第二章、 材料與方法
第一部 分 NLCs 包埋不同性質 QDs 作一系列之研究
NLCs 的處方主要可分為油相、水相。油相為固態脂質 cetyl palmitate (2
％)、液態脂質 coconut oil (6％)、親油性乳化劑 Myvreol® (0.3％)，水相為 親水性乳化劑 PF-68 (2.5％)、ddH2O (89. 2％)。QDNLCs 則是再加入 QDs (20 μl) 亦用同樣的方式，若選擇親水性的 C-QDs 和 P-QDs 則加入水相，
而選擇 L-QDs 為親油性則加至油相。另外加入藥物的處方亦是相同的處理，
camptothecin (8 mg) 為親脂性，則加 入油相中。而若是 包埋另一藥物 irinotecan (14.3 mg) 因 irinotecan 經 camptothecin 修飾後為親水性，則加 入水相中。接著將油相及水相分別置於 85 0C 水浴鍋中加熱 15 分鐘，主 要是使油相中固態油脂能與液態油脂互溶。完成後再將水相加入油相中，
之後用均質機以 12000 rpm 轉速均質 10 分鐘。最後再用超音波震盪機在 35 watts 的條件，分別做 3 次各處理 10 分鐘，冷卻至室溫即可得到劑型。
2、顆粒粒徑測定
將製備好的劑型放置室溫冷卻，並以 ddH2O 稀釋 100 倍後，取約 1.5 ml 的量注入四面拋光的 cuvette 中，用動態光散射粒徑介面電位測定儀 (Malvern ZS90®，UK) 選擇 size 做分析，重複 3 次取其平均值。動態光
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散射粒徑介面電位測定儀原理主要是以 90 度角可偵測到粒子的散射，並 在波長 636 nm 之氦氖雷射進行掃描，且經電腦內的軟體 Dispersion Technology Software 5.0 (DTS) 計算，掃瞄範圍為 3~3000 nm。
3、表面電位 (zeta potential) 測定
將製備好的劑型取 1.5 ml 於注射針筒注入 zeta 電位樣品室，以動態光 散射粒徑電位測定儀選擇 zeta potential 進行測定，重複三次取其平均值。
在電場中，主要會被兩力影響，分別為帶電粒子會往帶有相反電荷的電極 移動造成分散溶液的移動力，而另一力則為黏滯力，阻止帶電粒子移動，
當兩者達成平衡時，帶電粒子會以一固定之速度移動。
4、界面張力 (surface tension) 測定
將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 5 ml 置於培養皿中，以劑型液面 覆蓋整個培養皿底部，利用界面測定儀 (Kyowa CBVP-A3, Japan) 測定，並 讀取 20 秒內之數值予以記錄。原理是使用白金片連結交流信號調節放大 器，利用 Wilhelmy plate 方法測定培養皿中樣品。
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5、穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscope, TEM) 觀察 QDNLCs 型態
將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 10 μl 滴於 3 mm 200 mesh 鍍碳 銅網上，30 秒後以濾紙吸乾多餘的水分，接著在 10 分鐘後取 10 μl 的 1
﹪ phosphotungstic acid 當作負染色，滴於鍍碳網上，30 秒後再吸乾多餘 的水分，接著置於乾燥箱放置一天乾燥，完成後利用穿透式電子顯微鏡 (Joel JEM-1230 TEM) 觀察脂質奈米微粒的型態。
6、QDNLCs 之疏水性試驗
將 2.5 mg nile red (NR) 用 acetone 定量至 100 ml，取 1 ml 空樣品瓶 中，將著以真空乾燥機將 acetone 去除後，將此含 NR 之樣品瓶製備總重 量 10 g 之 QDNLCs 劑型，NR 最後濃度為 2.5 μg/ml。將劑備後的劑型取 約 1 ml 置入四面拋光的石英 cuvette 中，再以螢光光譜掃描，螢光條件為 激發波長是 546 nm，發散波長範圍是 550 至 700 nm，藉以判斷劑型的疏 水性。
7、以 1H-NMR 觀察 QDNLCs 內固態脂質的流動性
NMR 的半高寬為訊號峰高度一半時的訊號寬度 (單位 Hz)，可做為奈 米劑型內固態脂質的流動性指標。將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 0.2
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ml 再加入 0.4 ml 的 D2O 稀釋 3 倍，將配好的溶液置入 NMR tube 中，
以 1H-NMR (Bruker AVANCE-400, Germany) 分析，紀錄固態脂質的半高 寬。
8、示差熱掃描分析儀 (differential scanning calorimetry, DSC)
取約 3 mg 經凍晶乾燥後去除水分的劑型，置於空的鋁製小碟盤，並經 加壓密封後，當做樣品組。而空白組則為空的鋁製小碟盤，做為標準品。
並分別置於示差熱掃描分析儀 (Thermal analyers DSC Q2000, USA) 內測量 熱量變化，條件設定為由 30 0C 開始升溫，以每分鐘 10 0C 為升溫速率，
加熱至 80 0C。
9、QDNLCs 之藥物包埋率測定
將製備完成的劑型冷卻至室溫後，取 0.8 ml 置於離心管中，以超高速 離心機 (Beckman Coulter® Allegra® 21R) 在 48000 rpm、4 0C 條件下離心 30 分鐘。離心完後吸取下層澄清水溶液，並將水溶液以 PVDF filter 0.45 μm 過濾後，以 ddH2O 稀釋 100 倍後，藥物藉由 HPLC 進行分析，QDs 則 由原子吸收光譜分析。
