分析項目與方法

依照以上的方式飼養三十天，力竭運動組於實驗結束時進行跑步 機單次激烈力竭運動，隨後立即將所有動物予以犧牲，並以腹大動脈 抽取血液進行血液生化值之分析，並取其肝臟及肌肉組織進行肝醣含 量分析，取其肌肉組織切片進行染色觀察。

（一）分析項目

為探討力竭性運動與松杉靈芝補充對大白鼠能量代謝、運動表 現、抗氧化狀態及組織傷害的影響，本實驗分析以下項目。

1. 能量代謝

測定血漿中葡萄糖、乳酸、游離脂肪酸及血尿素氮濃度，以及分 析肌肉與肝臟中肝醣含量。

2. 運動表現

測定力竭運動組各組跑步時間。

3. 抗氧化狀態

分析紅血球中 (1) 超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,

SOD）、(2) 麩胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase, GPX）、(3) 麩 胱甘肽還原酶（glutathione reductase, GRD）及 (4) 過氧化氫酶

（catalase, CAT）活性，並且分析總血紅素（hemoglobin）濃度以定 量以上紅血球所測項目之結果，並分析紅血球中 (5) 還原型麩甘胱 肽/氧化型麩甘胱肽比值（GSH/GSSG ratio），以及 (6) 血漿中脂質過 氧化物 thiobarbituric acid reactive substances（TBARS）濃度。

4. 組織傷害

血漿方面分析心肌及肝臟損傷指標，包括天門冬胺酸轉胺酶

（aspartate aminotransferase, AST）、及丙胺酸轉胺酶（alanine

aminotransferase, ALT）活性。肌肉損傷指標則分析血漿中肌酸激酶

（creatine kinase, CK）、及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）

活性，並將肌肉組織切片以 TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

（TUNEL stain）染色觀察肌肉細胞凋亡情形。

38

（二）測定方法

1. 能量代謝

(1) 血漿葡萄糖濃度 測定原理如下：

血漿中葡萄糖濃度之分析係採用市售試劑組（GL 2623; Randox Laboratories, Antrim, UK）測得。將由灰頭管收集且 30 分鐘內分離出 之血漿及葡萄糖標準液（100 mg/dl），各取出 10 μL，加入 1 mL 反應 液（50 mM phosphate buffer, pH 7.0, 50 mM MOPS buffer, pH 7.0, 11 mM phenol, 0.77 mM 4-aminophenazone, ≧1.5 kU/L glucose oxidase, and ≧1.5 kU/L peroxidase），混勻後，37℃下 incubate 10 分鐘，之後 60 分鐘內使用分光光度計（Hitachi U-2000 Spectrophotometer）於波 長 500 nm 條件下，讀取吸光值，此測定法須在抽取血液後 24 小時內

2H₂O₂+ 4-aminophenazone + phenol ^POD quinoneimine + 4H₂O Glucose + O₂+ H₂O SOD gluconic acid + H₂O₂

2H₂O₂+ 4-aminophenazone + phenol ^POD quinoneimine + 4H₂O

SOD

血漿中乳酸濃度之分析係採用市售試劑組（LC 2389; Randox Laboratories, Antrim, UK）測得。將由灰頭管收集且 30 分鐘內分離出 之血漿及標準液（4.44 mM），各取出 10 μL，加入 1 mL 反應液（0.4 mM 4-aminophenazone, ≧1000 U/L peroxidase, ≧600 U/L lactate

oxidase and ≧10000 U/L ascorbate oxidase），混勻後，37℃下 incubate 5 分鐘，以分光光度計（Hitachi U-2000 Spectrophotometer）於波長 550 nm 條件下，讀取吸光值，此測定法須在抽取血液後馬上進行測定。

將測定值代入公式 Asample/Astandard× 4.44，即可計算求得血漿中乳酸之 濃度（mM）。

(3) 血漿游離脂肪酸濃度 測定原理如下：

血漿游離脂肪酸濃度之分析係採用市售試劑組（FA 115; Randox

NEFA + ATP + CoA Acyl CoA + AMP + PPi Acyl CoA + O₂ 2, 3,-trans-Enoyl-CoA + 2H₂O₂ 2H₂O₂+ TOOS + 4-AAP purple adduct + 4H₂O 4-AAP = 4-aminoantipyrine

