嘉南藥理科技大學藥物科技研究所 碩士論文
奈米載體包埋量子點於生物成像和抗癌治療上的劑型 設計及評估
Formulation design and evaluation of quantum dot-loaded nanocarriers for integrating bioimaging and
anticancer therapy
指導教授：許 淑 慧 博士 (Dr. Shu-Hui Hsu) 研 究 生：黃 裕 傑 (Yu-Jie Huang)
中華民國一百零一年七月三十日
嘉南藥理科技大學藥物科技研究所 Institute of Pharmaceutical Science
Chia-Nan University of Pharmacy and Science
碩士論文
Thesis for the Degree of Master
奈米載體包埋量子點於生物成像和抗癌治療上的劑型設計 及評估
Formulation design and evaluation of quantum dot-loaded nanocarriers for integrating bioimaging and anticancer therapy
指導教授：許 淑 慧 博士 (Dr.Shu-Hui Hsu) 研 究 生：黃 裕 傑 (Yu-Jie Huang)
中華民國一百零一年七月三十日
30, July 2012
I
致謝
兩年的研究生涯一下子就過去了，很感謝在這段時間幫助過我的人讓我 成長了不少。感謝我的指導教授許淑慧老師帶我踏入藥劑學的領域，更感 謝長庚大學方嘉佑老師，基本上所有的實驗都是在方老師的實驗室完成。
謝謝方老師實驗技術上的指導及願意花費資源在我的身上，也感謝陳俊仁 老師在論文上面的批閱，使得論文更加完整。感謝長庚醫院溫志仁博士在 生物影像上專業的教導。以及謝謝我在嘉藥的同學益銘、煜書、昱陽、采 璇、佳瑋、乃禎、為婷和芊妙的相伴，尤其是益銘，我不在嘉藥的期間都 需要他來告訴我最新的消息及幫我處理一些在嘉藥的瑣事等。也謝謝在長 庚實驗室力文學姐一開始很用心的帶我，明娟學姐指導我做動物實驗，念 慈學姐幫忙養細胞，以及浚責、怡靜和逢鳴的支持，還有學妹宜筠、雅慧 和媛婷，因為有你們實驗室總是充滿著歡笑，雖然我是嘉藥的學生，但大 家都對我很好，讓我在長庚一年多的生活過得非常充實。也謝謝小舅和表 哥宜鴻，每次回台南如果要過夜，都要到他們府上打擾一番。最後感謝我 的父母，由於他們經濟上完全的支持，才能讓我在嘉藥和長庚這樣兩地的 跑，更感謝他們一路的鼓勵才能讓我完成了這得來不易的學業。
II
中文摘要
在此研究中，我們對於奈米劑型同時包覆抗癌藥物和量子點 (quantum dots, QDs) 之處方設計、生物成像和藥物傳遞做全面的探討，目的是為了整 合診斷和治療。本實驗主要是探討兩種奈米劑型：奈米脂質結構載體 (nanostructured lipid carriers, NLCs) 和微脂粒 (liposomes)。奈米劑型的物化 特性藉由測定粒徑大小、表面電位、形態學、分子環境、示差熱掃描分析 儀 (differential scanning calorimetry, DSC) 和核磁共振 (nuclear magnetic resonance, NMR) 得知。對於奈米劑型在生物成像和藥物傳遞的應用上，分 別評估了細胞毒性、細胞遷移、細胞攝入、在體內腫瘤即時監控和腫瘤累 積藥物含量。首先選擇不同性質的量子點包埋於 NLCs 中，稱為 QDNLCs，
包括脂溶性量子點 (L-QDs)、羧基功能修飾的量子點 (C-QDs) 和聚乙二醇 修飾的量子點 (P-QDs)。對於黑色素癌細胞毒殺實驗經由奈米劑型包埋後是 優於游離的 camptothecin。在生物成像實驗中，以 C-QDNLCs 於腫瘤的螢 光訊號可以維持至少 24 小時。在第二個部分則是研究以不同處方的微脂 粒包埋 C-QDs。實驗結果發現帶正電微脂粒包埋 QDs 為最佳選擇，因為 其具有藥物控釋能力，高腫瘤細胞毒殺能力，並具有顯著的細胞和實體腫 瘤螢光標記。本研究評估包埋抗癌藥物和 QDs 的奈米劑型系統做為一種新 的多功能載體，並能同時達到治療及診斷的目的且深具未來發展潛力。
關鍵字：奈米脂質結構載體、微脂粒、量子點、抗癌、藥物傳輸
III
Abstract
In this report, we comprehensively studied the formulation design, bioimaging, and delivery of drug-entrapped nanocarriers with quantum dots (QDs), for integrating diagnosis and therapy. This study is to use the two nanocarriers: nanostructured lipid carriers (NLCs) and liposomes. Nanocarriers were characterized by size, zeta potential, morphology, molecular environment, differential scanning calorimetry (DSC), and nuclear magnetic resonance (NMR). The application of the nanocarriers for imaging and drug delivery was evaluated by cytotoxicity, cell migration, cellular uptake, in vivo real-time tumor monitoring, anddrug accumulation in tumors. (Part I) Different QDs were selected to load with NLCs, which called QDNLC, including lipophilic QDs (L-QDs), carboxyl functioned QDs (C-QDs) and polyethylene glycol QDs (P-QDs). Cytotoxicity of the nanoparticles against melanoma cells was superior to that of free camptothecin. The real-time bioimaging demonstrated that C-QDNLCs could maintain the signaling in tumors for at least 24 h. (Part II) C-QDs was incorporated into different liposomes. Cationic quantum dot liposomes may be the best nanocarriers selected from this work because of their release, high cytotoxicity, and significant fluorescence labeling on cells and solid tumors. The drug-loaded nanocarriers with QDs evaluated in this study afford a new potential method for simultaneous therapeutic and diagnostic purposes.
Keywords: Nanostructured lipid carriers; Liposomes; Quantum dots; Anticancer;
Drug delivery
IV
總目錄
致謝 ... I 中文摘要 ...II Abstract... III 總目錄 ... IV 圖目錄 ... X 表目錄 ... XVI
前言 ... 1
第一章、緒論 ... 2
1.1、使用奈米載體劑型的介紹 ... 2
1.1.1、奈米結構脂質載體 (nanostructured lipid carriers, NLCs) ... 2
1.1.2、微脂粒 (liposomes) ... 6
1.2、量子點 (quantum dots, QDs) ... 10
1.3、模式藥物 ... 15
1.3.1、Camptothecin ... 15
1.3.2、Irinotecan ... 17
1.4、研究動機 ... 19
V
第二章、材料與方法 ... 21
2.1、材料 ... 21
2.2、儀器 ... 23
2.3、實驗方法 ... 25
第一部分 NLCs 包埋不同性質 QDs 作一系列之研究 ... 25
1、QDNLCs 奈米劑型的製備 ... 25
2、顆粒粒徑測定 ... 25
3、表面電位 (zeta potential) 測定 ... 26
4、界面張力 (surface tension) 測定 ... 26
5、穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscope, TEM) 觀察 QDNLCs 型態 ... 27
6、QDNLCs 之疏水性試驗 ... 27
7、以 1H-NMR 觀察 QDNLCs 內固態脂質的流動性 ... 27
8、示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC) ... 28
9、QDNLCs 之藥物包埋率測定 ... 28
10、QDNLCs 包覆藥物之體外釋放實驗 ... 29
VI
11、以非侵入性活體影像系統 (non-invasive in vivo imaging system,
