本篇結合化學標定以及質譜技術分析小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)經脂 多醣(LPS)、牛樟脂多醣體(ACPS)以及黑豆多醣體(BB-G2)刺激後所表現 的分泌蛋白質體。根據蛋白質鑑定以及定量結果，使用 OFFGEL 等電聚 焦 分 析 儀 (solution IEF, sIEF) 或 強 陽 離 子 交 換 層 析 法 (SCX) 搭 配 RP-LC-MS/MS 二種二維分餾策略分析 iTRAQ 標定胜肽，sIEF 有較佳的 分離效能。儘管如此，使用 SCX 在鑑定蛋白質方面仍然提供了良好的互 補性。本實驗總共鑑定以及定量 654 個蛋白質，並使用細胞因子微陣列針 對細胞因子的表現差異來確認質譜鑑定結果有一致性。接著從 654 個蛋白 質中篩選出 52 個經過 LPS 刺激後，其含量和控制組相比具有顯著差異的 蛋白質，再篩選出含量經 LPS 刺激後具有顯著上升的蛋白質 serglycin，
以西方墨點法(Western blot)進行確認。Serglycin 和調控腫瘤壞死因子-α 的分泌相關。從結果上得知不論 RAW 264.7 或 mice serum 經過 LPS 刺 激後，serglycin 含量皆有上升之趨勢；而細胞內部不論有無經過 LPS 刺 激，serglycin 含量皆無顯著變化。因此，鑑定到的這些具顯著性差異的蛋 白質對於了解 LPS 刺激後產生發炎反應的機制具有很大的幫助。
最後，根據此實驗結果，未來探討三部分：經 LPS 刺激後含量顯著上 升的 tenascin 會使用 Western blot 做進一步確認；其次，利用生物資訊分 析對鑑定到的蛋白質進行細部功能分類；最後，比較小鼠不同器官經 LPS 刺激後，serglycin 含量的多寡。
49
附圖
圖 1、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)結構
包含 O-antigenic polysaccharide、core oligosaccharide 及 lipid A 三部分。
50
圖 2、Intracellular signalling by toll-like receptors (TLRs)
Reference:
Dobrovolskaia, M. A.; Vogel, S. N.: Toll receptors, CD14, and
macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and infection / Institut Pasteur 2002, 4, 903-14.
51
圖 3、同位素親和標定(isotope-coded affinity tags, ICAT)試劑結構 此試劑分成三部分，包含可與硫醇基團結合的反應基團(reactive group)，
含有不同同位素1H、2D 標定的連接區域(linker)以及含有生物素(biotin)的 親和基團(affinity grup)。
52
圖 4、同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)試劑結構
A. 此試劑分成三部分，包含含有不同同位素導致質量不同的報導基團 (reporter group)，分子量為 114~117，以及使標記總質量維持相同的平衡 基團(balance group)，分子量為 28~31，最後為可和胜肽上的自由胺基產 生鍵結的 NHS-反應基團。
B. 試劑上標定不同同位素導致分子量的差異。
A. B.
53
圖 5、同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)流程圖
54
圖 6、串聯質譜標記(tandem mass tag, TMT)試劑結構
此試劑分成四個部分，包含含有不同同位素導致質量不同的 mass reporter region，分子量為 126~131，以及依據 MS/MS 設定條件得出合適的斷裂 鍵結區域(cleavable linker region)來幫助釋放 reporter group，接著是使標 記總質量維持相同的 mass normalization region，最後則是與胜肽鍵結的 protein reactive group (NHS)。
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圖 7、雙甲基之穩定同位素標定法(stable isotope dimethyl labeling) 為還原胺化反應(reductive amination)。首先，胜肽 N-terminus 和賴氨酸 殘基(lysine residues)會先和甲醛反應，形成 Schiff base，再藉由還原劑 NaBH3CN 形成二級胺。當蛋白質樣品經水解後，雙甲基會標定在胜肽 N-terminus 以及賴氨酸殘基(lysine residues)上，使其轉換成雙甲基胺 (dimethylamines)。接著將衍生後具不同雙甲基同位素標記樣品混合，以 質譜進行分析，由分子量上的差異來判斷胜肽之訊號。
56
圖 8、OFFGEL 等電聚焦流程圖
(A) IPG 膠條添加 rehydration solution 並與樣品槽扣緊。
(B) 吸取樣品均勻加入樣品槽後，扣上密封條避免樣品揮發。
(C) 施加高電壓使樣品在膠條間漂移，直到漂移至各自等電點位置上。
(D) 分離後的樣品存在於緩衝液中，方便取出做後續實驗。
.
