利用化學標定及質譜技術分析經脂多醣刺激後小鼠巨噬細胞 (RAW 264.7) 之比較分泌蛋白質體研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系研究所碩士論文 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 利用化學標定及質譜技術分析經脂多醣刺激後小鼠巨噬細胞 (RAW 264.7) 之比較分泌蛋白質體研究 Comparative Secretome Analysis of LPS-stimulated RAW 264.7 by Chemical Labeling and Mass Spectrometry. 研究生：戴珮琳. 撰. Graduate Student: Pei-Lin Tai 指導教授：陳頌方博士 Advisor: Sung-Fang Chen, Ph.D. 中華民國一百零二年七月 July, 2013.

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(3) 謝誌白駒過隙，很快地兩年的碩士生涯即將邁入尾聲，在此我要感謝我的指導教授陳頌方博士的教誨，老師總是諄諄不倦的傳授我們專業知識並培養我們解決問題的能力，而閒暇之餘也會帶領我們打球訓練強健的體魄以及討論時事指引我們看事情的角度，使我們不論在學識或待人處世上都受益匪淺。同時非常感謝工研院曾湘文博士多次提供樣品以及指導實驗，使我可以如期完成研究。此外，感謝芷葳學姊協助我解決實驗面臨的困境以及常聽我說心事以及生活上給予我建議；沛倫學長專業的 Mascot 講解使我操作更容易上手；德蕙學姐、育廷學長以及昀諭學長教導我實驗以及質譜的一些使用技巧使我受益良多；子瑋學長常協助我解決使用質譜遇到的一些問題；郡倫學姊開朗活潑，使實驗室充滿歡笑，對美食的熱情更是令人讚嘆不已；帥氣的俞靜學姊，很懷念妳的台語發音學習，非常有趣；冷靜的群皓在實驗以及質譜上的互相幫忙還有提供生活上一些有用的資訊；溫柔熱心的立平是我分享心事的好麻吉，妳的打氣總是溫暖我的心；堯聰在實驗上的互相討論以及常分享生活上發生的趣事總是令我笑開懷；活潑外向的祖儀提供的一些旅遊景點使我有了更多選擇；昀昇健談風趣，講話老實；可愛的羽薇總是支持我鼓勵我；佳穎做事認真負責，善解人意。在 C404 的這兩年很高興有你們的陪伴，是我非常珍貴珍惜的回憶。最後，感謝柏睿對質譜儀的維護不遺餘力以及非常感謝口試委員黃聖聿博士、曾湘文博士和陳翰民老師可以百忙抽空參加我的口試並給予指導和建議，使我論文趨於完善。也非常感謝父母支持我、鼓勵我並給予許多資源上的援助，使我可以專注於學業上並順利完成論文。. I.

(4) 目錄謝誌 ............................................................................................................. I 目錄 ............................................................................................................ II 圖目錄 ......................................................................................................... V 表目錄 ....................................................................................................... VII 英文縮寫檢索表 ....................................................................................... VIII Abstract ...................................................................................................... X 中文摘要 .................................................................................................... XI 第一章. 序論 ............................................................................................ 1. 一、免疫系統 ....................................................................................... 1 二、發炎反應 ....................................................................................... 2 三、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS) ................................................. 3 I. 概述 ........................................................................................ 3 II. Endotoxin tolerance ................................................................ 4 III.. 細胞經 LPS 刺激其內部的訊號機制 ..................................... 4. 四、蛋白質分泌機制 ............................................................................ 5 五、差異蛋白質體學(differential proteomics) ...................................... 6 I. 二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE) .... 7 II. 代謝物標定(metabolic labeling) (in vivo)................................. 8 III.. 化學標定(chemical labeling) (in vitro).................................. 8. 六、液相層析分離技術 ...................................................................... 11 七、質譜儀技術 ................................................................................. 14 八、細胞因子微陣列(sandwich-based antibody array) ..................... 17 九、西方墨點法(Western blot) .......................................................... 18 II.