IVIS) 全波長掃描 QDNLCs 內之螢光圖 ... 30
12、以螢光顯微鏡觀察黑色素癌細胞 (melanoma cell) 攝入 QDNLCs ... 30
13、QDNLCs 包埋 camptothecin 之細胞毒性分析 ... 31
14、QDNLCs 抑制細胞遷徙實驗 ... 31
15、利用近紅外螢光活體影像系統 (Pearl® Impulse Image) 觀察不同 時間點之 QDNLCs 螢光變化 ... 31
16、QDNLCs 經腫瘤內注射之藥物含量 ... 32
17、統計方法 ... 32
第二部分 不同處方之微脂粒包埋 QDs 做一系列之研究 ... 33
1、微脂粒包埋 QDs 的製備 ... 33
2、微脂粒包埋 QDs 之顆粒粒徑及表面電位測定 ... 33
3、以穿透式電子顯微鏡比較微脂粒有無包埋 QDs 之外觀型態 ... 33
4、微脂粒包埋 QDs 之疏水性試驗 ... 34
5、示差熱掃描分析儀 ... 34
6、微脂粒同時包埋 QDs 和藥物之包埋率測定 ... 34
VII
7、微脂粒同時包埋 QDs 和藥物之體外釋放實驗 ... 34
8、黑色癌細胞攝入微脂粒包埋 QDs 之觀察 ... 34
9、微脂粒包覆藥物和 QDs 之細胞毒性分析 ... 34
10、微脂粒包覆藥物和 QDs 之細胞遷徙實驗 ... 35
11、利用近紅外螢光活體影像系統觀察不同時間點之微脂粒包埋 QDs 之螢光變化 ... 35
12、統計方法 ... 35
第三章、實驗結果與討論 ... 36
第一部分 NLCs 包埋不同種類 QDs 作一系列之研究 ... 36
1、QDNLCs 的處方設計 ... 36
2、QDNLCs 的物化性質 ... 37
3、利用 TEM 觀察 QDNLCs 之外觀型態 ... 38
4、QDNLCs 之疏水性試驗 ... 39
5、以 1H-NMR 觀察 QDNLCs 內固態脂質之流動性 ... 40
6、以示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC) 觀察 QDNLCs 內固態脂質的結晶程度 ... 41
7、QDNLCs 藥物之包埋率 ... 44
VIII
8、QDNLCs 包埋藥物之體外釋放實驗 ... 45
9、以非侵入性活體影像系統 (non-invasive in vivo imaging system, IVIS) 全波長掃描 QDNLCs 之螢光圖 ... 47
10、使用螢光顯微鏡觀察黑色素癌細胞 (melanoma cell) 攝入 QDNLCs ... 57
11、QDNLCs 包埋 camptothecin 之細胞毒性分析 ... 59
12、QDNLCs 抑制黑色素細胞遷徙分析 ... 61
13、利用近紅外螢光活體影像系統觀察不同 QDNLCs 經腫瘤內注射 (intratumor) 24 小時之螢光變化 ... 62
14、QDNLCs 包埋 camptothecin 之腫瘤內藥物含量 ... 65
第一部分綜合討論 ... 66
第二部分 不同處方之微脂粒包埋 QDs 做一系列之研究 ... 74
1、微脂粒的處方設計 ... 74
2、不同微脂粒處方包埋 QDs 之物化性質 ... 76
3、穿透式電子顯微鏡觀察不同微脂粒處方包埋 QDs 之外觀 ... 77
4、不同微脂粒處方加入 QDs 之疏水性試驗 ... 79
5、DSC 分析不同微脂粒處方包埋 QDs 之結晶型態 ... 80
IX
6、微脂粒對於 camptothecin 和 irinotecan 之藥物包埋率 ... 82 7、不同微脂粒處方對於 camptothecin 和 irinotecan 藥物體外釋放 . 83 8、黑色癌細胞攝入不同微脂粒處方包埋 QDs 之觀察 ... 89 9、不同微脂粒處方同時包埋藥物及 QDs 之細胞毒性分析 ... 94 10、黑色素癌細胞遷徙實驗 ... 96 11、利用近紅外螢光活體影像系統觀察不同微脂粒處方包埋 QDs 經腫 瘤內注射 24 小時之螢光變化 ... 99 第四章、結論 ... 104 第五章、參考資料 ... 105
X
圖目錄
圖一、SLNs 及 NLCs 晶體結構比較 ... 2
圖二、NLCs 三種型態：(A) imperfect type，(B) structureless type，(C) multiple type ... 3
圖三、脂質在水中形成微脂粒圖 ... 7
圖四、藥物在微脂粒內部的分布情形 ... 7
圖五、微脂粒的結構分類 ... 8
圖六、QDs 結構 ... 10
圖七、QDs 限量化效應：不同尺寸的 QDs 可以發射出不同顏色 ... 11
圖八、利用 mercaptocarbonic acid 上的硫醇基置換 QDs 表面 ... 12
圖九、利用 silanization 方式修飾 QDs 表面 ... 13
圖十、利用 polymer 方式修飾 QDs 表面 ... 13
圖十一、QDs 在生物應用上的種類 ... 14
圖十二、Camptothecin 結構圖 ... 15
圖十三、Camptothecin 機轉圖 ... 16
圖十四、Irinotecan 結構圖 ... 17
圖十五、Irinotecan 代謝機轉圖 ... 18
圖十六、Franz 直立式擴散式裝置 ... 30
圖十七、NLCs 和各 QDNLCs 奈米劑型穿透式電子顯微鏡 ... 38
XI
圖十八、以 nile red 螢光強度判斷 NLCs、L-QDNLC、C-QDNLCs 和 P-QDNLCs 之疏水性差異 ... 39 圖十九、Cetyl palmitate、PF-68、NLCs 和各 QDNLCs 之 DSC 熱焓量圖
... 42 圖二十、NLCs 作成劑型後 cetyl palmitate 和 PF-68 之 DSC 圖 ... 43 圖二十一、(A) camptothecin，(B) irinotecan 之體外藥物累積釋放圖 ... 46 圖二十二、L-QDNLCs-1 (左圖) 和 NLCs 對照組-1 (右圖) 之螢光掃描圖
... 48 圖二十三、L-QDNLCs-2 (左圖) 和 NLCs 對照組-2 (右圖) 之螢光掃描圖
... 48 圖二十四、L-QDNLCs-3 (左圖) 和 NLCs 對照組-3 (右圖) 之螢光掃描圖
... 49 圖二十五、L-QDNLCs-4 (左圖) 和 NLCs 對照組-4 (右圖) 之螢光掃描圖
... 50 圖二十六、C-QDNLCs-1 (左圖) 和 NLCs 對照組-1 (右圖) 之螢光掃描圖
... 51 圖二十七、C-QDNLCs-2 (左圖) 和 NLCs 對照組-2 (右圖) 之螢光掃描圖
... 51 圖二十八、C-QDNLCs-3 (左圖) 和 NLCs 對照組-3 (右圖) 之螢光掃描圖
... 52 圖二十九、C-QDNLCs-4 (左圖) 和 NLCs 對照組-4 (右圖) 之螢光掃描圖
... 53 圖三十、P-QDNLCs-1 (左圖) 和 NLCs 對照組-1 (右圖) 之螢光掃描圖 .. 54
XII
圖三十一、P-QDNLCs-2 (左圖) 和 NLCs 對照組-2 (右圖) 之螢光掃描圖 ... 54 圖三十二、P-QDNLCs-3 (左圖) 和 NLCs 對照組-3 (右圖) 之螢光掃描圖
... 55 圖三十三、P-QDNLCs-4 (左圖) 和 NLCs 對照組-4 (右圖) 之螢光掃描圖
... 56 圖三十四、L-QDs 和 L-QDNLCs 在 4 小時被黑色素癌細胞攝入之情形
... 57 圖三十五、C-QDs 和 C-QDNLCs 在 4 小時被黑色素癌細胞攝入之情形
... 58 圖三十六、P-QDs 和 P-QDNLCs 在 4 小時被黑色素癌細胞攝入之情形
... 58 圖三十七、黑色素癌細胞加入控制組與各 QDNLCs 劑型經 12 和 24 小時
的細胞存活率 ... 60 圖三十八、黑色素瘤細胞的細胞遷徙分析 (A) 未經藥物處理 (B) 控制組
DMSO 溶解 camptothecin (C) NLCs (D) L-QDNLCs (E)
C-QDNLCs (F) P-QDNLCs ... 61 圖三十九、奈米劑型螢光強度從左至右分別為 L-QDNLCs、C-QDNLCs 和 P-NLCQDs ... 62 圖四十、利用近紅外螢光活體影像系統觀察在 0 分鐘、1 分鐘、1 小時、
2 小時、4 小時、6 小時、12 小時及 24 小時不同處方 QDNLCs 之螢光變化圖 ... 63 圖四十一、腫瘤的螢光圖像處理：(A) 注射後 24 小時犧牲裸鼠，取下裸鼠
XIII
腫瘤部位的皮膚 (B) 實際腫瘤圖 ... 64 圖四十二、以控制組與不同處方之 QDNLCs 藉由腫瘤內注射 24 小時觀察 camptothecin 累積在腫瘤內的濃度 ... 65 圖四十三、以穿透式電子顯微鏡觀察 F1、F1+QDs、F2 和 F2+QDs 外觀
型態圖 ... 77 圖四十四、以穿透式電子顯微鏡觀察 F3、F3+QDs、F4 和 F4+QDs 外觀
型態圖 ... 78 圖四十五、以 nile red 判斷各劑型 F1、F2、F3、F4、F1+QDs、F2+QDs、
F3+QDs 和 F4+QDs 之疏水性差異 ... 79 圖四十六、SPC、F1、F2、F3 和 F4 之 DSC 熱焓量圖 ... 80 圖四十七、不同微脂粒處方加入 QDs 前後之 DSC 熱焓量變化圖 ... 81 圖四十八、控制組和不同微脂粒處方包埋 camptothecin 體外藥物累積釋放
圖 ... 83 圖四十九、F1 和 F1+QDs 包埋 camptothecin 體外藥物累積釋放比較圖