TOOS = N-ethyl-N (2hydroxy-3-sulphopropyl) m-toluidine

Acyl CoA Synthetase Acyl CoA Oxidase

Peroxidase

NEFA + ATP + CoA Acyl CoA + AMP + PPi Acyl CoA + O₂ 2, 3,-trans-Enoyl-CoA + 2H₂O₂ 2H₂O₂+ TOOS + 4-AAP purple adduct + 4H₂O 4-AAP = 4-aminoantipyrine

TOOS = N-ethyl-N (2hydroxy-3-sulphopropyl) m-toluidine

Acyl CoA Synthetase Acyl CoA Oxidase

Peroxidase

L-Lactate + O₂ pyruvate + H₂O₂

H₂O₂+ 4-aminoantipyrine + TOOS purple adduct + 4H₂O TOOS = N-ethyl-N (2hydroxy-3-sulphopropyl) m-toluidine

Lactate Oxidase

Peroxidase

L-Lactate + O₂ pyruvate + H₂O₂

H₂O₂+ 4-aminoantipyrine + TOOS purple adduct + 4H₂O TOOS = N-ethyl-N (2hydroxy-3-sulphopropyl) m-toluidine

Lactate Oxidase

Peroxidase

40

準液（1 mM），各取出50 μL，另準備一空白試管作為 sample blank，

三者各加入 1 mL 反應液 1（≧0.3 U/mL acyl coenzyme A synthetase,

≧1.5 U/mL ascorbate oxidase, 0.9 mM coenzyme A, 5 mM ATP and 1.5 mM 4-aminoantipyrine），混勻後，37℃下 incubate 10 分鐘，之後再加 入反應液 2（≧10 U/mL acyl coenzyme A oxidase, 7.5 U/mL peroxidase and 1.2 mM TOOS），混勻後，37℃下 incubate 10 分鐘後，以分光光 度計（Hitachi U-2000 Spectrophotometer）於波長 550 nm 條件下，讀 取吸光值。將測定值代入公式(Asample-Asample blank)/Astandard× 1，即可計 算求得血漿中游離脂肪酸之濃度（mM）。註：sample blank 僅在樣本 膽色素＞10 mg/dl 或血紅素＞100 mg/dl 時才需藉此校正。

(4) 血尿素氮濃度 測定原理如下：

血漿中血尿素氮濃度之分析係採用市售試劑組（UR 456; Randox Laboratories, Antrim, UK）測得。將由綠頭管收集分離出之血漿及標 準液（80 mg/dl），各取出 10 μL，加入 1 mL 反應液（≧15 U/mL urease,

≧1 U/mL GLDH, 0.28 mM NADH, 2.45 mM adenosine-5-diphosphate and 11.7 mM α-oxoglutarate），混勻後第 30 秒及 90 秒，以分光光度計

（Hitachi U-2000 Spectrophotometer）於 37℃、波長 550 nm 條件下，

讀取吸光值。將測定值代入公式ΔAsample/ΔAstandard× 80，即可計算求 得血漿中血尿素氮之濃度（mg/dl）。

(5) 肌肉肝醣與肝臟肝醣含量分析

取出分裝的肌肉或肝臟組織，秤取 0.04~0.08 克，並紀錄其重量 後，放入一置於冰上裝有500 μL之 1N KOH 的玻璃試管中，旋上螺 旋蓋。將玻璃試管置入 75℃的水浴槽 30 分鐘，過程中須將玻璃試管 劇烈 vortex，直至樣本完全溶解。之後由玻璃試管內取出樣本液 100 μL，裝入微量試管內，室溫下加入250 μL的 0.3 M 醋酸鈉溶液（pH 4.8）

後，混合均勻，再加入冰冷的現泡冰醋酸水溶液（冰醋酸：去離子水

＝1：1，避光置冰上備用）10 μL，混合均勻，加入 250 μL已回溫之 澱粉酶（amyloglucosidase in 0.3 M sodium acetate, 10 mg/mL, pH 4.8）

以分解肝醣，混合均勻，室溫下靜置 12 小時以上後，再加入 25 μL 的 1N NaOH 並混合均勻，完成樣本液前處理。

配製四種濃度之葡萄糖標準液（0/100/200/400 mg/dl），各取 10 μL 加入去離子水140 μL，完成標準曲線溶液製備。前處理後的樣本液亦 取150 μL，與 150 μL的標準曲線溶液，各管間隔 40 秒加入呈色劑 1 mL（glucose reagent：Trinder）使其反應 21 分鐘後，在波長 505 nm

