化學標定(chemical labeling) (in vitro)

第一章序論

III. 化學標定(chemical labeling) (in vitro)

(1) 同位素親和標定(isotope-coded affinity tags, ICAT)

ICAT 技術首先由 Aebersold 提出，包含可與半胱胺酸(cysteine)結合的反應基(reactive group)，含有不同同位素¹H、²D 標定的連接區域(linker) 以及含有生物素(biotin)的親和基團(affinity grup) (圖 3)。首先蛋白質先經

過變性(denature)及還原(reduction)，在蛋白質 sulfhydryl 基團上分別標定含有不同同位素¹H、²D 的 ICAT 試劑。接著混合樣品以胰蛋白酶水解成較 (co-elute)出來，層析峰出現的時間不同易導致定量上的誤差；且 ICAT 試劑分子太大使標記後的胜肽不易進行碰撞誘導解離 (collision-induced dissociation, CID)，而胜肽碎裂的同時，biotin 的碎裂也會導致串聯式質譜圖譜的干擾。之後 Applied Biosystems 公司發展出 cICAT，在連接區域 (linker)由 9 個 ¹²C 或 ¹³C 組成，取代 ¹H、²D 的標定方式來降低同位素效應的情況發生；且在進行質譜分析前先將 biotin 及被標記胜肽分離，降低質譜分析時 biotin 碎裂譜峰造成的圖譜干擾。

(2) 同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)

因為 ICAT 或 cICAT 只能分析含有半胱胺酸(cysteine)的蛋白質，為了突破此限制性希望可針對所有蛋白質作定量分析，在 2004 年發展出 iTRAQ 試劑 ( 圖 4) ，包括含有不同同位素導致質量不同的報導基團 (reporter group)、使標記總質量維持相同的平衡基團(balance group)以及可以與胜肽上的自由胺基(free amine group，通常位於 N 端和離胺酸 (lysine)上)產生鍵結的胜肽反應基團(peptide reactive group) ^29-32。iTRAQ 試劑能夠應用於組織和細胞裂解(lysis)後，較能適用於生物系統作蛋白質定量分析，並不局限於細胞代謝培養。目前 iTRAQ 試劑一次能比較 4~8 個樣品，此次實驗選用四個 iTRAQ 試劑來一次比較四個樣品，因為其

reporter group 同位素的不同，質量分別為 114~117。將四個樣品以胰蛋白酶水解成較小段的胜肽後，分別和 iTRAQ 試劑 114~117 標定後再混合成一管，最後以液相層析串聯質譜進行分析。首先，標定不同試劑之胜肽總質量相同皆為 145 Da，所以在進行檢視質譜掃描(survey scan)時並不會有分子量上的差異，但在 MS/MS 時會將胜肽裂解成碎片離子並進行偵測，得到的 MS/MS 圖譜可知胜肽碎片的譜峰(fragment ion peaks)以及 reporter group 譜峰分子量 114~117 之碎片資訊。由胜肽碎片的譜峰分子量所得的資訊經過資料庫比對後可鑑定出蛋白質身分，而 reporter group 譜峰強度與面積可得知相同蛋白質在不同樣品間的相對含量(圖 5)。

(3) 串聯質譜標記(tandem mass tag, TMT)

TMT 技術首先由 Hamon 提出³³，此試劑可一次比較 2~6 個樣品，與 iTRAQ 試劑原理相似，皆利用 N-hydroxy-succinimide (NHS)反應基團與 胜肽產生鍵結(圖 6)。TMT 試劑包含因同位素取代的不同使分子量範圍為 126~131 的報導基團(reporter group)，以及依據 MS/MS 設定條件得出合適的斷裂鍵結區域(cleavable linker region)來幫助釋放 reporter group，使標記總質量維持相同的 mass normalization region，最後則是與胜肽鍵結的 protein reactive group^30,34。

(4) 蛋白質水解進行胜肽¹⁶O/¹⁸O 同位素標定(¹⁶O/¹⁸O peptide labeling during proteolysis)

將兩相互比較之樣品加入分別含有¹⁶O 與¹⁸O 的水中進行蛋白質水解，

為尿素的存在而被抑制，而且交換速率會因結構不同而改變。

(5) 雙甲基之穩定同位素標定法(stable isotope dimethyl labeling) 還原胺化反應(reductive amination)是一著名有機反應(圖 7)。首先，

胜肽 N-terminus 和賴氨酸殘基(lysine residues)會先和甲醛反應，形成 Schiff base ，再由還原劑氰基硼氫化鈉 (sodium cyanoborohydride, NaBH₃CN)形成二級胺(secondary amine)。所以當蛋白質樣品經水解後，

