分綜合討論

由奈米技術和醫學結合形成的奈米醫學，對於奈米劑型的研究，已經由 原 本 單 一 進 行 診 斷 或 是 治 療 的 方 式 ， 結 合 成 所 謂 「 同 位 診 治 」 (theragnostics)，也就是可同時進行診斷以及治療的多功能化醫療研發 ⁴⁶。本 研究希望同時包埋螢光性物質 QDs (作為診斷之用) 和抗癌藥物 (治療) 於 NLCs 劑型中，發展一個多功能式的藥物傳遞劑型，稱為 QDNLCs。另 一方面選擇包埋不同性質的 QDs，進行一系列的物化性質、細胞實驗和動 物實驗做比較，篩選出更具有潛力的 QDNLCs 劑型。

本實驗利用熱均質化法和超音波震盪法成功的製備了 QDNLCs 劑型。

固態脂質的核心是以 cetyl palmitate 為主，它是一種具有表面活性的甘油 酯可以促進乳化，並形成剛性粒子結構 ⁴⁷。以 coconut oil 為天然的油類，

則可增加生物相容性作為液態油脂。選擇 PF-68 作為親水性乳化劑，可以 讓 奈 米 載 體 具 有 隱 形 的 作 用 ， 保 護 奈 米 劑 型 避 免 被 網 狀 內 皮 系 統 (reticulo-endothelial system, RES) 的吞噬細胞很快地在血液中被移除⁴⁸。而 親油性乳化劑則是使用 Myverol^®。本實驗使用的三種不同 QDs，分別介紹 如下：L-QDs 為原生態親油性，為了能便於在生物應用上，QDs 表面往往

需經過修飾或是接上親水性反應官能基，以提升親水性質 ⁴⁹。故另外兩種

QDs 則 選 擇 親 水 性 做 比 較 ， 分 別 為 C-QDs 和 P-QDs 。 C-QDs 是 由 carboxyl 做 QDs 表面修飾則為親水性 ⁵⁰。P-QDs 利用 PEG 修飾表面

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QDs 亦為親水性，且經文獻指出 PEG 修飾後更能延長循環時間 ⁵¹。根據 廠商所提供的資訊，這三種 QDs 核心都為 CdSe 而外殼是 ZnS 可避免核 心被氧化，粒徑大小皆為 18 nm，且激發波長和發散波長同為 405 nm 和 800 nm。而發散波長選擇近紅外光，主要是螢光波長較長對組織間具有高 穿透力，可提升體內光學成像上應用的成效 ²¹。

在物化性質上，本實驗選用兩種界面活性劑分別為 Myverol^® 和 PF-68，

因為使用兩種不同界面活性劑的乳化能力，往往比使用個別界面活性劑強，

可以使製備的奈米劑型粒徑更小且更均勻 ⁵²。結果產生的 NLCs 平均粒徑 為 221 nm，而粒徑分布指數為 0.19，表示粒子是呈現均一性的。當加入不 同的 QDs 時，製備而成 QDNLCs 粒徑大小都增加至 245 nm，主要是由 於許多 QDs 包埋至奈米劑型內核或滯留在表面上，可以經由 TEM 圖證 實。NLCs 載體帶負電主要是 Myverol^® 中的單一甘油脂中水解，釋放游離 脂肪酸所造成的結果 ⁵³。NLCs 載體加入 QDs 後對於表面電位的影響，除 了 L-QDs 略有變化從 -24 到 -18 mV 之外，其他兩種親水性 QDs 則無 顯著差異。表示加入親油性 L-QDs 有可能影響到 Myverol^® 進行重排或是 使 Myverol^® 水解程度減少。穩定表面電位的理想值為大於或等於絕對值 30 mV⁴⁷。雖然實驗中製備的 QDNLCs 並無達到此種電位的要求，但親水 性乳化劑 PF-68 可以給予額外的立體結構而增加劑型的穩定度 ⁵⁴。

根據 TEM 圖像，因為 NLCs 載體本身和 L-QDs 皆為脂溶性，藉由

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脂溶性的親和力，推測 L-QDs 可能位於劑型內核中。另一方面，兩種親水 性 QDs，主要是經由乳化劑的作用而附著於 NLCs 劑型的表面。