42

濃度，再回推肝醣含量（μmol/g）。

2. 抗氧化狀態

抗氧化酵素的測定包括：SOD、GRD、GPX 與 CAT 等。取自全 血離心過的紅血球，加入 4℃生理食鹽水清洗三次後，取紅血球 100 μL 到 1.5 mL 微量試管中，加入 4℃ 300 μL去離子水震盪均勻後，於 4℃、

12000 rpm 下高速離心 10 分鐘，取上清液依序作下列 (1)~(5) 分析，

並以總血紅素作定量。

(1) 紅血球 SOD 活性 測定原理如下：

抗氧化酵素 SOD 活性採用市售試劑組（SD 125; Randox

Laboratories, Antrim, UK）測得。將經過抗氧化酵素萃取前處理的各 種組織上清液予以適當稀釋後，分別取50 μL的樣品稀釋液或不同活 性之 SOD 標準品溶液、1.7 mL 的反應受質溶液（50 M xanthine, 25M I.N.T.）、250 μL的酵素液（80 U/L xanthine oxidase），混勻後，取 1 mL

加入石英比色管中，於 37℃、波長 505 nm 條件下，記錄 3 分鐘內吸 光值之變化，吸光值變化愈低表示對反應的抑制率愈高，故 SOD 的 活性愈高。將測定值代入標準曲線，再乘以樣品稀釋倍數，最後再以 所含之血紅素進行定量，即可計算求得 SOD 之比活性（U/g Hb）。

(2) 紅血球 GPX 活性 測定原理如下：

抗氧化酵素 GPX 活性之分析係採用市售試劑組（RS 504; Randox Laboratories, Antrim, UK）測得。將經過抗氧化酵素萃取前處理的上 清液予以適當稀釋後，分別取20 μL的樣品稀釋液、1 mL 混勻好的 試劑（4 mM glutathione, 0.5 U/L glutathione reductase and 0.34 mM NADPH dissolved in 50 mM phosphate buffer, pH 7.2, 4.3 mM

EDTA）、40 μL cumenehydroperoxide，依序加入石英比色管中，混勻 後，使用分光光度計（Hitachi U-2000 Spectrophotometer）並於 37℃、

波長 340 nm 條件下，記錄 3 分鐘內吸光值之變化。GPX 活性單位（1U）

的定義為，每分鐘減少 1 mole 的 NADPH。將測定值代入公式 8412 × ΔA340nm/min，再乘以樣品稀釋倍數，最後再以所含之血紅素進行定 量，即可計算求得 GPX 之比活性（U/g Hb）。

44

(3) 紅血球 GRD 活性 測定原理如下：

抗氧化酵素 GRD 活性之分析係採用市售試劑組（GF2368;

Randox Laboratories, Antrim, UK）測得。將經過抗氧化酵素萃取前處 理的上清液予以適當稀釋後，分別取 40μL的樣品稀釋液、1 mL 混勻 好的試劑（2.2 mM GSSG）、200 μL的 0.17 mM NADPH，依序加入 石英比色管中，混勻後，於 37℃、波長 340 nm 下紀錄 5 分鐘內吸光 值之變化。GRD 活性單位（1U）的定義為，每分鐘減少 1 mole 的 NADPH。將測定值代入公式 4983 × ΔA340 nm/min，再乘以樣品稀釋 倍數，最後再以所含之血紅素進行定量，即可計算求得 GRD 之比活 性（U/g Hb）。

(4) 紅血球 CAT 活性 測定原理如下：

抗氧化酵素 CAT 活性之變化係依據 Beers 與 Sizer 之方法（1952）

測得(Beers and Sizer, 1952)。將經過抗氧化酵素萃取前處理的上清液 予以適當稀釋後，分別取30μL的樣品稀釋液、570 μL二次水、300 μL 反應液（59 mM H2O2in 50 mM potassium phosphate, pH 7.0），混勻

