的濃度(0～0.5 mg/ml)設為 X 軸，實驗所測得的標準品吸光值為 Y 軸，即可得此實驗之標準曲線。再將 OD595nm下測得之樣品吸光值，依據標 準曲線以內插法代入方程式(y=ax+b)計算，並乘上稀釋倍數，即可求得蛋白質 的濃度，單位以 mg/ml 表示。
(二) 血清胰島素濃度測定 1. 原理
本實驗是用 Mouse Insulin ELISA 商業套組作分析，利用 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)的原理，先將具有偵測 insulin 的抗體 coating 在 96 孔盤上，加入的樣品中若含有 insulin 就會與之結合在 96 孔盤上，再加入的 peroxidase-conjugated anti-insulin 抗體也會與 insulin 專一性結合並固定在微孔 上 ， 利 用 緩 衝 溶 液 沖 洗 掉 多 餘 樣 品 後 ， 再 加 入 peroxidase 的 受 質 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)作為呈色劑，最後加入 0.5M H2SO4終止反
應並測定 OD450nm 之吸光值，依其不同的吸光值代入標準曲線即可換算出
insulin 濃度。
2. 實驗步驟
(1) 將標準品與血清樣品取10μl 依序加入已 coating 好的 96 孔盤
(2) 每個 well 加入100μl enzyme conjugate solution，於室溫下經震盪器震盪 (700-900 rpm)兩小時
(3) 使用免疫分析微盤清洗機以 wash buffer 清洗 6 次
28
(4) 避光後，每個 well 加入200μl TMB，於室溫下反應 15 分鐘
(5) 每個 well 加入50μl stop solution，經震盪器震盪 5 秒鐘以確保混勻 (6) 用 ELISA reader 測定 OD450nm之吸光值
3. 標準曲線與計算方法
將標準品的濃度(0、0.2、0.5、1.5、3、6.5μg/l)設為 X 軸，實驗所測得的 標準品 OD450nm吸光值為 Y 軸，即可得此實驗之標準曲線。再將實驗測得在
OD450nm 下之樣品吸光值，依據標準曲線以內插法代入方程式(y=ax+b)計算，
即可求得 insulin 的濃度，單位以μg/l 表示。
(三) Homeostasis Model Assessment (HOMA)的計算
單位換算如下：
HOMA-IR index= insulin（μU/mL）× glucose（mmol/L）/22.5
空腹血糖(mg/dl) ×0.0555= mmol/L 空腹insulin(μg/ml)/5808 ×109= pmol/L Insulin (pmol/L)/6.945= μU/L
Insulin (μU/L)/1000= μU/mL
(四) 血清與肝臟中三酸甘油酯(Triglyceride)濃度測定 1. 原理
本實驗利用三酸甘油酯經由 lipoprotein lipase(LPL)水解成甘油及脂肪酸，
甘 油 藉 由 glycerolkinase(GK) 與 ATP 作 用 產 生 ADP 及 glycerol-3-phosphate(G-3-P)，G-3-P 再經 glycerol-3-phosphate oxidase(GPO)氧化 作 用 產 生 H2O2 及 dihydroxyacetone phosphate(DAP) ， 產 物 H2O2 再 與
29
4-aminoantipyrine 及 p-chlorophenol 經 peroxidase 氧化 產生 的產 物為 紅色 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone，最後於 OD546nm 波長下測定紅色產 物的吸光值。
2. 實驗步驟
(1) 血清三酸甘油酯：