Nile red 為親油性染劑，當螢光程度越高，表示所處的環境越親脂性 ⁵⁵。 故可使用它可用來檢查奈米劑型的環境。當 NLCs 劑型加入不同 QDs 後，

結果顯示螢光強度降低。而加入親水性的 QDs 時，螢光強度則更進一步的 下降，此現象是極為合理。其中 PEG 能形成水合表面 ⁵³，故以加入 P-QDs 的 NLCs 劑型極性為最高。

DSC 可用來研究奈米劑型的熔點和結晶性程度。較高的熔融溫度和熱

焓量表示是具有完整性和剛性的晶格排列，反之則亦然⁵⁶。經製備成奈米劑

型，可以觀察到 cetyl palmitate 的熔點往前位移且波峰圖明顯下降，表示 原本完美晶型結構被破壞，主要是液體油脂和固體脂質相互作用所造成的

結果 ⁵⁷。另外奈米劑型的粒徑大小也是一個重要因素的影響，粒徑越小的粒

子則結晶程度越低 ⁵⁸。因此粒徑大小相近的 NLCs 和 QDNLCs，其 DSC 圖皆為相似的。除此之外，也可藉由 DSC 證明 NLCs 晶格結構具有不完 美晶型，其缺陷處可多容納 QDs 和藥物。

利用 NMR，可觀察 NLCs 與 QDNLCs 裡固態脂質 cetyl palmitate 的 半高寬長度，比較在不同劑型中流動性是否有所差異。實驗結果顯示 QDs 的加入會增加 cetyl palmitate 在 NLCs 劑型中的流動性。但不同 QDNLCs 半寬高之間的差異是有限的，顯示 QDs 的性質或 QDs 被包埋的位置對於

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和脂質間的相互作用是沒有很大的影響。

在一系列的物化性質做完後，接著包埋藥物於 QDNLCs 內。在包埋率 實驗中，NLCs 和 QDNLCs 劑型對於 camptothecin 的包埋率都大於 99％。

Camptothecin 為高親脂性藥物，故可輕易地被奈米劑型利用親脂性親合力 包埋於核心中。另一種解釋是奈米劑型結構型態經由 DSC 證明為缺陷性 的結晶，提供更多的空間可以改善藥物的包埋率。而 irinotecan 是一種經 camptothecin 修飾後的親水性藥物，臨床上用於治療大腸癌 ⁵⁹。但 irinotecan 在奈米劑型中的包埋率非常的低。這樣的結果顯示，影響奈米劑型包埋率 的主要因素是脂質本身對於藥物的親和力，而不是晶型結構不完整所致。

儘管一些專門設計的奈米劑型認為可以有效地包埋親水性或是離子性的藥 物 ⁶⁰，但這不在我們的研究中進行討論。在此 NLCs 劑型中不論加入 QDs 對於 camptothecin 都具有高效率的包埋率和穩定性。由於親脂性藥物 camptothecin 會 儲 存 於 NLCs 劑 型 內 核 中 ， 而 親 水 性 QDs 則 是 位 在 NLCs 的表層，故兩種物質位於 NLCs 劑型的不同區域。

在體外藥物釋放方面，NLCs 和 QDNLCs 包埋 camptothecin 後，並沒 有像控制組有藥物突釋的結果，而是以持續且緩慢的釋放方式進行。這可 以說明，camptothecin 會穩定包埋於奈米劑型中，再經由擴散的方式緩慢釋 放至外部水相中。而 irinotecan 的釋放和控制組無顯著差異，進一步支持 要達到緩慢持續性釋放，藥物包埋至脂質基質中是必要的。接著比較不同

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QDNLCs 劑型的差異，因各處方選用的脂質和乳化劑皆是相同的。若會造 成藥物釋放的差異性，主要是加入不同的 QDs 所導致。L-QDNLCs 和 C-QDNLCs 的 camptothecin 釋放的略高於 P-QDNLCs。而在疏水性實驗 中，發現 L-QDs 和 C-QDs 比 P-QDs 具有較大的脂溶性，推測較親脂性 QDs 可能會干擾載體內脂質核心的結構 ⁶¹。當然關於 QDs 對脂類基質的 影響，還需要進一步研究。據文獻指出，camptothecin 需要一個長時間低劑 量給藥的方式 ⁴⁰。本實驗研究結果指出，camptothecin 經由奈米劑型修飾後 確實具有緩慢且持續性的釋放，減少病人用藥頻率。