57
圖 9、電噴灑游離法(electrospray ionization, ESI)機制圖
58
A. 毛細管分流進樣系統 (load mode)
質譜上的六向閥為打開的位置，由於 RP-µLC column 擁有較高的背壓，
所以分析樣品及溶劑均會通過 pre-column 直接導入廢液桶。
B. 毛細管分流進樣系統 (inject mode)
質譜上的六向閥為關閉的位置且同時打開分流通往廢液桶的管路，所以溶 劑會被迫通過 RP-µLC column。
圖 10、連結質譜之液相層析分流進樣裝置
59
圖 11、Q-TOF 串聯式質譜儀裝置圖
60
圖 12、質譜中常見胜肽離子碎片形式
圖中 a、b、c 為不同位置 N-terminus 之碎片，而 x、y、z 為不同位置 C-terminus 之碎片，數字則代表胺基酸的順序，通常在 CID 碰撞模式下易 產生 b、y 形式之碎片離子。
61
圖 13、細胞因子微陣列(cytokine array)反應示意圖
62
圖 14、Western blot 反應示意圖
將樣品內蛋白質轉印至 PVDF 膜上後，加入與目標抗原專一性的一級抗體 以及對一級抗體有專一性之二級抗體，利用二級抗體上標定的 enzyme 會 與受質(substrates)形成一複合物，藉由偵測冷光或染色得知目標蛋白質位 置以及定量。
63
圖 15、Western blot 轉漬裝置示意圖
64
圖 16、RAW 264.7 實驗總流程圖
65
圖 17、RAW 264.7 細胞株之分泌蛋白質體樣品培養流程圖 註：此圖由 ITRI 提供
66
圖 18、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配製 BSA 標準液，濃度分別為 80 µg/mL、60 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、
15 µg/mL、10 µg/mL 及 0 µg/mL，使用可見光譜盤式分析儀偵測其 O.D.
595 nm 吸收值，再將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪出吸收值對濃度 之校正曲線。
y = 0.0052x + 0.1918 R² = 0.9958
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
O.D. 595 nm
BSA（µg/mL）
67
圖 19、強陽離子交換層析圖(SCX)
樣品進樣量約為 200 µg，圖縱軸為波長在 214 nm 下 UV 的吸收，橫軸為層析滯留時間(min)。設定分液收集器每一分鐘收 集一管，共收 80 管，接著依據時間以及譜峰面積依序匯集成一管，共匯集 24 管。
68
圖 20、強陽離子交換層析圖分管圖(圖譜放大)
匯集分布如下：1~22 每十一分鐘收一管，23~28 每二分鐘收一管，29~37 每一分鐘收一管，38~49 每三分鐘收一管，50~51 分鐘收一管，52~57 分鐘收一管，58 分鐘收一管，59~64 分鐘收一管，65~80 每八分鐘收一管共收集 24 管。
Fraction No.
1~2 3~5 6~14 15~18 19 20 21 22 23~24
69
圖 21、等電聚焦分級分離儀運作參數變動情形
樣品分離量約 200 µg，圖中顯示 OFFGEL 在運作時其參數變動情形。當 kVHours 達到 50 時，樣品分離結束，約 34 小時。
參數如下：
Voltage: 4500 V; power: 200 mW; current: 50 µA; kVHours: 50 kVh
70
圖 22、SCX-RP 蛋白質每管鑑定分布情形
橫軸為第一維 SCX 分離收集之 24 管管數，縱軸為第二維 LC-MS/MS 鑑 定到的未重複蛋白質數目。
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Sequentially fraction no.