取 血 清 樣 品 10μl 以及標準品 10μl 分別加入至含有 pipes buffer、
p-chlorophenol、LPL、GK、GPO、peroxidase、4-aminoantipyrine、ATP、
Mg2+、Na-cholate 及 potassium-hexacyanoferrat(II)之 1mL 溶液中，混合均 勻，於 37℃下反應 5 分鐘後，測定 OD546nm下之吸光值。
(2) 肝臟三酸甘油酯：
取肝臟均質液樣品10μl 與 5μl Triton X-100 混合，經真空抽乾後，再與 10μl 標準品分別加入含有 pipes buffer、p-chlorophenol、LPL、GK、GPO、
peroxidase 、 4-aminoantipyrine 、 ATP 、 Mg2+ 、 Na-cholate 及 potassium-hexacyanoferrat(II)之 1ml 溶液中，混合均勻，於 37℃下反應 5 分鐘後，測定波長 OD546nm下之吸光值。
3. 計算方法
三酸甘油酯濃度(mg/dl)＝樣品吸光值/標準品吸光值×200
(五) 血清與肝臟中膽固醇(Chloesterol)濃度測定 1. 原理
本實驗是利用 choleaterol esterase 先將膽固醇酯分解成膽固醇與脂肪酸，
30
膽固醇再經 cholesterol oxidase 氧化產生 cholestene-3-one 及 H2O2，H2O2 與 phenol 及 4-aminoantipyrine 經 peroxidase 作用下產生紅紫色之 quinoneimine 產 物，測定 OD500nm下之吸光值。
2. 實驗步驟
(1) 血清膽固醇：
取10μl 血清樣品以及 10μl 標準品，分別加入至含有 pipes buffer、phenol、
peroxidase、cholesterol esterase、cholesterol oxidase 及 4-aminoantipyrine 之 1ml 溶液中，混合均勻，於 37℃下反應 5 分鐘後測定 OD500nm下之吸光值。
(2) 肝臟膽固醇：
取肝臟均質液樣品10μl 與 5μl Triton X-100 混合，經真空抽乾後，再取 10μl 標準品，分別加入含有 pipes buffer、phenol、peroxidase、cholesterol esterase、
cholesterol oxidase 及 4-aminoantipyrine 之 1ml 溶液中，混合均勻，於 37℃
下反應 5 分鐘後測定 OD500nm下之吸光值。
3. 計算方法
膽固醇濃度(mg/dl)＝樣品吸光值/標準品吸光值×200
(六) 肝臟中低密度脂蛋白膽固醇濃度(LDL cholesterol)濃度測定 1. 原理
本實驗分兩部分，Reagent 1 為非呈色反應，此試劑會溶出除了低密度脂 蛋白顆粒之外的膽固醇(VLDL、HDL)，並經 choleaterol esterase 將膽固醇酯分 解成膽固醇與脂肪酸，膽固醇再經 cholesterol oxidase 氧化產生 H2O2。Reagent
31
2 為呈色反應，試劑會溶出低密度脂蛋白顆粒中的膽固醇，作用於偶聯劑 2:N,N-bis[4-sulfhobutyl]-m-Toluidine-disodium(DSBmT)而呈色。
2. 實驗步驟
(1) 取肝臟均質液樣品10μl 與 5μl Triton X-100 混合，經真空抽乾後，與 10μl 標準品分別加入300μl 含有 buffer、phenol、cholesterol esterase、cholesterol oxidase、peroxidase 及 4-aminoantipyrine 之 Reagent 1 溶液，並於 37℃下反 應 5 分鐘。
(2) 加入100μl 含有 DSBmT 及 buffer 之 Reagent 2，於 37℃下反應 5 分鐘後測
定 OD546nm吸光值。.