在做細胞毒殺實驗前，先確認了空白奈米劑型和加入的 QDs 對黑色素 瘤 細 胞 是 沒 有 毒 性 的 ， 這 意 味 著 抑 制 癌 細 胞 生 長 ， 主 要 是 抗 癌 藥 物 camptothecin 本身。實驗結果顯示，奈米劑型 NLCs 和 QDNLCs 有助於 提高 camptothecin 對於細胞毒殺作用。由於 camptothecin 緩慢地從奈米劑 型中釋放，其主要毒殺機制可能不是經由藥物直接滲透進入細胞內。利用 螢光顯微鏡觀察，推測可能是經由細胞對奈米劑型的內吞作用，藥物再由

載體中釋放出來，故可以提高在癌細胞內藥物的累積和減少藥物破壞 ⁶²。在

正常生理條件下，camptothecin 結構中內的 lactone 易開環，會使得藥物失

去原本的藥理活性 ⁶³，經由奈米劑型包埋後則有助於改善藥物的穩定度。藥

物釋放動力學顯示 camptothecin 在 12 小時內藥物釋放受到限制，而在 24 小時後才大量釋放出藥物。在 12 小時中，各 QDNLCs 都具有相似的細胞

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毒 性 ， 顯示 不 同 QDs 類 型 對 於 擴散 能 力 的影 響 是很 小 的 。 NLCs 和 P-QDNLCs 對於 L-QDNLCs 和 C-QDNLCs 相比，具有較低的藥物釋放程 度，但有助於 camptothecin 的保護，且經過 24 小時後對癌細胞有產生更 大之毒性。

黑 色 素 癌 細 胞 的 一 個 特 性 是 易 轉 移 。 在 細 胞 遷 徙 實 驗 中 ， 雖 然 camptothecin 能夠抑制黑色素腫瘤轉移，但經過劑型修飾後並沒有進一步明 顯的抑制轉移效果。顯然有無奈米劑型修飾，對黑色素腫瘤轉移影響不大。

QDs 已被用來作為診斷癌症和腫瘤細胞檢測的標記。在 IVIS 實驗中 顯示 QDs 包埋進入 NLCs 後仍具有螢光性。而螢光顯微鏡結果表示，細 胞內在不同奈米劑型中螢光強度以 L-QDNLCs 為最高，顯示黑色素瘤細胞 對 L-QDNLCs 具有較佳的細胞攝入效果。表示 NLCs 載體有可能與細胞 膜進行脂質融合，然後到細胞質中釋放出 QDs⁶⁴。然而在 C-QDNLCs 和 P-QDNLCs 螢光則不明顯，有可能是 QDs 表面的 PEG 或 carboxyl 的修 飾，造成無法與細胞質內膜產生相互作用 ⁶⁵，因此導致 C-QDNLCs 和 P-QDNLCs 在細胞攝入程度較低。因為細胞膜本身是具有親脂性 ⁶⁶，而使 親水性的 QDs 是不容易通過細胞膜。但值得注意的是，L-QDNLCs 與其 他奈米劑型相比，對黑色素癌細胞毒殺效果並沒有是最理想的，表示具有 好的細胞攝入作用對於細胞毒殺效果的增加不完全是必然的。有可能的原 因是細胞毒性實驗和細胞攝入的觀察時間並不是一致的，或是仍然具有其

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他的機制比劑型進入細胞內釋放藥物對細胞毒殺有更大的影響。

在體內外生物成像上，藉由生物體複雜性和個體的差異性來比較不同 QDs 的螢光表現。藉由腫瘤注射方式注於裸鼠內，來評估螢光強度和實際 在活體上的動力學。腫瘤具有一個獨特性質稱為 enhanced permeability and retention effect，此效應可增加腫瘤滲透性和滯留時間，因為腫瘤部位常具 會有血管新生作用，使得血管內皮細胞排列不整齊有較大的孔洞間隙，使

奈米粒子易離開血管進入腫瘤組織 ⁶⁷。但腫瘤間隙進出亦取決於奈米粒子的

大小，若分子過小也易從腫瘤組織間滲透出去。故粒徑較大的 QDNLCs

大小，若分子過小也易從腫瘤組織間滲透出去。故粒徑較大的 QDNLCs