雙甲基會標定在胜肽 N-terminus 以及賴氨酸殘基(lysine residues)上，使其轉換成雙甲基胺(dimethylamines)。接著將衍生後具不同雙甲基同位素標記樣品混合，以質譜進行分析，由於分子量上的差異，判斷胜肽之訊號

37,38。此試劑優點為成本花費不高，過程並不複雜易自動化操作，適用於

高通量蛋白質體實驗上。

本次實驗使用的為同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)，其優點為：(1)可一次比較 4~8 組不同樣品；(2)因在檢視質譜掃描(survey scan)時四種標記總質量一樣，低含量蛋白質(low abundance proteins)的機會。由於傳統二維凝膠電泳雖

12 high performance liquid chromatography, MD HPLC)的發展促使廣泛應用在蛋白質體學的分析上，來補充傳統電泳在分離蛋白質所不能給予的訊息³⁹。MD HPLC 可結合多種不同性質之液相層析技術，依據極性、分子大小、帶電荷程度使樣品分離並降低其複雜度，因此可以提升質譜鑑定蛋白質的能力。此法優點如：(1)使樣品溶解度提高，能增加分離疏水性、分子量過大或過小、極酸或極鹼蛋白質的能力；(2)為高通量(high throughput) 分離技術；(3)再現性佳；(4)為自動化技術可與質譜直接連接；(5)對低含量蛋白質有富集(enrichment)效果。

本次實驗使用二維液相層析(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)的技術，結合兩種不同層析技術來達到分離效果。此種分離機制可提高層析的解析度，且能增加訊號數目(peak capacity)⁴⁰。在 2005 年 Martin Gilar 利用多種二維液相層析方法分離之正交性(orthogonality)和訊號數目判斷二維層析分離系統的分離效能 ^41,42，因此，依據樣品性質以及實驗設計串聯不同的分離技術可達到理想的分析效能。最常使用在 iTRAQ 標定胜肽的分餾策略上為第一維使用強陽離子交換(strong cation exchange, SCX)層析法，第二維則是結合了逆相(reverse phase, RP)層析法，依胜肽電荷以及親疏水性不同而達到分離，由於具有良好的正交性，所以可提高樣品分離的效能³²。

本實驗所選用的 SCX 層析法，為一種離子交換層析法(ion exchange chromatography, IEC)，是從複雜的混合物中分離性質相似大分子的方法

13 下設定緩衝溶液 pH 值若小於胜肽的等電點(isoelectric point)時，胜肽較易帶正電荷。接著配製 KCl 溶液，利用低濃度逐漸拉至高濃度比例的 KCl 緩衝溶液沖堤，則 KCl 的 K⁺離子會逐漸取代胜肽而與樹脂結合，使胜肽依價數低至價數高被沖提出來。實驗所用另一個分餾(fractionation)方法是使用 OFFGEL 等電聚焦分析儀(solution isoelectric focusing electrophoresis, sIEF)當作第一維分離，接著以 RP 層析連結進行第二維分析^43-46。在 2008 年由 Guette 等人利用 OFFGEL 以及 SCX 為第一維分析來分析經過標定的 iTRAQ 胜肽和無標定的胜肽，結果發現 OFFGEL 可得到較佳定量結果

47，且 OFFGEL 對複雜生物樣品的分離有良好效果很適合分析 iTRAQ 標定胜肽⁴⁸。

等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF)原理是將兩性電解質載體放入電泳槽中，並施加直流電，使兩性電解質形成一個由陽極至陰極逐步增

2006 年 Agilent Technologies 公司開發出等電聚焦分析儀(OFFGEL)，

有別於之前如二維凝膠電泳分離後樣品存在於膠體之中，OFFGEL 分離原

離子源(ion source)、質量分析器(mass analyzer)、偵測器(detector)以及資料處理系統(data system)。其基本原理是分析物在離子源中會產生游離轉變成氣相具不同質荷比的帶電離子，經由電場電位差以及真空度的差異，

而將帶電離子引導進入質量分析器，在質量分析器中利用電場或磁場使不同質荷比的離子(mass-to-charge ratio, m/z)在空間上或時間上分離，最後送至偵測器偵測以及資料處理便可從電荷推算分析物的質量。早期最常使