... 84 圖五十、F2 和 F2+QDs 包埋 camptothecin 體外藥物累積釋放比較圖 ... 84 圖五十一、F3 和 F3+QDs 包埋 camptothecin 體外藥物累積釋放比較圖
... 85 圖五十二、F4 和 F4+QDs 包埋 camptothecin 體外藥物累積釋放比較圖
... 85
XIV
圖五十三、控制組和不同微脂粒處方包埋 irinotecan 體外藥物累積釋放圖
... 86
圖五十四、F1 和 F1+QDs 包埋 irinotecan 體外藥物累積釋放比較圖 .... 87
圖五十五、F2 和 F2+QDs 包埋 irinotecan 體外藥物累積釋放比較圖 .... 88
圖五十六、F3 和 F3+QDs 包埋 irinotecan 體外藥物累積釋放比較圖 ... 88
圖五十七、F4 和 F4+QDs 包埋 irinotecan 體外藥物累積釋放比較圖 .... 89
圖五十八、在不同時間點 F1+QDs 被黑色素癌細胞攝入之圖 ... 90
圖五十九、在不同時間點 F2+QDs 被黑色素癌細胞攝入之圖 ... 91
圖六十、在不同時間點 F3+QDs 被黑色素癌細胞攝入之圖 ... 92
圖六十一、在不同時間點 F4+QDs 被黑色素癌細胞攝入之圖 ... 93
圖六十二、黑色素癌細胞加入控制組 (DMSO 溶解 camptothecin) 與不同 微脂粒處方經 24 小時後的細胞存活率 ... 95
圖六十三、黑色素癌細胞加入控制組 (ddH2O 溶解 irinotecan) 與不同微脂 粒處方經 24 小時後的細胞存活率 ... 95
圖六十四、黑色素癌細胞投與 camptothecin 的細胞遷徙分析圖 (A) 未經藥 物處理 (B) 控制組 DMSO 溶解 camptothecin (C) F1 (D) F1+QDs (E) F2 (F) F2+QDs (G) F3 (H) F3+QDs (I) F4 (J) F4+QDs ... 97
圖六十五、黑色素癌細胞投予 irinotecan 的細胞遷徙圖 (A) 未經藥物處理 (B) 控制組 ddH2O 溶解 irinotecan (C) F1 (D) F1+QDs (E) F2 (F) F2+QDs (G) F3 (H) F3+QDs (I) F4 (J) F4+QDs ... 98
XV
圖六十六、不同微脂粒處方和控制組螢光強度比較 ... 100 圖六十七、利用近紅外螢光活體影像系統觀察 0 分鐘、1 分鐘、1 小時、
2 小時、4 小時、6 小時、12 小時和 24 小時，不同微脂粒處 方包埋 QDs 和對照組相比之螢光圖 ... 101 圖六十八、不同微脂粒處方經腫瘤內注射後 24 小時，取下裸鼠腫瘤部位
的皮膚 ... 102 圖六十九、不同微脂粒處方經腫瘤內注射後 24 小時，犧牲老鼠後實際取
出腫瘤之螢光圖像 ... 103
XVI
表目錄
表一、目前 NLCs 的應用 ... 5
表二、NLCs 和各 QDNLCs 之處方設計 ... 36
表三、NLCs 和各 QDNLCs 物化性質比較 ... 37
表四、各處方中 1H-NMR 的半高寬 ... 40
表五、Cetyl palmitate、PF-68、NLCs 和各 QDNLCs 之熔點 ... 42
表六、NLCs 作成劑型後 cetyl palmitate 和 PF-68 之熔點 ... 43
表七、QDNLCs 之包埋率 ... 44
表八、L-QDNLCs-1 和 NLCs 對照組-1 圖的激發波長及發散波長 ... 48
表九、L-QDNLCs-2 和 NLCs 對照組-2 圖的激發波長及發散波長 ... 49
表十、L-QDNLCs-3 和 NLCs 對照組-3 圖的激發波長及發散波長 ... 49
表十一、L-QDNLCs-4 和 NLCs 對照組-4 圖的激發波長及發散波長 ... 50
表十二、C-QDNLCs-1 和 NLCs 對照組-1 圖的激發波長及發散波長 ... 51
表十三、C-QDNLCs-2 和 NLCs 對照組-2 圖的激發波長及發散波長 ... 52
表十四、C-QDNLCs-3 和 NLCs 對照組-3 圖的激發波長及發散波長 ... 52
表十五、C-QDNLCs-4 和 NLCs 對照組-4 圖的激發波長及發散波長 ... 53
表十六、P-QDNLCs-1 和 NLCs 對照組-1 圖的激發波長及發散波長 ... 54
表十七、P-QDNLCs-2 和 NLCs 對照組-2 圖的激發波長及發散波長 ... 55
表十八、P-QDNLCs-3 和 NLCs 對照組-3 圖的激發波長及發散波長 ... 55
XVII
表十九、P-QDNLCs-4 和 NLCs 對照組-4 圖的激發波長及發散波長 ... 56
表二十、本實驗所用之微脂粒處方 ... 75
表二十一、不同微脂粒處方加入 QDs 後的物化性質 ... 76
表二十二、藥物在不同微脂粒處方中的包埋率 ... 82
1
前言
在台灣十大的死亡因素中癌症居首位，因此癌症的治療是備受醫學界所 關心的。在過去幾年間，科學家積極利用奈米技術製造奈米載體來進行疾 病治療，並成功將其應用於治療許多不同癌症且能有效降低化療後的副作 用。奈米載體系統的應用，主要可延長藥物在體內半衰期以減緩病人用藥
次數，提高藥物的溶解度，以及主動靶向追蹤和定位釋放藥物幾個方面 1。
雖然傳統的奈米載體如乳劑、微脂粒等仍具有其方便性和優勢。但還是有 許多不可避免的缺陷，像乳劑中脂質過氧化、微脂粒的有機溶劑去除不完
全、無法大規模生產及製備價格昂貴等問題 2。因此，科學家又進一步發展
新的奈米載體如奈米結構脂質載體 (nanostructured lipid carriers, NLCs)，主 要是由液態和固態脂質所構成，改善了許多傳統奈米載體的缺點。此外，
近年來亦有科學家發展半導體奈米粒子，被廣泛用於各種生醫監測，包括 癌細胞的標定及追蹤的應用上，稱為量子點 (quantum dots, QDs)3。QDs 的 優勢在於其具獨特的螢光性質，相較於傳統的有機染劑，具有亮度強、光
穩定佳、可調節的光譜、螢光效果較佳等的特點 4,5。故本研究希望試著利
用奈米載體同時包埋抗癌藥物及 QDs，當做為一個多功能的理想奈米劑型 使用，一方面可達到治療效果，另一方面又能追蹤癌細胞作為監測及診斷 之用。
2
第一章、緒論
1.1、使用奈米載體劑型的介紹
1.1.1、奈米結構脂質載體 (nanostructured lipid carriers, NLCs)
新型脂質奈米載體系統於西元 1990 年代初被開發，取代傳統載體系統 例如乳劑、微脂粒和聚合物奈米粒子，其中以固態脂質奈米微粒 (solid lipid nanoparticles, SLNs) 最先被發展 2。SLNs 主要由固體脂質，乳化劑與水所 組成。SLNs 具有下列優點為：由固態脂質組成物理安定性佳、無生理毒性、
且具生物可分解性、容易大量製備及滅菌、相較於微脂粒可避免有毒的有 機溶劑等。但 SLNs 作為藥物載體仍有許多的限制，如 (圖一) 所示 SLNs 因為在長期儲存之下會形成完美結晶型態而將藥物排除出去，以致包埋率 降低。因此繼 SLNs 之後發展出 NLCs，NLCs 是由固態脂質再加入部分 液態油脂製備而成，也因添加液態油脂，使得藥物易溶於液態油脂中，且 會破壞原本 SLNs 的完美結晶型態，故 NLCs 可提供較高的包埋藥物能力 和較長時間的安定性 6。
圖一、SLNs 及 NLCs 晶體結構比較6
3
NLCs 是由液態油脂和固態脂質所混合，依據不同的組成和製備方式分 為三種型態 (圖二)，第一種為 imperfect type 是使用少量液態油脂和固體 脂質相混合，固態脂質受到液態油脂的干擾，在晶格裡形成不完美結晶，
如此一來可以包埋更高的藥量；第二種 structureless type 室溫下雖然成固 態，但完全無結晶型態形成，可避免結晶擠壓而藥物釋出；第三種 multiple type 是液態油脂於固體脂質中，而固體脂質分散於水中，當藥物在液態油 脂溶解度高於在固體脂質時，則會形成固體材料含有極小的液態油質奈米 分隔 (nanocompartments)，藥物易儲存在液態油脂隔間裡，因此可以增加藥
物包埋能力，並且固體脂質包圍著奈米隔間，所以可以延長藥劑釋放 2。結
構型態可由 NMR 及 DSC 的測量證實，DSC 可測相變化溫度的轉移，了 解結晶型態是否有所改變，NMR 則可測半高寬，藉以了解液固態脂質在載 體中之流動性 7。
(A) (B) (C)
圖二、NLCs 三種型態：(A) imperfect type，(B) structureless type，(C)multiple type2
4
NLCs 的製備方法2 :
( 一 ) 高 剪 力 均 質 (high shear homogenization) 和 超 音 波 震 盪 法 (ultrasound)，此方法最早被使用，雖然操作容易，但粒子的分散性差、均一 性不夠，且在超音波震盪時容易被金屬汙染，因此限制此方法的使用。
(二) 高壓均質法 (high pressure homogenization)，使用在奈米級乳劑已 有數年，運作原理係利用高壓幫浦加壓，藉由高壓均質閥內截面積縮減流 道，將原先的高壓混合液轉換為高速混合液。高壓均質法又分為熱均質和 冷均質。冷均質法是將脂質與活性成分加熱溶解混合，利用液態氮或乾冰 快速冷卻，經機械研磨粉碎成脂質粉末，在高速攪拌下將粉末分散於冷的 界面活性劑水溶液中，進行高壓均質。熱均質法是先將脂質和活性成分加 熱溶解混合後，在高速攪拌下倒入熱的界面活性劑水溶液中，溫度在脂質 或高於脂質的熔點下進行高壓均質。
(三) 微乳法 (microemulsion)，已融化的固態脂質、液態脂質、藥物、
乳化劑與溫水形成外觀透明的 o/w 微乳劑，在攪拌條件下將微乳劑分散在 冷水中即可得到。
5