(5) 十、研究動機 ..................................................................................... 19 第二章實驗材料與方法 ............................................................................ 20 一、樣品 ............................................................................................ 20 二、藥品 ............................................................................................ 21 三、試劑 ............................................................................................ 21 四、儀器設備 ..................................................................................... 22 五、蛋白質濃度測定(Bradford protein assay) ................................... 23 六、蛋白質水解(in-solution digestion)和標定 iTRAQ® 試劑 ............... 23 七、第一維分餾策略 .......................................................................... 24 I. 強陽離子交換層析法(SCX) ................................................... 24 II. 等電聚焦分級分離儀(sIEF) ................................................... 25 八、自製碳 18 離心管柱(C18 spin column)去鹽 ............................... 27 九、奈米級液相層析電噴灑游離串聯式質譜(nanoLC ESI tandem Mass spectrometry) .................................................................................... 28 十、資料分析(data analysis) ............................................................. 31 十一、資料驗證(verification)以及確認(validation) ............................. 33 I. 西方墨點法(Western blot) ..................................................... 33 第三章實驗結果與討論 ............................................................................ 39 一、樣品蛋白質濃度測定................................................................... 39 二、不同分餾策略對 iTRAQ 標記胜肽之分離 .................................... 39 I. 分餾 ...................................................................................... 39 II. 分餾策略之正交性(orthogonality).......................................... 41 III. 分餾策略之互補性(complementarity) .................................... 41 三、蛋白質身分鑑定 .......................................................................... 42 四、蛋白質定量 ................................................................................. 43 III.

(6) 五、細胞因子微陣列(cytokine microarray) ........................................ 44 六、Wetern blot 鑑定結果 ................................................................. 45 I. RAW264.7 cell secreted proteins: (in vitro) .......................... 45 II. Mice serum: (in vivo) ............................................................ 46 七、蛋白質分泌機制 .......................................................................... 46 第四章結論與未來展望 ............................................................................ 48 附圖 .......................................................................................................... 49 附表 .......................................................................................................... 91 參考文獻 ................................................................................................. 110. IV.

(7) 圖目錄圖 1、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)結構 ............................................ 49 圖 2、Intracellular signalling by toll-like receptors (TLRs)........................ 50 圖 3、同位素親和標定(isotope-coded affinity tags, ICAT)試劑結構 ......... 51 圖 4、同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)試劑結構 .................................................................. 52 圖 5、同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)流程圖 ...................................................................... 53 圖 6、串聯質譜標記(tandem mass tag, TMT)試劑結構 ............................ 54 圖 7、雙甲基之穩定同位素標定法(stable isotope dimethyl labeling) ....... 55 圖 8、OFFGEL 等電聚焦流程圖 ............................................................... 56 圖 9、電噴灑游離法(electrospray ionization, ESI)機制圖 ......................... 57 圖 10、連結質譜之液相層析分流進樣裝置 ............................................... 58 圖 11、Q-TOF 串聯式質譜儀裝置圖 ......................................................... 59 圖 12、質譜中常見胜肽離子碎片形式 ...................................................... 60 圖 13、細胞因子微陣列(cytokine array)反應示意圖 ................................. 61 圖 14、Western blot 反應示意圖 .............................................................. 62 圖 15、Western blot 轉漬裝置示意圖 ....................................................... 63 圖 16、RAW 264.7 實驗總流程圖 ............................................................ 64 圖 17、RAW 264.7 細胞株之分泌蛋白質體樣品培養流程圖 ..................... 65 圖 18、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 ...................................... 66 圖 19、強陽離子交換層析圖(SCX) ........................................................... 67 圖 20、強陽離子交換層析圖分管圖(圖譜放大) ........................................ 68 圖 21、等電聚焦分級分離儀運作參數變動情形 ....................................... 69 V.

