第三章、 實驗結果與討論
第一部 分 NLCs 包埋不同種類 QDs 作一系列之研究
本研究 QDNLCs 劑型利用高速剪切法 (high shear homogenization) 與 超音波震盪法 (ultrasonication method) 製備。QDNLCs 是 NLCs 包埋 QDs 所組成。NLCs 是由固態脂質、液態油脂、親水性乳化劑和親油性乳 化劑四種成分所組成。Cetyl palmitatey，常使用作為 NLCs 的固態脂質。
以 coconut oil 作為液態油脂。處方乳化劑選擇以 PF-68 為水相界面活性 劑，Myverol® 作為油相界面活性劑。而 QDs 方面我們則選用三種 QDs，
分別為親油型 L-QDs、PEG 修飾後的親水性 P-QDs 和 carboxyl 修飾後的 親水性 C-QDs，其激發波長和發散波長皆為 405 nm 和 800 nm，且粒子大 小都為 18 nm。處方設計如 (表二):
表二、NLCs 和各 QDNLCs 處方設計 Composition (％)
Code Cetyl palmitate
Coconut
oil PF-68 Myverol L-QDs C-QDs P-QDs
NLCs 2 6 2.5 0.3 - - -
L-QDNLCs 2 6 2.5 0.3 0.2 - - C-QDNLCs 2 6 2.5 0.3 - 0.2 - P-QDNLCs 2 6 2.5 0.3 - - 0.2
37
2、QDNLCs 的物化性質
在粒徑大小 (size) 的變化上，如 (表三) 所示，只有 NLCs 劑型時平 均粒徑大小為 221 nm，當包埋 QDs 後粒徑大小增加為 245 nm (p < 0.05)，
而三個不同的 QDNLCs 粒徑大小互相比較後沒有顯著性差異 (p > 0.05)。
粒徑離散程度 (polydisersity index, PDI) 表示粒徑中的分散程度，數值愈低 顯示微粒愈接近單一粒徑，一般則以小於 0.3 為最佳值。在此實驗中，NLCs
Formulations Size (nm)
Polydisersity NLCs 221.40±1.65 0.19±0.02 -24.33±1.00 34.20±0.01 L-QDNLCs 245.00±3.40 0.28±0.02 -18.30±0.36 35.50±0.04 C-QDNLCs 245.73±4.21 0.20±0.01 -23.86±0.35 34.12±0.21 P-QDNLCs 245.30±3.83 0.16±0.02 -22.33±0.64 33.60±0.01
38
3、利用 TEM 觀察 QDNLCs 之外觀型態
將製備好的劑型稀釋 10 倍後，利用 1％ phosphotungstic acid 做負染 色 ， 藉 由 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 觀 察 NLCs 、 L-QDNLCs 、 C-QDNLCs 和 P-QDNLCs，如 (圖十七) 所示，結果粒徑大小與 Malvern 所測得的約相同，
外觀是呈現接近圓球或橢圓形。但 C-QDNLCs 的表面是較為粗糙狀，有可 能是親水性 QDs 嵌入劑型表層，比較明顯的是在 C-QDNLCs 表面中，可 以觀察到 NLCs 外層中具有許多小點的分佈。另外 L-QDNLCs 光滑的表 面，推測是 L-QDs 被包埋於奈米劑型的內核中。
(A) NLCs (B) L-QDNLCs
(C) C-QDNLC (D) P-QDNLCs
圖十七、NLCs 和各 QDNLCs 奈米劑型穿透式電子顯微鏡 (200000 X)
39
550 600 650 700 nm
P-QDNLCs(EM), NLCs(EM), L-QDNLCs(EM), C-QDNLCs(EM)
0
40
5、以 1H-NMR 觀察 QDNLCs 內固態脂質之流動性
利用 1H-NMR 的半高寬為訊號峰高度一半時的訊號寬度 (單位 Hz)，
可做為固態脂質在 NLCs 內流動性的指標。當半高寬越大則顯示固態脂質 在奈米劑型中流動性越佳。(表四) 中單純成分固態脂質 cetyl palmitate 的 半高寬為最小，當作成 NLCs 劑型後，流動性有所提升，而再加入 QDs 後，