NLCs 被廣泛應用於藥物和化妝品傳遞的系統上，如 (表一) 是目前正 在研究並開發中的產品。
表一、目前 NLCs 的應用
Drug Implications
Lovastatin8
Enhancement of encapsulation efficiency Improvement of oral bioavailability Improvement of stability in GI environment
Vinpocetine8 Improvement of oral bioavailability
Coenzyme Q109 Improvement of skin bioavailability
TiO２9 Improvement of skin bioavailability
Wilder ginger9 Improvement of skin bioavailability
Urea9 Improvement of skin bioavailability
6
1.1.2、微脂粒 (liposomes)
微脂粒於西元 1965 年由英國劍橋的 Alec Bangham 首度提出微脂粒 的概念，此時之微脂粒主要是做爲模擬生物膜來使用10。在西元 1970 年代，
微脂粒首先被應用於藥物載體上，引起一股研究微脂粒劑型的風潮。但直 到 1990 年才有第一個經由美國 FDA 核准之微脂粒劑型 amphotericin B (Ambisome®) 上市，主要是用於全身性黴菌感染之治療11。近幾年來隨著生 物技術和科技之進步，才使得微脂粒的研究又熱門起來。
微脂粒是由天然或合成脂質所組成，在水中分散時具有自我聚集12
(self-assembly) 特性，進而形成脂質雙層的中空球體 (圖三)，其直徑範圍在 幾十個毫微米 (nm) 到幾十個微米 (μm) 之間。因為 (圖四) 具有特殊的球 形結構，所以可同時作為疏水性 (hydrophobic) 及親水性 (hydrophilic) 藥 物的載體，疏水性藥物可以嵌入脂質雙層中，而親水性藥物則可包埋在微
脂粒內層的水相中13。另外微脂粒由磷脂質構成，因與細胞膜成份相同，具
有良好的生物相容性 (compatible)14 及生物可分解性 (biodegradable)15，且 作為藥物載體經修飾後可具有主動靶向性及持續性緩慢藥物釋放系統。近
年來微脂粒被廣泛的使用在當作傳遞載體上，亦普遍的應用在癌症治療16。
7
圖三、脂質在水中形成微脂粒圖17
圖四、藥物在微脂粒內部的分佈情形18
8
微脂粒以結構分類 (圖五)12： (1) Multilamellar vesicle (MLV)
是具有多層脂雙層之微脂粒，一般而言，乾燥後的脂質薄膜，直接水合 後，即形成 MLV，但製備後體積通常較大，粒子大小介於 100-1000 nm。
特色是內具多層脂質膜，可層層釋出包埋的藥物並能達到持續釋放的效果。
一般而言多在五層以上；小於五層的 MLV 又稱為 oligo-lamellar liposomes 或 paucilamellar vesicle。
(2) Large unilamellar vesicle (LUV)
是單層脂雙層所構成的微脂粒，一般是介於 25-250 nm 的微脂粒。
(3) Small unilamellar vesicle (SUV)
是單一層脂雙層所構成的小微脂粒，但粒徑較小，一般是介於 20-50 nm 的微脂粒，可穿過血管壁，但缺點為包埋藥物率低。
圖五、微脂粒的結構分類12
MLV
LUV
SUV
9
微脂粒的製備有以下常見的方法：19
(1) 薄膜振搖法 (thin film method; hand-shaking method)
Alec Bangham 最初就是用此法製備。首先將磷脂質溶於有機溶劑中，
以減壓濃縮機將有機溶劑去除後，在瓶壁會形成脂質薄膜，再加入水相溶 液產生水合作用以手搖或超音波震盪的方式，即可形成多層膜微脂粒。
(2) 冷涷-再解凍 (freeze-thaw)、均質 (homogenization) 及超音波震盪法 (sonication method)
以超音波震盪將其均質化，並反覆冷凍再解凍的方式造成微脂粒的破裂、
重組及再密合，形成大小均勻的單層微脂粒。
(3) 界面活性劑溶解法 (detergent solubilization)
利用界面活性劑的特性，和磷脂質均勻混合形成微胞 (micelles)，之後 將界面活性劑去除，微胞最後會漸漸形成單一脂雙層的微脂粒。
(4) 溶劑注射法 (solvent-injection method)
先將磷脂質先溶於有機溶劑 (如：乙醚或乙醇) 中，接著注入至水相溶 液中，混合以形成水包油乳狀液，再移除有機溶劑後所得到之單層微脂粒。
(5) 逆相蒸發法 (reverse-phase evaporation method)
水溶液和過量含磷脂質之有機溶劑混合成油包水乳劑，再將有機溶劑去 除所形成微脂粒。
10
1.2、量子點 (quantum dots, QDs)
最早是在 1982 年由 A. L. Efros 等人發現在某些半導體材料於奈米的 大小下會發出螢光，此即命名為 QDs 3。QDs 是奈米級的半導體螢光材料，
直徑範圍在 2~20 nm 之間 (圖六)。而硫化鋅 (ZnS) 則是 QDs 上的塗層 材料，被認為是必要的，以其殼作為一種抗氧化劑可保護核心和提高其穩 定性 20。
圖六、QDs 結構21
雖然 QDs 主要是以化學週期表上 II-VI 族或 III-V 族元素組成的 22。 其中 QDs 螢光效能以以鎘為最高，螢光能透較深層的組織，因此能應用在 動物甚至人體實驗中。現今最常被拿來利用為 CdSe、CdTe、CdS。QDs 具 有獨特的光譜特性，如限量化效應 (圖七)23，當 QDs 粒徑發生變化時，會 分別發出藍色、綠色及接近紅色的螢光。這種尺寸效應，吸引了許多學者 投入 QDs 研究，探討其螢光顏色的調控、螢光效能、生物相容性的提升等。
11
且 QDs 和傳統有機螢光染料分子相比有更多在生醫應用上的優勢：螢光亮 度強、光化學穩定性佳、用單一波長雷射就可激發不同粒徑的 QDs 發出多 種波長的發射波、發射波狹窄且對稱、可重複激發等。以紅色染劑若丹明 (rhodamine 6 G) 為例，QDs 亮度為它的 100 倍24，在時間穩定上 QDs 可 持續發光 240 分鐘，而 rhodamine 6 G 卻僅能維持 6 分鐘 25。
圖七、QDs 限量化效應：不同尺寸的 QDs 可以發射出不同顏色23
但由於開始製備技術困難、產率低、穩定性不高等原因，其應用研究未 取得很大突破。直到解決了 QDs 本身水溶性不佳和生物相容性的問題, 才 開啟 QDs 應用於生醫領域上的研究26。剛合成的 QDs 外層是屬於直鏈的 烷基，使得原始表面特性是呈現疏水性，無法直接與生物分子作用，若要 應用於水相系統，特別是生物與生醫相關領域，則需進行表面親水化修飾
27。常見的方法有三種，第一種是以含硫醇基 (-SH) 及親水端 (COO-) 的
12
雙官能性分子置換 QDs 表面的疏水性分子，硫醇基與 CdSe 或 ZnS 表面 鍵 結 ， 親 水 端 則 自 QDs 向 外 伸 展 至 水 溶 液 中 ， 如 ( 圖 八 ) 所 示 以 mercaptocarbonic acid 加入為例28。而當使用含超過一個硫醇基的分子，可
圖八、利用 mercaptocarbonic acid 上的硫醇基置換 QDs 表面 28
增加鍵結能力，有助於長時間的水相安定性。第二種方法是藉由矽化處理 (silanization) 形成極性化的外殼，如 (圖九) 所示也就是在 ZnS 被覆蓋之 QDs 的表面再被覆一層 SiO2，隔絕 QDs 外層增加水溶性 29。第三種方法 是藉著兩性高分子聚合物如 (圖十) lipo-polymer 或 amphiphilic diblock copolymers 嵌入 QDs 表面使其疏水端穩定，利用聚合物的親水端溶於水 相中以達到親水性的目的 30。
13
圖九、利用 silanization 方式修飾 QDs 表面 29
圖十、利用 polymer 方式修飾 QDs 表面30
14
QDs 具有多種特點而有以下的應用 31-34：生物高敏感性，QDs 螢光亮 度夠，通常在螢光顯微鏡下就可以直接觀察到 QDs 的螢光性。多色同時標 記，QDs 的螢光顏色具有很好的調控性，藉由同一激發波長激發大小不同 的 QDs 即可觀察到不同顏色，故可控制粒徑大小其螢光波長的範圍則可由 紫外光到紅外光。活體動態即時監測和細胞標定，由於 QDs 具有螢光強度 強、產率高和光穩定性佳等特性，因此可以同時滿足體外細胞組織螢光標 定和長時間動態跟蹤監測的需要，成為活體靶向追蹤和動態影像的理想標 記物。已有許多細胞和動物實驗表明 QDs 標記技術在活體研究中應用的可 行性 35。(圖十一) 表示 QDs 在各種生物應用上發展的潛力25。
圖十一、QDs 在生物應用上的種類25
15
1.3、模式藥物 1.3.1、Camptothecin
Camptothecin 於 1960 年代被 M. E. Wall 和 M. C. Wani 利用系統篩 選天然物發現，屬於一種具有細胞毒性喹啉類 (quinoline) 生物鹼，在分子 結構式 (圖十二) 中以 lactone 環對活性最為重要36。但經過二十年後，人 們才真正清楚 camptothecin 的抗腫瘤藥理機轉，是通過選擇性抑制 DNA 之 topoisomerase I (Topo I) 達到抑制癌細胞的作用 37。而在 1996 年，美國 藥物食品管理局 (FDA) 已核准兩種 camptothecin 水溶性衍生物上市，分 別是 topotecan 與 irinotecan，主要臨床用於治療卵巢癌、小細胞肺癌及直 腸結腸癌 38。
圖十二、Camptothecin 結構圖