(8) 圖 22、SCX-RP 蛋白質每管鑑定分布情形 .............................................. 70 圖 23、SCX-RP 各管分餾樣品鑑定之 unique peptides 其管數分布情形 . 71 圖 24、sIEF-RP 蛋白質每管鑑定分布情形 .............................................. 72 圖 25、sIEF-RP 各管分餾樣品鑑定之 unique peptides 其管數分布情形 . 73 圖 26、SCX-RP 層析正交圖 .................................................................... 74 圖 27、sIEF-RP 層析正交圖 .................................................................... 75 圖 28、各分餾策略鑑定蛋白質以及胜肽之 Venn diagram ....................... 76 圖 29、Serglycin 胜肽片段 CKPNGFFANCIEEK 之 MS/MS 圖譜 ........... 77 圖 30、Tenascin 胜肽片段 YAPISGGDHAEIDVPK 之 MS/MS 圖譜 ........ 78 圖 31、蛋白質分類圓餅圖 ........................................................................ 79 圖 32、蛋白質比率分布圖 ........................................................................ 80 圖 33、細胞因子微陣列(cytokine array)體外實驗測試結果 ..................... 81 圖 34、細胞因子微陣列(cytokine array)體內實驗測試結果 ..................... 82 圖 35、細胞因子微陣列(cytokine array)體內實驗測試結果 ..................... 83 圖 36、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 ..................................... 84 圖 37、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 ..................................... 85 圖 38、Western blot result for serglycin (RAW 264.7) ............................ 86 圖 39、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 ..................................... 87 圖 40、牛血清蛋白(BSA)標準溶液之校正曲線圖 ..................................... 88 圖 41、Western blot result for serglycin (mice serum) ............................ 89 圖 42、SignalP prediction result for serglycin ......................................... 90. VI.

(9) 表目錄表 1、樣品和牛血清蛋白(BSA)標準溶液之蛋白質吸收值與濃度表 .......... 91 表 2、強陽離子交換層析梯度表 ............................................................... 92 表 3、液相層析梯度表 ............................................................................. 93 表 4、SDS-PAGE 膠體溶液配製比例 ...................................................... 94 表 5、Mascot 軟體蛋白質身分鑑定結果 .................................................. 95 表 6、ProteinPilotTM 軟體蛋白質身分鑑定結果 ........................................ 96 表 7、三重複實驗蛋白質身分鑑定及定量結果 ......................................... 97 表 8、顯著性差異蛋白質體列表 ............................................................. 101 表 9、三次重複實驗皆鑑定到的蛋白質以及其相關文獻報導篇數和細胞位置 ................................................................................................................ 103 表 10、細胞因子微陣列(cytokine array)對老鼠體內及體外實驗搭配質譜鑑定定量總圖 ............................................................................................. 105 表 11、樣品和牛血清蛋白(BSA)標準溶液之蛋白質吸收值與濃度表 ...... 106 表 12、樣品和牛血清蛋白(BSA)標準溶液之蛋白質吸收值與濃度表 ...... 107 表 13、樣品和 BSA 標準溶液之蛋白質吸收值與濃度 ............................ 108 表 14、樣品和 BSA 標準溶液之蛋白質吸收值與濃度 ............................ 109. VII.

(10) 英文縮寫檢索表 2D-GE. two-dimensional gel electrophoresis. 2D-PAGE. two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. 2D-DIGE. two-dimensional differential in gel electrophoresis. 2D-LC. two-dimensional liquid chromatography. APS. ammonium persulfate. ACN. acetonitrile. BSA. bovine serum albumin. CI. chemical ionization. CID. collision-induced dissociation. DTT. dithiothreitol. EI. electron ionization. ESI. electrospray ionization. ELISA. enzyme-linked immunosorbent assay. ECL. enhanced chemiluminescence. FA. formic acid. FDR. false discovery rate. IDA. information dependent acquisition. IPA. isopropanol. IPG. immobilized pH gradient. ICAT. isotope-coded affinity tags. IEC. ion exchange chromatography. iTRAQ. isobaric tags for relative and absolute quantitation. kDa. kiloDalton VIII.

(11) LC. liquid chromatography. LPS. lipopolysaccharide. milli-Q H2O. Milli-Q systems dispense the water. MMTS. methyl methanethiosulfonate. MD HPLC MALDI. multidimensional high performance liquid chromatography matrix-assisted laser desorption ionization. MS. mass spectrometry. MS/MS. tandem mass spectrometry. MCP. microchannel plate. NHS. N-hydroxy-succinimide. OD. optical density. PBS. phosphate buffer saline. PMF. peptide mass fingerprinting. PFF. peptide fragment fingerprinting. RP. reverse phase. sIEF. solution isoelectric focusing. SDS. sodium dodecyl sulfate. SCX. strong cation exchange. SILAC. stable isotope labeling by amino acids in cell culture. TEAB. triethyl ammonium bicarbonate. TCEP. tris- (2-carboxyethyl) phosphine. TEMED. N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine. Tris. tris (hydroxymethyl) aminomethane. TOF. time-of-flight. IX.

