第三章 實驗結果與討論
III. 分餾策略之互補性(complementarity)
為了比較二維分餾策略對分離複雜胜肽樣品的能力，本篇實驗以相同的 進樣量(200 µg)且第一維分析皆收集 24 管，第二維則都搭配相同的
RP-LC-MS/MS 分析系統以及相同搜尋條件，來和資料庫中蛋白質胜肽碎 片離子理論值比對。本篇研究使用 Mascot 以及 ProeinPilotTM軟體進行蛋 白質身分鑑定，其中 Mascot 蛋白質鑑定的篩選條件為每個被鑑定到的蛋
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相似(表 6)。最後，由於實驗做了三次重複，結合二種二維分餾策略數據 經 Mascot 以及 ProeinPilotTM軟體鑑定結果顯示如表(表 7)。
緊接著比較此二種二維分餾策略之互補性，把 Mascot 鑑定結果轉 成.dat 檔案，再用 Scaffold 軟體繪製 Venn diagram (圖 28)。以第二次實 驗為例，一共鑑定到 305 個蛋白質，且 sIEF 比 SCX 可鑑定到較多蛋白質； 論是在 in- solution 或 in-gel digestion 皆展現良好的活性，其切點在精氨 酸(arginine, R)以及賴氨酸(lysine, K)，在蛋白質裡這些胺基酸出現的頻率 適中，所以可使蛋白質被 trypsin 切割成為一群獨特的、大小不同且質量不 一的胺基酸片段，此外這些片段易為鹼性，因此容易帶正電荷，故利於質 譜分析。綜合以上所述，樣品送入質譜分析後，先進行 survey scan 做全 圖譜掃描且設定掃描範圍為 400 m/z~1,200 m/z 內的所有胜肽離子，在資 料依靠收集模式(information dependent acquisition, IDA)中，挑選三根訊
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號強度最強的訊號做 CID 撞碎，將胜肽離子碎裂進行 MS/MS 分析且其掃 描範圍在 75 m/z ~1,500 m/z。將所產生之 b-、y-離子碎片與資料庫中蛋 白質胜肽碎片離子理論值做比對，即可得知圖譜所對應的胜肽片段進而判 斷源於何種蛋白質，完成蛋白質身分鑑定；而 iTRAQ 試劑經 CID 撞碎時，
其平衡基團(balance group)因不帶電荷會中性丟失(neutral loss)，使 isobaric tags 產生裂解，藉此可依據譜峰面積對不同標記樣品的相同蛋白 質做相對定量。因此，以 iTRAQ 標定方法搭配串聯質譜分析可使每張 MS/MS 圖譜同時具有胜肽之定性和定量之資訊，實際鑑定例子如圖所示 (圖 29、圖 30)。圖 29 及圖 30 分別為 serglycin、tenascin 其中一段胜肽 片段之 MS/MS 圖譜，內含 b-、y-離子碎片的資訊及 MS/MS 圖譜放大分 子量，即 114~117 區段的相對強度之資訊，利用此資訊可以使用
ProteinPilotTM軟體對其譜峰面積做相對定量。
換句話說，由 Mascot 或 ProteinPilotTM軟體分析後所得資訊主要包括：
(1)鑑定到的蛋白質總數目；(2)扣除樣品間 iTRAQ 標記胜肽數目之重複鑑 定結果(unique peptide)；(3)經 trypsin 水解胜肽之胺基酸序列以及胜肽上 各種修飾；(4)鑑定到的胜肽片段其胺基酸序列佔蛋白質全部胺基酸之百分 比(sequence coverage)；(5)MS/MS 圖譜總數(spectrum)，其中又可區分 為有鑑定到胜肽之圖譜數(ID spectrum)，以及有做定量的圖譜數目
(quantitative spectrum)；(6)樣品經 iTRAQ 標記之相對比例、圖譜數目及 p Value。由以上這些資訊可幫助比較實驗經不同分餾策略樣品間的分離效 率。
四、蛋白質定量
由於 ProteinPilotTM是以 iTRAQ 之報導基團(reporter group)的譜峰面 積對標記胜肽做相對定量，比利用 Mascot 以譜峰強度的方式會更為準確，
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所以本篇實驗會以 ProteinPilotTM的定量結果來探討。以第二次重複實驗 結果為例，共鑑定出 654 個蛋白質，並利用 STRAP (Software Tool for Researching Annotations of Proteins) 76對這些蛋白質進行分類，發現其 中絕大多數和細胞過程以及調控相關(圖 31)。接著在 p Value 小於 0.05 的
五、細胞因子微陣列(cytokine microarray)
利用細胞因子微陣列來針對細胞因子的表達差異來驗證質譜鑑定結果 經細胞因子微陣列所偵測到的蛋白質，如 G-CSF, IL-1ra, CCL2 及 TIMP-1 等蛋白質在質譜方面也有鑑定到，且其定量上也幾乎都有一致性結果；而 取小鼠血清的體內實驗最接近實際生理情況，所以可測到蛋白質含量的數 據比起體內實驗鑑定的數量還要多，如 CXCL13, CCL1, IFN-γ, CCL5 等 蛋白質，而和質譜鑑定結果如 G-CSF,sICAM-1, IL-1ra, CCL2 及 TIMP-1
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等蛋白質也幾乎有一致性。（Data 由 ITRI 提供）
六、Wetern blot 鑑定結果