在 DNA 複製和重組中，Topo 扮演相當重要的角色，它可分為 type I 跟 type II 兩種主要的形式，type I 會造成 DNA 單股的斷裂；type II 會造 成 DNA 雙股的斷裂。在正常情形下 DNA 的結構是呈現雙股螺旋 (double
16
helix)，但當 DNA 進行複製時，因複製時會增加扭張力使得末端 DNA 形 成超螺旋結構，此時 Topo I 便會鍵結至 DNA 的其中一股產生切斷鬆弛扭 張力，於是完整通過的單股便作為合成新股的複製模板 (template)，之後 Topo I 又 會 重 新 將 斷 裂 處 修 復 連 結 ， 修 復 完 成 後 便 離 開 DNA 。 Camptothecin 的藥理機轉是對 Topo I 會產生穩定作用 (圖十三)，當 DNA topoisomerase I 形 成 topoiosmerase I-DNA ， camptothecin 再 與 topoisomerase I-DNA 結合形成 CPT-DNA-Topo I ternary complex，對於 DNA 的合成會產生物理性的屏障，阻止複製的進行，最後導致細胞死亡39。
圖十三、Camptothecin 機轉圖 (CPT 即為 camptothecin) 39
17
Camptothecin 性質與一般生物鹼不同，並無明顯的鹼性。且在溶解度上，
不易溶於水和大多數的一般有機溶劑，只能溶於少許有機溶劑如氯仿、
DMSO、甲醇。因此當藥物進入人體後，缺乏好的溶解度，使得人體無法有
效吸收 40。除了溶解度不佳外，雖然初步的動物臨床試驗中雖然發現具有明
顯 的 抗 癌 活 性 ， 卻 對 病 人 有 嚴 重 的 藥 物 不 良 反 應 如 骨 髓 抑 制 (myelosuppression) 、 出 血 性膀 胱 癌 (haemorrhagic cystitis) 、 胃腸 道 毒性 (gastrointestinal toxicities)41。由於上述這些缺點無法真正在臨床上使用。
1.3.2、Irinotecan
Camptothecin 臨床使用上的限制，使得各界紛紛投入 camptothecin 衍 生物的開發與研究。其中以 irinotecan 最具發展性，主要是對於結構 (圖十 四) 的修飾，雖然 irinotecan 本身還是以五個相連雜環為主體，但在 C-9 的 位置外接一個 dipiperidino 的支鏈，大大提升了對水的溶解度且具有臨床療 效 佳 及 副 作 用 低 等 的 優 點 。 於 是 在 1996 年 ， 美 國 FDA 正 式 批 准 irinotecan 用於對轉移性大腸直腸癌第一線藥物無效的病患 36。
圖十四、Irinotecan 結構圖
18
Irinotecan 是 一 種 前 驅 藥 物 (prodrug) ， ( 圖 十 五 ) 在 體 內 中 被 肝 臟 carboxylesterase 酵素代謝為活性代謝物 SN-38，其抗癌活性為 irinotecan 的 100 至 1000 倍之多36，藥理機制和 CPT 相同皆為與 Topo I 結合針對 細胞週期的 S 期，抑制去氧核糖核酸 A 之 Topo I，誘導單股 DNA 產生 缺陷，使細胞無法進行 DNA 複製，造成細胞死亡而使腫瘤縮小 42。而 SN-38 經由膽紅素尿苷二磷酸葡萄醣醛酸酶 (UDP-glucuronosyltransferase, UGT1A1) 催化之後，便經由膽汁和尿液排出。
圖十五、Irinotecan 代謝機轉圖43
19
1.4、研究動機
一種新的奈米粒子在這幾年來不斷的被研究，即 QDs。它不但具有細 胞標定的用途，更可用於癌症的診斷和藥物治療效果的評估上。但 QDs 在
應用上也有一些缺陷，例如潛在的生物毒性 21、經腫瘤內注射後滯留時間短
44、單一注射 QDs 劑量所需較高和在體內蛋白質吸附至 QDs 也會導致螢 光消滅 45。為解決這個缺點的方法之一是將 QDs 包埋進入奈米劑型中。如 此一來不但可以降低劑量避免高濃度所帶來的毒性，也可增加生物相容性 和螢光穩定性。本實驗的目的是想藉由 QDs 和藥物同時包埋於奈米載體，
形成多功能奈米載體後，再進行一系列的物化性質、細胞和動物實驗做比 較，篩選出更具有潛力的多功能奈米載體。本研究分兩部分進行，第一部 分是利用 NLCs 包埋不同性質的 QDs 作為探討，而第二部分則是選用第 一部分篩選過的 C-QDs ，再以不同微脂粒處方包埋同一種 QDs 作為研究。
在模式藥物選擇上，雖然 camptothecin 有良好抗腫瘤活性，卻因嚴重副作 用且生物相容性不佳，所以臨床上是使用經 camptothecin 半合成後的化合 物 irinotecan，但半合成衍生物使用也是相對費時和昂貴。故我們希望藉由 劑型方面的改變，能使 camptothecin 生物相容性增加 40，且達到控制藥物 緩釋的效果以降低其副作用。
20
實驗流程
第一部分：NLCs 選擇不同的 QDs 製備成 QDNLCs 劑型 第二部分：不同微脂粒處方包埋 QDs
• 製備方式：薄膜震搖法、均質法和超音波震盪法
奈米劑型之物化性質
• 顆粒粒徑、表面電位 (zeta potential) 和界面張力 (surface tension)
• 穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscope) 觀察
奈米劑型之結構型態
• 利用 1H-NMR 觀察劑型內固態油脂的流動性
• 示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC)
奈米劑型包埋不同的模式藥物 camptothecin、irinotecan
• 藥物包埋率測定
• 藥物之體外釋放實驗
奈米劑型之細胞實驗
• 黑色素癌細胞 (melanoma cell) 細胞毒性分析
• 黑色素癌細胞攝入之觀察
• 細胞遷徙實驗
奈米劑型之動物實驗
• 觀察奈米劑型經腫瘤內注射 (intratumor) 24 小時之螢光變化
• 腫瘤內藥物含量
21
第二章、材料與方法
2.1、材料
品名 廠牌 產地
Acetonitrile J.T. Baker U.S.A Acetone Mallinckrodt U.S.A.
Camptothecin Sigma-Aldrich U.S.A.
Cetyl palmitate Acros Belgium Cholesterol Sigma-Aldrich U.S.A.
Coconut oil Sigma-Aldrich U.S.A.
Dimethyl sulfonate (DMSO) Sigma-Aldrich U.S.A.
Distearoyl
phosphatidylethanolamine-pol yethylene glycol (DSPE-PEG) (DSPE-050CN)
NOF Japan
Ethanol J.T. Baker U.S.A.
Fluorescein isothiocyanate
(FITC) Sigma-Aldrich U.S.A.
Irinotecan Sigma-Aldrich U.S.A.
Methanol Mallinckrodt U.S.A.
3-(4,5-demethylthiazol)-2,5-di phenyltetrazolium bromide (MTT)
Sigma-Aldrich U.S.A.
Myverol 18-04K® Quest Netherlands
Nile red Fluka U.K.
Pluronic F-68 (PF-68) Sigma-Aldrich U.S.A.
Polyvinylidene fluoride
(PVDF) filter 0.45 μm Millipore U.S.A.
Qdot® 800 ITK organic QDs
(L-QDs) Invitrogen U.S.A.
Qdot® 800 ITK carboxyl QDs
(C-QDs) Invitrogen U.S.A.
Qdot® 800 ITK amines PEG QDs
(P-QDs)
Invitrogen U.S.A.
22
Regenerated cellulose tubular membrane
(M.W. cutoff = 6000~8000)
Cellu-Sep® T2 U.S.A.
Span® 20 Sigma-Aldrich U.S.A.
Soybean phosphatidylcholine (SPC)
American Lecithin
Company U.S.A Stearylamine Sigma-Aldrich U.S.A
23
2.2、儀器
儀器 廠牌型號 產地
微量天秤 Mettler Toledo MonoBloc
AB54-S Switzerland 電子天秤 Mettler Toledo MonoBloc
PB602-S Switzerland
恆溫循環水浴鍋 Cherng Huei Taiwan
水浴震盪器 Delta DC 200H Taiwan
超音波震盪器 Bransan 5510 U.S.A.
超高速離心機 Beckman Coulter®
Allegra® 21R U.S.A.
高效液相層析儀器 (HPLC) Hitachi L-2000 series Japan HPLC 層析管柱 Merck Darmstadt Germany 粒徑測定儀 Malvern Nano ZS® 90 U.K.
表面張力測定儀 Kyowa CBVP-A3 Japan
高速均質機 PRO Scientific Pro-250 Germany 冷凍乾燥機 Labconco Freezone 4.5 U.S.A.
示差熱掃描分析儀 Thermal analyers DSC
Q2000 U.S.A.