(12) Abstract Lipopolysaccharide (LPS) is a complex glycolipid component of outer membrane of gram-negative bacteria. It is highly toxic for mammals, inducing strong inflammatory response and produce many cytokines. In this study, we employed the isobaric tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ) labeling strategy and mass spectrometry to analyze the secreted proteins from LPS-stimulated RAW 264.7 cell line. To reduce sample complexity for improving protein dynamic range and sequence coverage, combination of offline strong cation exchange chromatography (SCX) or OFFGEL isoelectric focusing is applied for fractionation of iTRAQ labeled peptides before reversed phase nanoLC mass spectrometry analysis. A total of 654 proteins were identified and quantified; 52 proteins were differentially expressed between LPS-stimulated cells and control cells. Many of them are associated with cellular process and regulation. Serglycin, an up-regulated proteins in LPS-stimulated macrophage cells, was subsequently validated both in vitro (culture medium) and in vivo (mouse serum) by Western blot. This is one of few studies of secretome analysis in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and these secretory proteins can provide further understanding of LPS-induced inflammation associated responses in macrophages.. Keyword: RAW 264.7, lipopolysaccharide, inflammation, iTRAQ, SCX, isoelectric focusing, Western blot, serglycin. X.

(13) 中文摘要脂多醣(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上一複雜醣脂分子，對於哺乳動物具有毒性，會誘使強烈的發炎反應並產生許多細胞激素，若過度的大量表現，則會導致敗血症和感染性休克。在此篇研究中，我們採用同重元素相對和絕對定量(iTRAQ)的標定策略及質譜技術，分析 LPS 刺激後小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)分泌的蛋白質。為了降低樣品的複雜度並提高鑑定蛋白質的動態範圍以及其序列覆蓋率，在送入奈米級液相層析質譜分析前會先結合強陽離子交換層析法(SCX)或 OFFGEL 等電聚焦分離技術對 iTRAQ 標定胜肽進行分離。本實驗共鑑定及定量 654 種蛋白質，這些蛋白質絕大多數和細胞過程以及調控相關，其中 52 個蛋白質在 LPS 刺激後具有顯著表現量的差異。我們從中篩選出經 LPS 刺激後含量具有顯著上升的蛋白質 serglycin 進行進一步的研究，利用西方墨點法(Western blot)驗證確認在離體細胞培養液以及活體小鼠血清中證實 LPS 可以活化 serglycin 的表現。由於探討 LPS 刺激 RAW 264.7 產生的分泌蛋白質的研究不多，因此本研究所鑑定出表現差異蛋白質對於 LPS 刺激後巨噬細胞產生發炎相關反應提供更多的瞭解。. 關鍵字：小鼠巨噬細胞株，脂多醣，發炎反應，同重元素相對與絕對定量，強陽離子交換層析，等電聚焦，西方墨點法，絲甘蛋白聚醣. XI.

(14) 第一章序論一、免疫系統免疫系統(immune system)是生物體內一個能辨識出非自體物質，通常是指外來的病菌，並且可抵禦其侵犯將病源消滅或排除之通稱，可區分為對內監控以及對外防禦兩大部分。對內包括辨認正常的自體細胞與不正常或發生突變的細胞，辨識後會移除老化、受損、以及死亡等老廢細胞；對外則可抵抗外來病源體侵犯。當免疫系統無法去除受損的細胞時，個體可能會生病或是進一步演變為癌症；若因辨識不清楚而除去自身正常細胞，則會使個體產生自體免疫疾病；若對外來侵入的病源體抵禦能力較低，個體容易受到感染；若對生活中常見且無害的外來物產生與一般人不同的過度敏感反應，即防禦功能過度亢進，則為過敏，而引發過敏的外來物稱為過敏源。免疫系統的性質又可分為先天免疫(innate immune system)以及後天免疫(adaptive immune system)：. I.. 先天免疫(innate immune system) 為非特異性免疫系統，是個體一道天然的屏障，提供天然的保護能力。. 首先，身體防禦感染的第一線，如個體體表的皮膚、黏膜可防止病源體(抗原)進入體內。但若病源體突破第一線進入個體後，則會引發發炎反應，使巨噬細胞活化進一步吞噬消滅病源體。若個體先天免疫反應還是無法完全消滅病源，就會啟動後天免疫系統來進行免疫反應加強抵禦能力。. II.. 後天免疫(adaptive immune system) 為特異性免疫系統，又可細分為細胞免疫與體液免疫，相互聯繫發揮 1.