半高寬又增大，表示加入 QDs 是會影響 NLCs 內固態脂質流動性。但加 入不同的 QDs 互相做比較，則沒有明顯的差異。
表四、各處方中 1H-NMR 的半高寬
成分 半高寬
Cetyl palmitate 5.16
NLCs 12.8
L-QDNLCs 14.93
C-QDNLCs 14.53
P-QDNLCs 14.66
41
6、以示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC) 觀察 QDNLCs 內固態脂質的結晶程度
本實驗目的是探討純的固態脂質 cetyl palmitate 做成奈米劑型時，因物 理方法混合是否會使得劑型中其他成分對其原本純的 cetyl palmitate 相變 化熔點產生影響，進而使熔點波峰有改變的趨勢。並且比較不同的 QDs 加 入，探討 NLCs 劑型的結構型態是否會受到影響。從 (圖十九) 中可發現，
當我們可以做成奈米劑型後卻有兩個波峰，主要是因為 PF-68 和 cetyl palimate 的熔點太過接近，且我們設計的劑型 PF-68 和 cetyl palimate 比 例差不多所致。因此，我們只能進一步實驗，從 (圖二十) 去推斷約 44 0C 附 近是 cetyl palmitate 的波峰，而 49 0C 附近則是 PF-68 的波峰。故可知 cetyl palmitate 熔點波峰由原本 53.94 移動至 44.36 0C，且波峰形狀已大幅 縮小，顯示 cetyl palmitate 結晶程度有所降低，主要是受到加入液態油脂 的影響。另外，比較不同的 QDs 對於 NLCs 熔點的影響則沒有顯著的差 異。
42
圖十九、Cetyl palmitate、PF-68、NLCs 和各 QDNLCs 之 DSC 熱焓量圖
表五、Cetyl palmitate、PF-68、NLCs 和各 QDNLCs 之熔點 熔點 (0C) PF-68 Cetyl palimate
PF-68 54.58 –
Cetyl palimate – 53.94
NLCs 49 44.36
L-QDNLCs 49.4 43.94
C-QDNLCs 49.16 44.28
P-QDNLCs 49.27 44.08
43
圖二十、NLCs 作成劑型後 cetyl palmitate 和 PF-68 之 DSC 圖
表六、NLCs 作成劑型後 cetyl palmitate 和 PF-68 之熔點 熔點 (0C) PF-68 Cetyl palimate NLCs 無 PF-68 – 44.21 NLCs 無 cetyl palimate 49.57 –
44
7、QDNLCs 藥物之包埋率
作為藥物輸傳輸系統一個很關鍵的重點在於載體對於藥物的包埋率。
從 (表七) 中可看出 NLCs 包覆 camptothecin 極高，推測 camptothecin 本 為親脂性藥物，且 NLCs 劑型主要就是以包覆親脂性藥物為主，故包埋率
> 99 ％ ， 此 外 加 入 不 同 QDs 並 不 會 影 響 包 埋 效 果 。 而 另 一 藥 物 為 camptothecin 經修飾後的 irinotecan，水溶性增加，故 NLCs 包埋效果不理 想。比較特別的是，不論親水和親油性的 QDs 包覆率都很高。推測水溶性 的 QDs 有可能是以附著於 NLCs 表面的方式，可從 NLCs 包埋 C-QDs 的 TEM 圖證實。
表七、QDNLCs 之藥物包埋率
Camptothecin Irinotecan QDs Formulation Encapsulation efficiency (%)
NLCs 99.72±0.01 3.59±1.76 — L-QDNLCs 99.73±0.01 2.06±1.06 99.96±0.02 C-QDNLCs 99.56±0.03 4.03±3.07 99.97±0.01 P-QDNLCs 99.64±0.01 4.11±2.24 99.95±0.01
45
8、QDNLCs 包覆藥物之體外釋放實驗