穿透式電子顯微鏡 Joel JEM-1230 TEM Japan
真空乾燥機 Edwards, RV3 U.S.A
體外擴散玻璃裝置 慶發玻璃儀器商行 Taiwan
原子吸收光譜 Hitachi Z-5000 Japan
24
高頻探針式超音波產生儀 Sonics and Materials VCX
600 U.S.A.
pH meter Suntex SP-701 Taiwan
組織研磨機 Hisangtai DC-3F Taiwan
25
2.3、實驗方法
第一部分 NLCs 包埋不同性質 QDs 作一系列之研究 1、QDNLCs 奈米劑型的製備
NLCs 的處方主要可分為油相、水相。油相為固態脂質 cetyl palmitate (2
％)、液態脂質 coconut oil (6％)、親油性乳化劑 Myvreol® (0.3％)，水相為 親水性乳化劑 PF-68 (2.5％)、ddH2O (89. 2％)。QDNLCs 則是再加入 QDs (20 μl) 亦用同樣的方式，若選擇親水性的 C-QDs 和 P-QDs 則加入水相，
而選擇 L-QDs 為親油性則加至油相。另外加入藥物的處方亦是相同的處理，
camptothecin (8 mg) 為親脂性，則加 入油相中。而若是 包埋另一藥物 irinotecan (14.3 mg) 因 irinotecan 經 camptothecin 修飾後為親水性，則加 入水相中。接著將油相及水相分別置於 85 0C 水浴鍋中加熱 15 分鐘，主 要是使油相中固態油脂能與液態油脂互溶。完成後再將水相加入油相中，
之後用均質機以 12000 rpm 轉速均質 10 分鐘。最後再用超音波震盪機在 35 watts 的條件，分別做 3 次各處理 10 分鐘，冷卻至室溫即可得到劑型。
2、顆粒粒徑測定
將製備好的劑型放置室溫冷卻，並以 ddH2O 稀釋 100 倍後，取約 1.5 ml 的量注入四面拋光的 cuvette 中，用動態光散射粒徑介面電位測定儀 (Malvern ZS90®，UK) 選擇 size 做分析，重複 3 次取其平均值。動態光
26
散射粒徑介面電位測定儀原理主要是以 90 度角可偵測到粒子的散射，並 在波長 636 nm 之氦氖雷射進行掃描，且經電腦內的軟體 Dispersion Technology Software 5.0 (DTS) 計算，掃瞄範圍為 3~3000 nm。
3、表面電位 (zeta potential) 測定
將製備好的劑型取 1.5 ml 於注射針筒注入 zeta 電位樣品室，以動態光 散射粒徑電位測定儀選擇 zeta potential 進行測定，重複三次取其平均值。
在電場中，主要會被兩力影響，分別為帶電粒子會往帶有相反電荷的電極 移動造成分散溶液的移動力，而另一力則為黏滯力，阻止帶電粒子移動，
當兩者達成平衡時，帶電粒子會以一固定之速度移動。
4、界面張力 (surface tension) 測定
將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 5 ml 置於培養皿中，以劑型液面 覆蓋整個培養皿底部，利用界面測定儀 (Kyowa CBVP-A3, Japan) 測定，並 讀取 20 秒內之數值予以記錄。原理是使用白金片連結交流信號調節放大 器，利用 Wilhelmy plate 方法測定培養皿中樣品。
27
5、穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscope, TEM) 觀察 QDNLCs 型態
將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 10 μl 滴於 3 mm 200 mesh 鍍碳 銅網上，30 秒後以濾紙吸乾多餘的水分，接著在 10 分鐘後取 10 μl 的 1
﹪ phosphotungstic acid 當作負染色，滴於鍍碳網上，30 秒後再吸乾多餘 的水分，接著置於乾燥箱放置一天乾燥，完成後利用穿透式電子顯微鏡 (Joel JEM-1230 TEM) 觀察脂質奈米微粒的型態。
6、QDNLCs 之疏水性試驗
將 2.5 mg nile red (NR) 用 acetone 定量至 100 ml，取 1 ml 空樣品瓶 中，將著以真空乾燥機將 acetone 去除後，將此含 NR 之樣品瓶製備總重 量 10 g 之 QDNLCs 劑型，NR 最後濃度為 2.5 μg/ml。將劑備後的劑型取 約 1 ml 置入四面拋光的石英 cuvette 中，再以螢光光譜掃描，螢光條件為 激發波長是 546 nm，發散波長範圍是 550 至 700 nm，藉以判斷劑型的疏 水性。
7、以 1H-NMR 觀察 QDNLCs 內固態脂質的流動性
NMR 的半高寬為訊號峰高度一半時的訊號寬度 (單位 Hz)，可做為奈 米劑型內固態脂質的流動性指標。將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 0.2
28
ml 再加入 0.4 ml 的 D2O 稀釋 3 倍，將配好的溶液置入 NMR tube 中，
以 1H-NMR (Bruker AVANCE-400, Germany) 分析，紀錄固態脂質的半高 寬。
8、示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC)
取約 3 mg 經凍晶乾燥後去除水分的劑型，置於空的鋁製小碟盤，並經 加壓密封後，當做樣品組。而空白組則為空的鋁製小碟盤，做為標準品。
並分別置於示差熱掃描分析儀 (Thermal analyers DSC Q2000, USA) 內測量 熱量變化，條件設定為由 30 0C 開始升溫，以每分鐘 10 0C 為升溫速率，
加熱至 80 0C。
9、QDNLCs 之藥物包埋率測定
將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 0.8 ml 置於離心管中，以超高速 離心機 (Beckman Coulter® Allegra® 21R) 在 48000 rpm、4 0C 條件下離心 30 分鐘。離心完後吸取下層澄清水溶液，並將水溶液以 PVDF filter 0.45 μm 過濾後，以 ddH2O 稀釋 100 倍後，藥物藉由 HPLC 進行分析，QDs 則 由原子吸收光譜分析。
包埋率公式：Encapsulation efficiency (％) = (Wa-Wb)/Wa×100％
Wa：原始藥物量
29
Wb：以 HPLC 分析下層澄清液未包埋於劑型的游離藥物量 藥物之 HPLC 分析條件
層析管柱：Merck LiChrospher® RP-18e in column LiChroCART250-4 偵測器：Hitachi L-7485
自動注射器：Hitachi L-7200 幫浦：Hitachi L-7110
波長：Camptothecin 激發波長為 360 nm 發散波長為 440 nm Irinotecan 激發波長為 360 nm 發散波長為 440 nm 注射體積：20 μl
移動相流速：1 ml/min
移動項比例：Camptothecin (pH=2:acetonitrile=65:35) Irinotecan (pH=2:acetonitrile=60:40)
10、QDNLCs 包覆藥物之體外釋放實驗
本實驗採用 (圖十三) Franz 直立式擴散式裝置，是上下分離式的擴散 裝置。上端是施藥端 (donor site) 的中空玻璃管，為放置 0.5 ml 不同處方 的樣品，以 Parafilm® 封口。下端為受藥端 (receptor site) 是一圓柱雙層玻 璃槽，內部填充 5.5 ml 的 30％ ethanol pH = 7.4 磷酸鹽緩衝溶液，底部放 入磁石攪拌時並置於多磁點攪拌器上以 600 rpm 速度攪拌。上下容器兩端
30
接觸面積截面積為 0.785 cm2，中間以人工膜 (M.W. cutoff = 6000~8000) 當 作穿透障壁，再以金屬固定夾固定之，而在受藥端之內外玻璃夾層間填充 37±1 0C 循環水浴，利用不同的時間點 2、4、6、8、10、12、24、30 小時 抽取藥液 0.3 ml，且在受藥端注入 0.3 ml 磷酸鹽緩衝溶液，以維持裝置容 器內溶液的固定量，最後以 HPLC 分析受藥端藥品釋放累積量。
圖十六、Franz 直立式擴散式裝置
11、以非侵入性活體影像系統 (non-invasive in vivo imaging system, IVIS) 全 波長掃描 QDNLCs 內之螢光圖
將製備完成的 QDNLCs 劑型冷卻至室溫後，以 IVIS 全波長掃描，觀 察其劑型之螢光性。激發波長從 430 nm 以 35 nm 為間隔掃描掃至 710 nm，而發散波長範圍則為 430 nm 以 20 nm 為間隔描掃至 840 nm。
12、以螢光顯微鏡觀察黑色素癌細胞 (melanoma cell) 攝入 QDNLCs 將 2 x 105 的黑色素癌細胞加入 6-well plate 中，待隔天細胞完全貼
31
上後，吸走培養液之後，加入 1 ml 新的 median 和 100 μl 的 NLCs 包埋 QDs 劑型，做 4 小時觀察黑色素癌細胞攝入 QDNLCs。染細胞核則是使 用 DAPI (100 ng/ml) 染 30 分鐘。
13、QDNLCs 包埋 camptothecin 之細胞毒性分析
將 1012 的黑色素癌細胞加入 6-well plate 中，待隔天細胞完全貼上後，
吸走培養液之後，加入 1 ml 新的 median 和 10 μl 的劑型，分別在 12 和 24 小時之後，吸走 median 並加入 5 mg/ml MTT，2 小時後將混和溶液移 除，加入 200 μl DMSO，以 ELISA 在 550 nm 下測吸光值。
14、QDNLCs 抑制細胞遷徙實驗
本實驗是評估藥物抑制黑色素瘤細胞轉移能力的效果。將 2 x 105 的黑 色素癌細胞加入 6-well plate 中，待細胞形成完整的單層後，利用 pipette tip 尖端在細胞層上畫出固定傷口，細胞碎片則用 PBS 洗滌。接著細胞加入稀 釋 100 倍後的 DMSO 溶 camptothecin 和各處方含藥並觀察 0、24、36 小 時黑色素瘤細胞轉移的情形。