# of proteins
71
圖 23、SCX-RP 各管分餾樣品鑑定之 unique peptides 其管數分布情形 橫軸為 SCX 鑑定到的蛋白質其未重複胜肽分別來自於各管分餾樣品的管 數分布情形，縱軸為未重複胜肽之數目。即未重複胜肽落在同一個管數以 及落在二個管數，以此類推的分布情形。
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10~24
Fraction no.
# of unique peptides
72
圖 24、sIEF-RP 蛋白質每管鑑定分布情形
橫軸為第一維 sIEF 分離收集之 24 管管數，縱軸為第二維 LC-MS/MS 鑑 定到的未重複蛋白質數目。
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Sequentially fraction no.
# of proteins
73
圖 25、sIEF-RP 各管分餾樣品鑑定之 unique peptides 其管數分布情形 橫軸為 sIEF 鑑定到的蛋白質其未重複胜肽分別來自於各管分餾樣品的管 數分布情形，縱軸為未重複胜肽之數目。即未重複胜肽落在同一個管數以 及落在二個管數，以此類推的分布情形。
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15~24
Fraction no.
# of unique peptides
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圖 26、SCX-RP 層析正交圖
橫軸為第一維 SCX 層析收集的 24 管管數，縱軸為第二維 LC-MS/MS 之 分餾樣品鑑定到之胜肽片段的滯留在毛細管柱時間。
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圖 27、sIEF-RP 層析正交圖
橫軸為第一維 sIEF 層析收集的 24 管管數，縱軸為第二維 LC-MS/MS 之 分餾樣品鑑定到之胜肽片段的滯留在毛細管柱時間。
76
圖 28、各分餾策略鑑定蛋白質以及胜肽之 Venn diagram
將 SCX-RP-LC-MS/MS 和 sIEF-RP-LC-MS/MS 二種二維分餾策略經過 Mascot 資料庫鑑定之結果轉成.dat 檔案，再利用 Scaffold 軟體繪製 Venn diagram 比較各分餾策略之互補性。
Proteins Unique peptides
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圖 29、Serglycin 胜肽片段 CKPNGFFANCIEEK 之 MS/MS 圖譜
CKPNGFFANCIEEK
78
圖 30、Tenascin 胜肽片段 YAPISGGDHAEIDVPK 之 MS/MS 圖譜
YAPISGGDHAEIDVPK
79
圖 31、蛋白質分類圓餅圖
80
圖 32、蛋白質比率分布圖
在 log2 (LPS-stimulation/control) 為 0 時，即 LPS-stimulation/Control 比 率為 1 時，蛋白質的數目最多，顯示大部分蛋白質經 LPS 刺激並沒有顯 著性變化；若 log2 (LPS-stimulation/control) 為 1 以上或-1 以下時，即 LPS-stimulation/control 比率為 2 以上或 0.5 以下時，具有顯著差異性的 蛋白質數目，約佔全部鑑定之 654 個蛋白質的 10%。
0 5 10 15 20 25
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
N um ber of prot eins
log
2(LPS-stimulated/Control)
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圖 33、細胞因子微陣列(cytokine array)體外實驗測試結果 註：此圖由 ITRI 提供
82
圖 34、細胞因子微陣列(cytokine array)體內實驗測試結果 註：此圖由 ITRI 提供
83
圖 35、細胞因子微陣列(cytokine array)體內實驗測試結果 將圖 33 以長條圖方式呈現。註：此圖由 ITRI 提供
84
圖 36、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配製 BSA 標準液，濃度分別為 80 µg/mL、60 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、
15 µg/mL、10 µg/mL 及 0 µg/mL，使用可見光譜盤式分析儀偵測其 O.D.