包埋率公式：Encapsulation efficiency (％) = (Wa-Wb)/Wa×100％
Wa：原始藥物量
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Wb：以 HPLC 分析下層澄清液未包埋於劑型的游離藥物量 藥物之 HPLC 分析條件
層析管柱：Merck LiChrospher® RP-18e in column LiChroCART250-4 偵測器：Hitachi L-7485
自動注射器：Hitachi L-7200 幫浦：Hitachi L-7110
波長：Camptothecin 激發波長為 360 nm 發散波長為 440 nm Irinotecan 激發波長為 360 nm 發散波長為 440 nm 注射體積：20 μl
移動相流速：1 ml/min
移動項比例：Camptothecin (pH=2:acetonitrile=65:35) Irinotecan (pH=2:acetonitrile=60:40)
10、QDNLCs 包覆藥物之體外釋放實驗
本實驗採用 (圖十三) Franz 直立式擴散式裝置，是上下分離式的擴散 裝置。上端是施藥端 (donor site) 的中空玻璃管，為放置 0.5 ml 不同處方 的樣品，以 Parafilm® 封口。下端為受藥端 (receptor site) 是一圓柱雙層玻 璃槽，內部填充 5.5 ml 的 30％ ethanol pH = 7.4 磷酸鹽緩衝溶液，底部放 入磁石攪拌時並置於多磁點攪拌器上以 600 rpm 速度攪拌。上下容器兩端
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接觸面積截面積為 0.785 cm2，中間以人工膜 (M.W. cutoff = 6000~8000) 當 作穿透障壁，再以金屬固定夾固定之，而在受藥端之內外玻璃夾層間填充 37±1 0C 循環水浴，利用不同的時間點 2、4、6、8、10、12、24、30 小時 抽取藥液 0.3 ml，且在受藥端注入 0.3 ml 磷酸鹽緩衝溶液，以維持裝置容 器內溶液的固定量，最後以 HPLC 分析受藥端藥品釋放累積量。
圖十六、Franz 直立式擴散式裝置
11、以非侵入性活體影像系統 (non-invasive in vivo imaging system, IVIS) 全 波長掃描 QDNLCs 內之螢光圖
將製備完成的 QDNLCs 劑型冷卻至室溫後，以 IVIS 全波長掃描，觀 察其劑型之螢光性。激發波長從 430 nm 以 35 nm 為間隔掃描掃至 710 nm，而發散波長範圍則為 430 nm 以 20 nm 為間隔描掃至 840 nm。
12、以螢光顯微鏡觀察黑色素癌細胞 (melanoma cell) 攝入 QDNLCs 將 2 x 105 的黑色素癌細胞加入 6-well plate 中，待隔天細胞完全貼
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上後，吸走培養液之後，加入 1 ml 新的 median 和 100 μl 的 NLCs 包埋 QDs 劑型，做 4 小時觀察黑色素癌細胞攝入 QDNLCs。染細胞核則是使 用 DAPI (100 ng/ml) 染 30 分鐘。
13、QDNLCs 包埋 camptothecin 之細胞毒性分析
將 1012 的黑色素癌細胞加入 6-well plate 中，待隔天細胞完全貼上後，
吸走培養液之後，加入 1 ml 新的 median 和 10 μl 的劑型，分別在 12 和 24 小時之後，吸走 median 並加入 5 mg/ml MTT，2 小時後將混和溶液移 除，加入 200 μl DMSO，以 ELISA 在 550 nm 下測吸光值。
14、QDNLCs 抑制細胞遷徙實驗
本實驗是評估藥物抑制黑色素瘤細胞轉移能力的效果。將 2 x 105 的黑 色素癌細胞加入 6-well plate 中，待細胞形成完整的單層後，利用 pipette tip 尖端在細胞層上畫出固定傷口，細胞碎片則用 PBS 洗滌。接著細胞加入稀 釋 100 倍後的 DMSO 溶 camptothecin 和各處方含藥並觀察 0、24、36 小 時黑色素瘤細胞轉移的情形。
15、利用近紅外螢光活體影像系統 (Pearl® Impulse Image) 觀察不同時間點 之 QDNLCs 螢光變化
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將 106 個皮膚黑色素癌細胞利用胰島素空針以皮下注射方式注射 50 μl 至 8 週大的裸鼠，帶腫瘤長出再進行實驗。使用 27 G 的胰島素空針，
取 50 μl 的劑型注於裸鼠背部的腫瘤中。並以近紅外螢光活體影像系統 (Pearl® Impulse Image) 觀察老鼠在不同時間 0 分鐘、1 分鐘、1 小時、2 小時、4 小時、6 小時、12 小時、24 小時，QDNLCs 在腫瘤身上之螢光 變化。
16、QDNLCs 經腫瘤內注射之藥物含量
使用 27 G 的胰島素空針，取 50 ul 的劑型注於裸鼠背部的腫瘤中。經 過 24 小時後，將動物以過量的乙醚麻醉致死後，用解剖工具取下生於老 鼠背後的腫瘤組織，秤重在倒入磨皮器中，加入 1 ml methanol，以組織研 磨器研磨 5 分鐘，溶液成乳靡狀即表示研磨完全。接著置於高速離心器中 條件為 12000 rpm，離心 10 分鐘，抽取上清液用 0.45 μm PVDF 膜過濾 以 HPLC 分析腫瘤內注射藥物含量。
17、統計方法
統計方法的分法採用 Student’s t-test，透過 WINKS 計算以 p 值 0.05 來分別兩種不同的條件之間有沒有統計上的意義。
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第二部分 不同處方之微脂粒包埋 QDs 做一系列之研究