3. 計算方法
低密度脂蛋白膽固醇濃度(mg/dl)＝樣品吸光值/標準品吸光值×標準品濃度 (mg/dl)
(七) 血清、心臟及腎臟中尿酸(Uric acid)濃度測定 1. 原理
本實驗是利用試劑中 uricase 將 uric acid 分解成 allantoin 與 H2O2，H2O2
再 與 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (3,5 DCHBS) 及 4-aminophenazone 經 peroxidase 氧 化 產 生 紅 紫 色 產 物 N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-benzo-quinoneimine，最後測定 OD520nm之 吸光值。
32
2. 實驗步驟
(1) 將血液、心臟及腎臟均質液樣品取20μl 加入含有 HEPES buffer、3,5 DCHBS、
4-aminophenaznoe、uricase、peroxidase 之溶液 1ml 中，於 37℃下反應 5 分鐘
(2) 測定 OD520nm之吸光值
3. 計算方法
尿酸濃度(mg/dl)＝樣品吸光值/標準品吸光值×標準品濃度(mg/dl)
(八) 心臟及腎臟中 Xanthine oxidase (XO)活性測定 1. 原理
本實驗是用 xanthine oxidase 商業套組作分析，xanthine oxiase 為 purine 分 解代謝的最後一個酵素，其催化 hypoxanthine 轉變成 xanthine，接著再代謝產 生 uric acid。此分析套組利用 xanthine oxidase 催化以上作用所產生的 H2O2， 加上 horseradish peroxidase(HRP)與 ADHP (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) 的作用下，產生具有螢光的產物 resorufin，如【圖 4-1】，此物質在激發光波長 520-550nm 及吸收光波長 585-595nm 容易被測出。
【圖 4-1】Xanthine oxidase 作用反應圖 Resorufin
ADHP
HRP HRP
ADHP
XO XO
33
2. 實驗步驟
(1) 配製標準品如【表 4-7】
(2) 將標準品與樣品各加入 50μl 到 96 孔盤中 (3) 製備 assay cocktail，包括
a. Assay buffer：4.9 ml b. Detector：50μl c. HRP：50μl
此 assay cocktail 配製完，須混合均勻後，在 10 分鐘內與樣品反應 (4) 將配好的 assay cocktail 在 10 分鐘內取 50μl 加入至每個 well 中
(5) 放入螢光分光光譜儀中利用激發光波長 550nm，吸收光波長 586nm，測定 其螢光吸光值。
【表 4-7】Xanthine oxidase 標準品配製 編號 XO standard(μl)
(1 mU/ml)
Sample Buffer(μl) Final concentration (μU/ml)
A 0 1000 0
B 20 980 20
C 40 960 40
D 60 940 60
E 80 920 80
F 100 900 100
34
3. 標準曲線與計算方法
將標準品的濃度設為 X 軸，實驗所測得的標準品螢光吸光值為 Y 軸，即可得 此實驗之標準曲線。再將實驗測得的樣品吸光值，依據標準曲線以內插法代入 方程式(y=ax+b)計算，即可求得 xanthine oxidase 的活性，單位以μU/ml 表示。
(九) 血清中 leptin 濃度測定 1. 原理
本實驗是用 Mouse Leptin ELISA 商業套組作分析，利用 ELISA 的原理，
套組已將具有偵測 leptin 的多株抗體 coating 在 96 孔盤上，再加入樣品，樣品 中 leptin 會與抗體結合，之後加入 biotinylated polyclonal antibody 會再接合至 leptin 上，形成 sandwich 的結構固定在微孔上，接著以緩衝溶液清洗掉多餘 biotinylated polyclonal antibody 後，加入 streptavidin-peroxidase conjugate 可與 sandwich 結構結合，再以緩衝溶液沖洗掉多餘 streptavidin-peroxidase conjugate 後，加入 peroxidase 受質 chromogen substrate (tetramethylbenzidine)作為呈色劑，
最後加入 0.5N hydrochloric acid 終止反應，測定 OD450nm之吸光值，將測得的 吸光值代入標準曲線即可換算出 leptin 濃度。
2. 實驗步驟
(1) 將血清樣品稀釋 5 倍，並將標準品稀釋至濃度 24ng/ml 後，再序列稀釋 6 次
(2) 取50μl 稀釋好的樣品與標準品分別加入至 96 孔盤中，於室溫下反應 2 小 時
(3) 以 wash buffer 利用免疫分析微盤清洗機清洗 5 次
(4) 每個微孔加入50μl biotinylated polyclonal antibody，於室溫下反應 2 小時
35
(5) 以 wash buffer 利用免疫分析微盤清洗機清洗 5 次