NLCs 包覆 camptothecin 之體外釋放試驗，主要是希望藉由藥物載體 的幫助達到控制藥物釋放的效果，增加藥物在生物體內的生物可用率。如 (圖二十一 A) 所示控制組 camptothecin 完全溶解在 DMSO，在一開始藥 物釋放速度很快，接著在 12 小時後逐漸平穩。當 camptothecin 包埋入 NLCs 和 QDNLCs 後釋放程度顯著降低 (p < 0.05)，表示在初始階段並沒 有突然釋放，而是進行持續緩慢性的釋放。而 NLCs 和各 QDNLCs 之間 釋放率並沒有顯著性差異 (p > 0.05)。故經由 NLCs 和 QDNLCs 修飾的處 方皆有良好的藥物緩釋效果，可以延長藥物釋放的時間。而在 (二十一 B) 中可看出另一藥物 irinotecan，經 NLCs 和各 QDNLCs 處方包埋後的釋放 結 果 和 控 制 組 並 沒 有 明 顯 的 差 異 (p > 0.05) ， 據 之 前 實 驗 結 果 顯 示 irinotecan 包埋率是非常低，推測藥物應該沒有被包埋至劑型中，使得釋放 結果和控制組相差不大。
46
(A) camptothecin
(B) irinotecan
圖二十一、(A) camptothecin，(B) irinotecan 之體外藥物累積釋放圖 (n=4) (*, p < 0.05, compare to control)
47
9、以非侵入性活體影像系統 (non-invasive in vivo imaging system, IVIS) 全 波長掃描 QDNLCs 之螢光圖
將製備完成的各劑型冷卻至室溫後，以 IVIS 全波長掃描，觀察其奈米 劑型之螢光性。激發波長 (Excitation, Ex) 從 430 nm 以 35 nm 為間隔掃描 掃至 710 nm。而發散波長 (Emission, Em) 範圍則為 430 nm 以 20 nm 為 區隔至 840 nm。以控制組 (未包埋 QDs 的 NLCs) 和 NLCs 包埋不同種 類的 QDs 做為比較。從 (圖二十二~三十三) 中，可明顯發現控制組是完 全沒有螢光存在的，證實經奈米劑型 QDs 包埋後仍具有螢光性。但此實驗 受限於儀器的關係，因為 IVIS 只能從 430 nm 開始掃描，但其實 QDs 最 合適的激發波長是在 405 nm，故無法去比較奈米劑型包埋 QDs 後是否有 螢光位移現象發生，不過從 (圖二十二~三十三) 可以確定的是發散波長皆 在 800~820 nm 之間的螢光程度為最大，可證實其螢光發光的範圍是位於 紅外光。
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
10、使用螢光顯微鏡觀察黑色素癌細胞 (melanoma cell) 攝入 QDNLCs 為了確定 QDs 經過 NLCs 劑型的修飾是否會被黑色素癌細胞攝入的 情形，透過螢光顯微鏡來觀察 4 小時後控制組 (原本的 QDs) 和 NLCs 劑 型包埋 QDs 後做比較，並利用 DAPI 染細胞核呈現藍色，進而觀察確切 細胞的位置。如 (圖三十四) 顯示 L-QDNLCs 在 4 小時後培養黑色素細 胞的圖像，可以看到在細胞質中有大量的紅色螢光表現，表示此種處方能 攝入細胞質中，且其螢光強度和控制組也是相似的。但在兩種親水性 QDs (C-QDs 和 P-QDs) 經過 NLCs 劑型修飾後，如 (圖三十五~三十六) 所示 螢光程度並沒有比原來的控制組效果更好。
(A) L-QDs (B) L-QDNLCs
圖三十四、L-QDs 和 L-QDNLCs 在 4 小時被黑色素癌細胞攝入之情形
58
(A) C-QDs (B) C-QDNLCs
圖三十五、C-QDs 和 C-QDNLCs 在 4 小時被黑色素癌細胞攝入之情形
(A) P-QDs (B) P-QDNLCs
圖三十六、P-QDs 和 P-QDNLCs 在 4 小時被黑色素癌細胞攝入之情形
59
11、QDNLCs 包覆 camptothecin 之細胞毒性分析