15、利用近紅外螢光活體影像系統 (Pearl® Impulse Image) 觀察不同時間點 之 QDNLCs 螢光變化
32
將 106 個皮膚黑色素癌細胞利用胰島素空針以皮下注射方式注射 50 μl 至 8 週大的裸鼠，帶腫瘤長出再進行實驗。使用 27 G 的胰島素空針，
取 50 μl 的劑型注於裸鼠背部的腫瘤中。並以近紅外螢光活體影像系統 (Pearl® Impulse Image) 觀察老鼠在不同時間 0 分鐘、1 分鐘、1 小時、2 小時、4 小時、6 小時、12 小時、24 小時，QDNLCs 在腫瘤身上之螢光 變化。
16、QDNLCs 經腫瘤內注射之藥物含量
使用 27 G 的胰島素空針，取 50 ul 的劑型注於裸鼠背部的腫瘤中。經 過 24 小時後，將動物以過量的乙醚麻醉致死後，用解剖工具取下生於老 鼠背後的腫瘤組織，秤重在倒入磨皮器中，加入 1 ml methanol，以組織研 磨器研磨 5 分鐘，溶液成乳靡狀即表示研磨完全。接著置於高速離心器中 條件為 12000 rpm，離心 10 分鐘，抽取上清液用 0.45 μm PVDF 膜過濾 以 HPLC 分析腫瘤內注射藥物含量。
17、統計方法
統計方法的分法採用 Student’s t-test，透過 WINKS 計算以 p 值 0.05 來分別兩種不同的條件之間有沒有統計上的意義。
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第二部分 不同處方之微脂粒包埋 QDs 做一系列之研究 1、微脂粒包埋 QDs 的製備
將處方中所需要的試劑一同放入圓底燒瓶內，加入 5 ml 氯仿：乙醇 (2：
1) 的混合溶液，並使其完全溶解。將完全溶解的混合溶液利用減壓濃縮機，
溫度控制在 50 0C 除去有機溶劑，此時 SPC 等試劑會在圓底燒瓶的壁上 形成一層半透明的薄膜，而後置於真空乾燥機抽真空 6 小時，將殘留的有 機溶劑抽乾。隔天將含有藥物 camptothecin 或是 irinotecan (濃度皆為 2.875 mM) 及 C-QDs (7.2 μg/ml) 的水溶液加入圓底燒瓶內，之後用均質機以 12000 rpm 轉速均質 10 分鐘。最後再用超音波震盪機在 35 watts 的條件，
分別做 3 次各處理 10 分鐘，冷卻至室溫即可得到劑型。
2、微脂粒包埋 QDs 之顆粒粒徑及表面電位測定
將製備好的劑型放置室溫冷卻，測定顆粒粒徑及表面張力，參考第一部 分之實驗方法。
3、以穿透式電子顯微鏡比較微脂粒有無包埋 QDs 之外觀型態 將製備完成的劑型冷卻至室溫後，參考第一部分之實驗方法。
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4、微脂粒包埋 QDs 之疏水性試驗
以 2.5 μg/ml nile red (NR) 之樣品瓶，抽乾後製備微脂粒，參考第一部 分之實驗方法。
5、示差熱掃描分析儀
將劑型凍晶乾燥後去除水分，參考第一部分之實驗方法。
6、微脂粒同時包埋 QDs 和藥物之包埋率測定 參考第一部分之實驗方法。
7、微脂粒同時包埋 QDs 和藥物之體外釋放實驗 參考第一部分之實驗方法。
8、細胞攝入不同種類微脂粒包埋 QDs 之觀察
觀察不同時間點 0、2、4、6 小時細胞攝入不同種類微脂粒包覆 QDs 之變化，參考第一部分之實驗方法。
9、微脂粒包覆藥物和 QDs 之細胞毒性分析 參考第一部分之實驗方法。
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10、微脂粒包覆藥物和 QDs 之細胞遷徙實驗 參考第一部分之實驗方法。
11、利用近紅外螢光活體影像系統觀察不同時間點之微脂粒包埋 QDs 之螢 光變化
參考第一部分之實驗方法。
12、統計方法
統計方法的分法採用 Student’s t-test，透過 WINKS 計算以 p 值 0.05 來分別兩種不同的條件之間有沒有統計上的意義。
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第三章、實驗結果與討論
第一部分 NLCs 包埋不同種類 QDs 作一系列之研究 1、QDNLCs 的處方設計
本研究 QDNLCs 劑型利用高速剪切法 (high shear homogenization) 與 超音波震盪法 (ultrasonication method) 製備。QDNLCs 是 NLCs 包埋 QDs 所組成。NLCs 是由固態脂質、液態油脂、親水性乳化劑和親油性乳 化劑四種成分所組成。Cetyl palmitatey，常使用作為 NLCs 的固態脂質。
以 coconut oil 作為液態油脂。處方乳化劑選擇以 PF-68 為水相界面活性 劑，Myverol® 作為油相界面活性劑。而 QDs 方面我們則選用三種 QDs，
分別為親油型 L-QDs、PEG 修飾後的親水性 P-QDs 和 carboxyl 修飾後的 親水性 C-QDs，其激發波長和發散波長皆為 405 nm 和 800 nm，且粒子大 小都為 18 nm。處方設計如 (表二):
表二、NLCs 和各 QDNLCs 處方設計 Composition (％)
Code Cetyl palmitate
Coconut
oil PF-68 Myverol L-QDs C-QDs P-QDs
NLCs 2 6 2.5 0.3 - - -
L-QDNLCs 2 6 2.5 0.3 0.2 - - C-QDNLCs 2 6 2.5 0.3 - 0.2 - P-QDNLCs 2 6 2.5 0.3 - - 0.2
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2、QDNLCs 的物化性質
在粒徑大小 (size) 的變化上，如 (表三) 所示，只有 NLCs 劑型時平 均粒徑大小為 221 nm，當包埋 QDs 後粒徑大小增加為 245 nm (p < 0.05)，
而三個不同的 QDNLCs 粒徑大小互相比較後沒有顯著性差異 (p > 0.05)。
粒徑離散程度 (polydisersity index, PDI) 表示粒徑中的分散程度，數值愈低 顯示微粒愈接近單一粒徑，一般則以小於 0.3 為最佳值。在此實驗中，NLCs 和 QDNLCs 值都在 0.3 以下，表示使用高速剪切法和超音波震盪法是一 種理想的製程。表面電位 (zeta potential, ZP) 對於奈米劑型的儲存安定性極 具相關性，ZP 愈高表示奈米劑型的狀態愈穩定，越不容易聚集。只有 NLCs 劑型時，ZP 值為 -24.33 mV，當加入親油性 L-QDs 時，ZP 從 -24 變為 -18 (p < 0.05)，而摻入以兩種親水性 QDs 則和原本 NLCs 劑型無顯著差異 (p > 0.05)。界面張力 (surface tension) 則介於 33~35 mN/m 之間。
表三、NLCs 和各 QDNLCs 物化性質比較
Formulations Size (nm)
Polydisersity index (PDI)
Zeta potential (mV)
Surface tension (mN/m) NLCs 221.40±1.65 0.19±0.02 -24.33±1.00 34.20±0.01 L-QDNLCs 245.00±3.40 0.28±0.02 -18.30±0.36 35.50±0.04 C-QDNLCs 245.73±4.21 0.20±0.01 -23.86±0.35 34.12±0.21 P-QDNLCs 245.30±3.83 0.16±0.02 -22.33±0.64 33.60±0.01
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3、利用 TEM 觀察 QDNLCs 之外觀型態
將製備好的劑型稀釋 10 倍後，利用 1％ phosphotungstic acid 做負染 色 ， 藉 由 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 觀 察 NLCs 、 L-QDNLCs 、 C-QDNLCs 和 P-QDNLCs，如 (圖十七) 所示，結果粒徑大小與 Malvern 所測得的約相同，
外觀是呈現接近圓球或橢圓形。但 C-QDNLCs 的表面是較為粗糙狀，有可 能是親水性 QDs 嵌入劑型表層，比較明顯的是在 C-QDNLCs 表面中，可 以觀察到 NLCs 外層中具有許多小點的分佈。另外 L-QDNLCs 光滑的表 面，推測是 L-QDs 被包埋於奈米劑型的內核中。
(A) NLCs (B) L-QDNLCs
(C) C-QDNLC (D) P-QDNLCs
圖十七、NLCs 和各 QDNLCs 奈米劑型穿透式電子顯微鏡 (200000 X)
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550 600 650 700 nm
P-QDNLCs(EM), NLCs(EM), L-QDNLCs(EM), C-QDNLCs(EM)
0 100 200 300 400 500 600
4、QDNLCs 之疏水性試驗
Nile red 為一種紅色螢光染料可作為標記物，本身性質為親脂性，只溶 於低極性的 acetone 有機溶劑中。當 nile red 包埋入奈米劑型後，螢光性 質亦會隨著環境的極性而改變，如果螢光強度越強，則疏水性越高。Nile red 的發散波長範圍在 550~700 nm 處檢測，結果如 (圖十八) 所示，螢光吸收 強弱依序為 NLCs ＞ L-QDNLCs ＞ C-QDNLCs ＞ P-QDNLCs。證明當 加入不同 QDs 後，皆會使其 NLCs 性質有所改變，而以加入親水性的 P-QDs 疏水性最低。
圖十八、以 nile red 螢光強度判斷 NLCs、L-QDNLC、C-QDNLCs 和 P-QDNLCs 之疏水性差異
－NLCs
－L-QDNLCs
－C-QDNLCs
－P-QDNLCs
Wavelength (nm)
In ten si ty (A. U .)