(6) 每個微孔加入50μl streptavidin-peroxidase conjugate，於室溫下反應 30 分鐘 (7) 以 wash buffer 利用免疫分析微盤清洗機清洗 5 次
(8) 每個微孔加入50μl chromogen substrate，混合均勻，反應直到顏色呈現藍 色
(9) 每個微孔加入50μl stop solution 終止反應，此時顏色會由藍色轉變成黃色，
測定 OD450nm之吸光值
3. 標準曲線與計算方法
將標準品經過序列稀釋，其濃度(24、12、6、3、1.5、0.75、0.325、0 ng/ml) 設為 X 軸，實驗所測得的標準品 OD450nm吸光值為 Y 軸，即可得此實驗之標準 曲線。將實驗測得在 OD450nm下之樣品吸光值，依據標準曲線以內插法代入方 程式(y=ax+b)計算，即可求得 leptin 的濃度，單位以 ng/ml 表示。
(十) 血清 Ghrelin 濃度測定 1. 原理
本實驗是用 Mouse Ghrelin ELISA 商業套組作分析，利用 ELISA 的原理，
套組已將 anti-rabbit secondary antibody coating 在 96 孔盤上，加入 anti-ghrelin antibody 固定後，再加樣品，此時樣品中 ghrelin peptide 與 biotinylated ghrelin peptide 會結合在微孔上之 ghrelin 抗體，以緩衝溶液清洗掉多餘樣品後，加入 可 產 生 呈 色 反 應 之 streptavidin-horseradish peroxidase(SA-HRP) ， 其 會 與 biotinylated ghrelin peptide 結合形成 biotinylated peptid-SA-HRP complex，由於 biotinylated ghrelin peptide 會與樣品及標準品上之 ghrelin peptide 競爭結合 ghrelin antibody，因此呈色濃度深淺與 biotinylated peptid-SA-HRP complex 成正
36
比，反之與樣品及標準品上之 ghrelin peptide 成反比。最後可藉由已知濃度的 標準曲線去推估樣品中 ghrelin peptide 濃度。
2. 實驗步驟
(1) 依廠商建議，配置標準品以序列稀釋方式稀釋 6 次，將血清樣品稀釋 6 倍，
並依套組需求，配置好的樣品中須含 biotinylated ghrelin peptide 10ng/ml (2) 每個微孔加入100μl anti-ghrelin antibody，於室溫下反應 1.5 小時
(3) 以 wash buffer 利用免疫分析微盤清洗機清洗 5 次
(4) 每個微孔加入100μl 稀釋好的樣品、標準品及 positive control，於室溫下 反應 2.5 小時
(5) 以 wash buffer 利用免疫分析微盤清洗機清洗 4 次
(6) 每個微孔加入100μl HRP-streptavidin solution，於室溫下反應 45 分鐘 (7) 以 wash buffer 利用免疫分析微盤清洗機清洗 5 次
(8) 避光，每個微孔加入100μl TMB one-step substrate reagent，於室溫下反應 30 分鐘
(9) 每個微孔加入50μl stop solution 後，立即測 OD450nm之吸光值
3. 標準曲線與計算方法
將標準品經過序列稀釋，其濃度(1000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml、1 ng/ml、
100 pg/ml、10 pg/ml、0 pg/ml)設為 X 軸，實驗所測得的標準品 OD450nm吸光值 換算成 percentage absorbance 設為 Y 軸，即可得此實驗之標準曲線。
percentage absorbance＝(B-blank OD)/(B0-blank OD) B＝樣品或標準品之吸光值
37
B0＝標準品在濃度 0 pg/ml 的吸光值
將實驗測得在 OD450nm下之樣品吸光值，經上述方法換算後，依據標準曲 線以內插法代入方程式(y=ax+b)計算，即可求得 ghrelin 的濃度，單位以 ng/ml 表示。
(十一) 血清 adiponectin 濃度測定 1. 原理
本實驗是用 Mouse Adiponectin ELISA 商業套組作分析，利用 ELISA 的原 理，套組已將具有偵測 adiponectin 的多株抗體 coating 在 96 孔盤上，再加入樣 品，樣品中 adiponectin 會與抗體結合，之後加入 biotinylated adiponectin antibody 會再接合至 adiponectin 上，形成 sandwich 的結構固定在微孔上，接著以緩衝
本實驗是用 Mouse Adiponectin ELISA 商業套組作分析，利用 ELISA 的原 理，套組已將具有偵測 adiponectin 的多株抗體 coating 在 96 孔盤上，再加入樣 品，樣品中 adiponectin 會與抗體結合，之後加入 biotinylated adiponectin antibody 會再接合至 adiponectin 上，形成 sandwich 的結構固定在微孔上，接著以緩衝