用的游離法為電子碰撞游離法(electron ionization, EI)以及化學游離法 (chemical ionization, CI) ^50,51，因其使用上分析物需高揮發性且分子量不能過大之限制，所以均無法有效偵測生化大分子。直到 1980 年代末 John B. Fenn 提出了電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) ⁵² 及 Hillenkamp 、 Tanaka 等人提出了基質輔助雷射脫附游離法 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) ⁵³成功的偵測到蛋白質分子後，游離法的技術才有了重大突破，進而促使質譜法從分析小分子中。且由於 ESI 具備 concentration-dependent 的特性，本實驗參考 Goodlett 提出的 nanoLC 分流進樣系統⁵⁶，利用此系統可以有效增加質譜偵測微量樣品時的靈敏度(圖 10)。其組成包含一組 Agilent 1100 series HPLC、一個 QSTAR XL 質譜儀上的六向閥、兩個 peek microtee (IDEX Health & Science, US) 接頭、一段連接高電壓的 metal union、一根

pre-column、一根 RP-µLC column 以及提供背壓(back pressure)連接系統各段的管路毛細管(50 µm I.D.)。當系統在 load-mode 時，連接在質譜上的六向閥是在打開的位置,由於 RP-µLC column 提供很高的背壓，所以分析樣品及溶劑均會通過 pre-column 直接導入廢液桶，此時胜肽會被 pre-column 抓住，經由一段時間的沖堤，即達到 on-line 去鹽的效果；當系統在 injection mode 時，連接在質譜上的六向閥是在關閉的位置且同時打開分流通往廢液桶的管路，所以溶劑會被迫通過 RP-µLC column，此時在 metal union 上提供高電壓，經由 liquid junction，使通過 RP-µLC column 的溶劑及樣品可以進行帶電噴灑游離。而分流管路的長短決定其提供的背壓，進一步決定了分流及進樣的流速。本實驗採用 50 µm I.D.的毛細管進行分流，使溶劑最後通過 RP-µLC column 達到約 200 nL/min 的進樣流速。

在質譜儀技術快速發展下，現今常使用串聯式質譜法(tandem mass spectrometry, MS/MS)來鑑定蛋白質^57-59。本實驗設計 iTRAQ 複雜樣品第一維使用 SCX 或是 sIEF 的分餾技術，接著以實驗室自己設計的 RP-µLC 毛細管柱進行第二維分離降低胜肽複雜度後，搭配 Q-TOF 串聯式質譜儀 (QSTAR XL, Applied Biosystems Sciex)來鑑定蛋白質的身分 (圖 11)。

Q-TOF 的質量分析器包含了兩段四極桿(quadrupole)與一個飛行時間質量分析器(time-of-flight, TOF)。四極桿質量分析器是由四支平行排列的電極棒所構成，電壓會改變電場大小，決定離子是否能通過四極桿，且在特定

器，僅允許特定離子通行再送入 Q2 進行碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)撞碎⁶⁰。Q2 為一碰撞室，維持 RF-only 模式，內部會充填少量惰性氣體分子如氮氣或是氬氣，除了可增加四極桿的離子傳送效率

Q-TOF 的離子偵測器是一套微通道片(microchannel plate, MCP)，會收集大量的電子產生一脈衝電流，此電流經轉換後會送至訊號收集儀器(time to digital converter, TDC)上，產生質譜訊號。

由於胜肽在質譜的氣碰撞相環境中特別容易斷裂在其胜肽鍵，其離子片段的命名如圖所示(圖 12)；由同一系列的碎片，如 y1、y2、y3...等，從之間的質量差距可計算出該胜肽前驅離子部分甚至全部序列，以此序列資訊和資料庫中的理論蛋白質水解胜肽資訊比對，稱為胜肽碎片指紋 (peptide fragment fingerprinting, PFF) ^61,62比對。除了原來的胺基酸排列組合後的胜肽質量，還多了由胜肽碎片得到特定的一段或多段胜肽序列，

因此比對結果的專一性以及正確率，皆遠高於胜肽質量指紋(peptide mass fingerprinting, PMF) ⁶³鑑定得到的結果，常用於蛋白質身分的確認或後轉譯修飾結構鑑定上。

八、細胞因子微陣列(sandwich-based antibody array)

18 子上不同的抗原決定位置(epitope)相結合的抗體，此抗體上有標定 biotin (biotinylated antibidy)，可和後續加入的 streptavidin-conjugated enzyme

在文檔中利用化學標定及質譜技術分析經脂多醣刺激後小鼠巨噬細胞 (RAW 264.7) 之比較分泌蛋白質體研究 (頁 21-33)

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第一章序論