後，取 1 mL 加入石英比色管中，於波長 240 nm 下記錄 3 分鐘內吸 光值的變化。CAT 活性單位（1U）的定義為，每分鐘減少 1 mole 的 H2O2。將測定值代入公式，〔(ΔA240nm/min)× 1000〕/ 43.6，再乘以 樣品稀釋倍數，最後再以所含之血紅素進行定量，即可計算求得 CAT 之比活性（U/g Hb）。

(5) 紅血球 GSH/GSSG ratio

首先，將樣品中氧化型式的 GSH（即 GSSG）還原成為 GSH，

最後在測定樣品中所有 GSH 之濃度，測定原理如下：

Total GSH 含量之分析係根據 Tietze 的方法（1969）(Tietze,

1969)。取 10 μL的樣品液或不同濃度之標準品溶液（0~100 M GSH）

至 96 well 分析盤中，加入 95 μL的 1 號反應試劑（2 U/mL glutathione reductase, 200 M NADPH, 2 mM EDTA in 50 mM phosphate buffer, pH 7.2），混合均勻後，再加入 2 號反應試劑（10 mM DTNB in 50 mM phosphate buffer, pH 7.2），於波長 405 nm 下，以 microplate reader

（Labsystem Multiskan RC, Finland）讀取 5 分鐘內吸光值之變化，依

46

將樣品中還原型式的 GSH 移除掉，使樣品中只剩下 GSSG，接 著再將 GSSG 還原成為 GSH，最後藉由偵測 GSH，即可求得 GSSG 之濃度，測定原理如下：

GSSG 含量之分析係根據 Griffith 的方法（1980）作修飾再進行 測定(Griffith, 1980)。先取 70 μL的樣品液或不同濃度之標準品溶液

（0~100 M GSSG）至 96 well 分析盤中，加入 4 μL的 M2VP 溶液，

靜置室溫下反應 1 小時，此步驟是為了將還原態的 GSH 轉變成其他 的衍生物。隨後，再取10 μL反應結束後的待測樣品液至另一個新的 96 well 分析盤中，加入 95 μL的 1 號反應試劑（2 U/mL glutathione reductase, 200 M NADPH, 2 mM EDTA in 50 mM phosphate buffer, pH 7.2），混合均勻後，再加入 2 號反應試劑（10 mM DTNB in 50 mM phosphate buffer, pH 7.2），於波長 405 nm 下，以 microplate reader

（Labsystem Multiskan RC, Finland）讀取 5 分鐘內吸光值之變化，並 依照標準曲線計算求得樣品液中 GSSG 之濃度。

GSH/GSSG ratio 之計算：

GSH/GSSG ratio = (total GSH –2GSSG) / GSSG

(6) 血漿 TBARS 濃度

分析血漿中 TBARS 濃度，測定原理為：由於細胞膜上之脂質富 含多元不飽和脂肪酸，在代謝過程中若受到自由基（free radicals）的 攻擊，則細胞膜上的這些不飽和脂肪酸會與自由基進行連鎖反應，進 而造成脂肪的過氧化反應（lipid peroxidation）。此過氧化反應的次級 產物 malondialdehyde 可與 thiobarbituric acid 結合而形成一種紅色物 質，稱之為 TBARS。因此，TBARS 的濃度經常被用來評估動物體內 脂質過氧化的狀態。

血漿中脂質過氧化產物 TBARS 濃度之分析，係依據 Ohkawa 等 人的方法（1979），稍做修改後進行分析 (Ohkawa et al., 1979)。取 20 μL的血漿樣品或不同濃度之標準品（1,1,3,3-tetramethoxypropane, TMP）至 2 mL 微量離心管中，依序加入 800 μL的 0.22% H2SO4、

100 μL的 10% Phosphotungstic acid 以及 200 μL的 0.67% TBA（in H2O : galacical acetic acid = 1:1, v/v），震盪均勻後，於 95℃下，反應 1 小時。取出後，立即移至冰上進行冷卻。最後再加入 600 μL的 n-butanol 進行震盪萃取，於 4℃、12,000 × g 條件下，離心 10 分鐘。

之後，取200 μL的上層液至 96 well 螢光光度計專用的黑色分析盤 中。於波長 Ex 531 nm/Em 590 nm 條件之下，以螢光光度計 Wallac

48

Victor-2 1420 Multilabel Counter（Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA）進行測定。將測定值代入標準曲線即可計算求得血漿樣品 中 TBARS 之濃度。

3. 組織傷害

3. 組織傷害