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5、以 1H-NMR 觀察 QDNLCs 內固態脂質之流動性
利用 1H-NMR 的半高寬為訊號峰高度一半時的訊號寬度 (單位 Hz)，
可做為固態脂質在 NLCs 內流動性的指標。當半高寬越大則顯示固態脂質 在奈米劑型中流動性越佳。(表四) 中單純成分固態脂質 cetyl palmitate 的 半高寬為最小，當作成 NLCs 劑型後，流動性有所提升，而再加入 QDs 後，
半高寬又增大，表示加入 QDs 是會影響 NLCs 內固態脂質流動性。但加 入不同的 QDs 互相做比較，則沒有明顯的差異。
表四、各處方中 1H-NMR 的半高寬
成分 半高寬
Cetyl palmitate 5.16
NLCs 12.8
L-QDNLCs 14.93
C-QDNLCs 14.53
P-QDNLCs 14.66
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6、以示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC) 觀察 QDNLCs 內固態脂質的結晶程度
本實驗目的是探討純的固態脂質 cetyl palmitate 做成奈米劑型時，因物 理方法混合是否會使得劑型中其他成分對其原本純的 cetyl palmitate 相變 化熔點產生影響，進而使熔點波峰有改變的趨勢。並且比較不同的 QDs 加 入，探討 NLCs 劑型的結構型態是否會受到影響。從 (圖十九) 中可發現，
當我們可以做成奈米劑型後卻有兩個波峰，主要是因為 PF-68 和 cetyl palimate 的熔點太過接近，且我們設計的劑型 PF-68 和 cetyl palimate 比 例差不多所致。因此，我們只能進一步實驗，從 (圖二十) 去推斷約 44 0C 附 近是 cetyl palmitate 的波峰，而 49 0C 附近則是 PF-68 的波峰。故可知 cetyl palmitate 熔點波峰由原本 53.94 移動至 44.36 0C，且波峰形狀已大幅 縮小，顯示 cetyl palmitate 結晶程度有所降低，主要是受到加入液態油脂 的影響。另外，比較不同的 QDs 對於 NLCs 熔點的影響則沒有顯著的差 異。
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圖十九、Cetyl palmitate、PF-68、NLCs 和各 QDNLCs 之 DSC 熱焓量圖
表五、Cetyl palmitate、PF-68、NLCs 和各 QDNLCs 之熔點 熔點 (0C) PF-68 Cetyl palimate
PF-68 54.58 –
Cetyl palimate – 53.94
NLCs 49 44.36
L-QDNLCs 49.4 43.94
C-QDNLCs 49.16 44.28
P-QDNLCs 49.27 44.08
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圖二十、NLCs 作成劑型後 cetyl palmitate 和 PF-68 之 DSC 圖
表六、NLCs 作成劑型後 cetyl palmitate 和 PF-68 之熔點 熔點 (0C) PF-68 Cetyl palimate NLCs 無 PF-68 – 44.21 NLCs 無 cetyl palimate 49.57 –
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7、QDNLCs 藥物之包埋率
作為藥物輸傳輸系統一個很關鍵的重點在於載體對於藥物的包埋率。
從 (表七) 中可看出 NLCs 包覆 camptothecin 極高，推測 camptothecin 本 為親脂性藥物，且 NLCs 劑型主要就是以包覆親脂性藥物為主，故包埋率
> 99 ％ ， 此 外 加 入 不 同 QDs 並 不 會 影 響 包 埋 效 果 。 而 另 一 藥 物 為 camptothecin 經修飾後的 irinotecan，水溶性增加，故 NLCs 包埋效果不理 想。比較特別的是，不論親水和親油性的 QDs 包覆率都很高。推測水溶性 的 QDs 有可能是以附著於 NLCs 表面的方式，可從 NLCs 包埋 C-QDs 的 TEM 圖證實。
表七、QDNLCs 之藥物包埋率
Camptothecin Irinotecan QDs Formulation Encapsulation efficiency (%)
NLCs 99.72±0.01 3.59±1.76 — L-QDNLCs 99.73±0.01 2.06±1.06 99.96±0.02 C-QDNLCs 99.56±0.03 4.03±3.07 99.97±0.01 P-QDNLCs 99.64±0.01 4.11±2.24 99.95±0.01
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8、QDNLCs 包覆藥物之體外釋放實驗
NLCs 包覆 camptothecin 之體外釋放試驗，主要是希望藉由藥物載體 的幫助達到控制藥物釋放的效果，增加藥物在生物體內的生物可用率。如 (圖二十一 A) 所示控制組 camptothecin 完全溶解在 DMSO，在一開始藥 物釋放速度很快，接著在 12 小時後逐漸平穩。當 camptothecin 包埋入 NLCs 和 QDNLCs 後釋放程度顯著降低 (p < 0.05)，表示在初始階段並沒 有突然釋放，而是進行持續緩慢性的釋放。而 NLCs 和各 QDNLCs 之間 釋放率並沒有顯著性差異 (p > 0.05)。故經由 NLCs 和 QDNLCs 修飾的處 方皆有良好的藥物緩釋效果，可以延長藥物釋放的時間。而在 (二十一 B) 中可看出另一藥物 irinotecan，經 NLCs 和各 QDNLCs 處方包埋後的釋放 結 果 和 控 制 組 並 沒 有 明 顯 的 差 異 (p > 0.05) ， 據 之 前 實 驗 結 果 顯 示 irinotecan 包埋率是非常低，推測藥物應該沒有被包埋至劑型中，使得釋放 結果和控制組相差不大。
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(A) camptothecin
(B) irinotecan
圖二十一、(A) camptothecin，(B) irinotecan 之體外藥物累積釋放圖 (n=4) (*, p < 0.05, compare to control)
Time (h)
0 5 10 15 20 25 30
Released amount (nmol/cm2 )
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Free control L-QDNLCs C-QDNLCs P-QDNLCs NLCs
*
*
* *
Time (h)
0 5 10 15 20 25 30
Released amount (nmol/cm2 )
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Free control L-QDNLCs C-QDNLCs P-QDNLCs NLCs
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9、以非侵入性活體影像系統 (non-invasive in vivo imaging system, IVIS) 全 波長掃描 QDNLCs 之螢光圖
將製備完成的各劑型冷卻至室溫後，以 IVIS 全波長掃描，觀察其奈米 劑型之螢光性。激發波長 (Excitation, Ex) 從 430 nm 以 35 nm 為間隔掃描 掃至 710 nm。而發散波長 (Emission, Em) 範圍則為 430 nm 以 20 nm 為 區隔至 840 nm。以控制組 (未包埋 QDs 的 NLCs) 和 NLCs 包埋不同種 類的 QDs 做為比較。從 (圖二十二~三十三) 中，可明顯發現控制組是完 全沒有螢光存在的，證實經奈米劑型 QDs 包埋後仍具有螢光性。但此實驗 受限於儀器的關係，因為 IVIS 只能從 430 nm 開始掃描，但其實 QDs 最 合適的激發波長是在 405 nm，故無法去比較奈米劑型包埋 QDs 後是否有 螢光位移現象發生，不過從 (圖二十二~三十三) 可以確定的是發散波長皆 在 800~820 nm 之間的螢光程度為最大，可證實其螢光發光的範圍是位於 紅外光。
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圖二十二、L-QDNLCs-1 (左圖) 和 NLCs 對照組-1 (右圖) 之螢光掃描圖 表八、L-QDNLCs-1 和 NLCs 對照組-1 圖的激發波長及發散波長 Ex:430 nm
Em:500 nm
Ex:430 nm Em:520 nm
Ex:430 nm Em:540 nm
Ex:430 nm Em:560 nm
Ex:430 nm Em:580 nm Ex:430 nm
Em:600 nm
Ex:430 nm Em:620 nm
Ex:430 nm Em:640 nm
Ex:430 nm Em:660 nm
Ex:430 nm Em:680 nm Ex:430 nm
Em:700 nm
Ex:430 nm Em:720 nm
Ex:430 nm Em:740 nm
Ex:430 nm Em:760 nm
Ex:430 nm Em:780 nm Ex:430 nm
Em:800 nm
Ex:430 nm Em:820 nm
Ex:430 nm Em:840 nm
Ex:465 nm Em:520 nm
Ex:465 nm Em:540 nm Ex:465 nm
Em:560 nm
Ex:465 nm Em:580 nm
Ex:465 nm Em:600 nm
Ex:465 nm Em:620 nm
Ex:465 nm Em:640 nm
圖二十三、L-QDNLCs-2 (左圖) 和 NLCs 對照組-2 (右圖) 之螢光掃描圖