595 nm 吸收值，再將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪出吸收值對濃度 之校正曲線。
y = 0.0055x + 0.1578 R² = 0.9945 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
O.D. 595nm
BSA (µg/mL)
85
圖 37、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配製 BSA 標準液，濃度分別為 60 µg/mL、30 µg/mL、20 µg/mL、15 µg/mL 及 0 µg/mL，使用可見光譜盤式分析儀偵測其 O.D. 595 nm 吸收值，再將 所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪出吸收值對濃度之校正曲線。
y = 0.0061x + 0.213 R² = 0.997
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 10 20 30 40 50 60 70
O.D. 595 nm
BSA (µg/mL)
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圖 38、Western blot result for serglycin (RAW 264.7) Secreted Secreted Cell Cell
Control LPS Control LPS
Serglycin, 24 kDa
Tubulin, 55 kDa GAPDH, 37 kDa
87
A.
圖 39、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配製 BSA 標準液，濃度分別為 80 µg/mL、60 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、
10 µg/mL 及 0 µg/mL，使用可見光譜盤式分析儀偵測其 O.D. 595 nm 吸 收值，再將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪出吸收值對濃度之校正曲 線。
88
圖 40、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖
配製 BSA 標準液，濃度分別為 60 µg/mL、50 µg/mL、40 µg/mL、30 µg/mL、
25 µg/mL、20 µg/mL、15 µg/mL 及 0 µg/mL，使用可見光譜盤式分析儀 偵測其 O.D. 595 nm 吸收值，再將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪出吸 收值對濃度之校正曲線。
y = 0.0098x + 0.1943 R² = 0.993
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
0 10 20 30 40 50 60 70
O.D. 595 nm
BSA (µg/mL)
89
圖 41、Western blot result for serglycin (mice serum) 15 隻老鼠血清樣品分別為：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Serglycin, 24 kDa Actin, 42 kDa
1. Mice #497_0 hour 2. Mice #504_0 hour 3. Mice #509_0 hour 4. Mice #498_1 hour 5. Mice #502_1 hour 6. Mice #510_1 hour 7. Mice #499_3 hour 8. Mice #504_3 hour
9. Mice #510_3 hour 10. Mice #500_6 hour 11. Mice #501_6 hour 12. Mice #506_6 hour 13. Mice #503_24 hour 14. Mice #505_24 hour 15. Mice #511_24 hour
90
圖 42、SignalP prediction result for serglycin
橫軸表示胺基酸序列裂解位置之編號，縱軸表示 C-score (raw cleavage site score)、S-score (signal peptide score)、Y-score (combined cleavage site score)及 D-score (discrimination score)之分數。
91
附表
A.
B.
表 1、樣品和牛血清蛋白(BSA)標準溶液之蛋白質吸收值與濃度表
A. 為 BSA 標準溶液之濃度與吸收值，利用此數據繪出吸收值對濃度之校 正曲線(圖 18)。
B. 為樣品之吸收值，把這些數值帶入 BSA 校正曲線回推得到預估的濃 度。
BSA (µg/mL) 0 10 15 20 40 60 80 O.D.595 nm 0.192 0.236 0.265 0.298 0.422 0.504 0.603
Sample Control LPS ACPS BB-G2 O.D. 595 nm 0.517 0.536 3.879 3.81 Protein (µg/µL) 3.752 3.972 3.879 3.81
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表 2、強陽離子交換層析梯度表
流速設定每分鐘 0.2 mL，樣品以 SCX buffer A 回溶體積為 1.9 mL，梯度 在 40 分鐘內從 2% SCX buffer B 拉至 40% SCX buffer B。
Time (min) % SCX buffer B Flow (mL/min)
1 0 2 0.2
2 5 2 0.2
3 45 40 0.2
4 50 98 0.2
5 55 98 0.2
6 60 2 0.2
7 80 2 0.2
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表 3、液相層析梯度表
樣品經自動進樣器進樣後，設定流速為 10 µL/min 推入 pre-column，使樣 品被捕捉住並且以 mobile phase A 進行去鹽，5 分鐘之後，利用分流系統 使流速經分流後每分鐘為 200 nL 使樣品推入逆相層析管柱 RP-µLC
樣品經自動進樣器進樣後，設定流速為 10 µL/min 推入 pre-column，使樣 品被捕捉住並且以 mobile phase A 進行去鹽，5 分鐘之後，利用分流系統 使流速經分流後每分鐘為 200 nL 使樣品推入逆相層析管柱 RP-µLC