本實驗為了證實以奈米劑型包埋 camptothecin 之效果優於單獨存在下 的 camptothecin，以及加入 QDs 對於 NLCs 後細胞毒性的影響。因此以 黑 色 素 癌 細 胞 評 估 各 處 方 及 控 制 組 (DMSO 溶 camptothecin) 的 camptothecin 在經過 12 小時及 24 小時之後細胞毒殺的程度。首先比較控 制組的 camptothecin 和各處方之 NLCs 所包埋的 camptothecin，由 (圖三 十七) 所示不論 12 或 24 小時控制組中的 camptothecin 不足以引起黑色 素癌細胞之凋亡，但奈米劑型包覆後 camptothecin 對於黑色素癌細胞的毒 殺情況皆優於控制組。表示藉由奈米劑型修飾後可明顯增強 camptothecin 抑制黑色素癌細胞的能力。接著比較 NLCs 有無包埋 QDs 對細胞毒性的 影響，從 (圖三十七) 可以了解 NLCs 加入 QDs 再包埋 camptothecin 後 對於抑制黑色素癌細胞生長的程度並無增加的效果，而其中 C-QDNLCs 相 對於其他奈米劑型在 12 至 24 小時相比，並沒有隨著時間的增長提高對 黑色素癌細胞的毒殺能力。
60
圖三十七、黑色素癌細胞加入控制組與各 QDNLCs 劑型經 12 和 24 小時 的細胞存活率 (n=3) (*, p < 0.05, compare to control)
Cell v iabi lit y (%)
0 20 40 60 80 100
12 h 24 h
Standard Control NLCs L-QDNLCs C-QDNLCs P-QDNLCs
*
*
* *
* *
* *
61
12、QDNLCs 抑制黑色素細胞遷徙分析
本實驗藉由具有遷移特性的黑色素腫瘤，研究 0、24、36 小時在奈米 劑型中的 camptothecin 是否會抑制腫瘤的轉移。在 (圖三十八 A) 是未經 任何處理來顯示癌細胞本身的遷徙能力。而 (圖三十八 B) 控制組是經由 DMSO 溶解游離的 camptothecin 來治療遷徙癌細胞，發現癌細胞的轉移具 有顯著性的減少。而所有 (圖三十八 C~F) 經奈米劑型包埋的 camptothecin 在體外的遷移活動也明顯減少，但和控制組相比並無顯著性差異。結果顯 示，奈米載體並不會額外增加 camptothecin 抑制黑色素瘤細胞遷移的能 力。
圖三十八、黑色素癌細胞的細胞遷徙分析 (A) 未經藥物處理 (B) 控制組 DMSO 溶解 camptothecin (C) NLCs (D) L-QDNLCs (E) C-QDNLCs (F) P-QDNLCs
62
13、利用近紅外螢光活體影像系統觀察不同 QDNLCs 經腫瘤內注射 (intratumor) 24 小時之螢光變化
將黑色素細胞經由皮下注射植入裸鼠背部，探討更複雜的體內腫瘤模型。
待腫瘤長到一定程度後，利用腫瘤內注射 QDNLCs 劑型觀察 QDs 在體內 24 小時之生物成像。在裸鼠上邊腫瘤是完全無經過處理，而下面的腫瘤則 是注入不同的奈米劑型做比較。在實驗前，首先做了各劑型的螢光性強度 比較，在給予相同激發光強度刺激下，從 (圖三十九) 中發現 NLCs 包埋 L-QDs 的螢光強度相對於其他兩種 QDs 弱很多。而在包埋 C-QDs 和 P-QDs 中，又以 C-QDs 螢光強度最強。之後將奈米劑型注入腫瘤內觀察 0 分鐘、1 分鐘、1 小時、2 小時、4 小時、6 小時、12 小時及 24 小時。
如 ( 圖 三 十 九 ) 所 示 ， 可 看 出 在 L-QDNLCs 完 全 無 螢 光 出 現 ， 而 C-QDNLCs 在腫瘤滯留時間約至 24 小時皆有螢光表現，P-QDNLCs 螢光 程度較 C-QDNLCs 弱，且 12 小時後螢光有開始下降的趨勢。在觀察 24 小時後，犧牲裸鼠。接著取下腫瘤部位的皮膚，如 (圖四十一 A) 確認其螢 光不是殘留在皮膚上。而後將腫瘤取下，(圖四十一 B) 再次證明螢光確實 位於腫瘤中。
。
圖三十九、奈米劑型螢光強度從左至右分別為 L-QDNLCs、C-QDNLCs 和 P-NLCQDs
63
圖四十、利用近紅外螢光活體影像系統觀察在 0 分鐘、1 分鐘、1 小時、
2 小時、4 小時、6 小時、12 小時及 24 小時不同處方 QDNLCs 之螢光 變化圖
64
圖四十一、腫瘤的螢光圖像處理 (QDNLCs 注射於裸鼠的左側，右側則無
圖四十一、腫瘤的螢光圖像處理 (QDNLCs 注射於裸鼠的左側，右側則無