(15) 作用。特異性免疫會對入侵的外來特定抗原進行辨識，接著啟動淋巴球中的 T 細胞(T lymphocytes)和 B 細胞(B lymphocytes)。細胞免疫由 T 細胞主導，會攻擊受感染細胞、癌細胞和移植細胞；體液免疫則由 B 細胞主導，當 B 細胞受抗原刺激後會產生特異性抗體，此抗體具有專一性且僅能與相對應的特定抗原結合並釋放到體液(血液和淋巴液)中，所以一種 B 細胞只能針對一種抗原產生一種抗體。當被抗原感染後，免疫系統經過一連串免疫反應會改善它對抗原的辨識能力。此改善過的反應會在致病源清除後以記憶的方式被保留起來，使之後若再度被同一致病源感染時，個體可以以更快、更有效的攻擊方式將其清除。通常無脊椎動物的免疫系統都是非特異性的，脊椎動物則非特異性以及特異性免疫皆具備，且兩者脣齒相依，密不可分。. 二、發炎反應發炎反應(inflammation)為先天免疫系統在組織受傷或受微生物侵入時所產生之局部保護反應，一般具有紅、腫、熱、痛之典型特徵，引起微血管擴張、血流加速、血管通透性增加及促使吞噬細胞(phagocytic cells) 藉變形運動穿過微血管與淋巴管進入組織，包圍、吞噬並分解目標物。其中樹突細胞(dendritic cell, DC)以及巨噬細胞(macrophage)會辨識外來病源體並摧毀，進一步啟動後天免疫，即特異性免疫來防禦；而嗜中性白血球(neutrophil)的吞噬能力最強，且會釋放化學物質吸引更多白血球來支援。除吞噬細胞外，自然殺手細胞(natural killer cell)也不需特定辨識分子，就可與帶有抗原的細胞相接，釋放穿孔素直接將其殲滅。由於個體適度的發炎反應可幫助抵禦病源體的入侵，但過度的回應則可能導致疾病的產生。因此，探討病源體入侵個體產生的免疫反應也許可以作為早期的預警。. 2.

(16) 三、脂多醣(lipopolysaccharide, LPS) I. 概述脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS) 是革蘭氏陰性菌 (gram-negative bacteria)細胞壁外膜上一種重要的成分，通常在動物體內具有很強的毒性反應，為內毒素(endotoxin)的一種. 1. 。結構上包含了三部份，分別為. O-antigenic polysaccharide、core oligosaccharide，以及 lipid A (圖 1)。其中又以 lipid A 較受到關注，到目前為止有許多證據指示出它為毒性的主要活性部份。當細菌侵入動物體時，LPS 作為重要抗原分子會被抗原呈遞細胞(antigen presenting cell)，即吞噬細胞內的巨噬細胞 (macrophage)、樹突細胞等所捕獲，經過這類細胞加工處理過後抗原會呈現在細胞表面，並呈遞給 T 或 B 淋巴細胞這類型的免疫細胞，引發一連串的免疫反應。 LPS 刺激生物體產生發炎反應並且激活單核細胞 (monocytes)和巨噬細胞(macrophages)產生許多細胞因子(cytokine)，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、白細胞介素-1(Interleukin -1, IL-1)、白細胞介素 -6(Interleukin -6, IL-6)以及一氧化氮(nitric oxide, NO). 2,3. 。其中一氧化氮. (nitric oxide, NO)是一種帶有自由基(free radical)的活性氣體，在生物體內具有許多重要的生理作用。它具有使血管擴張，抑制血小板凝集和抑制平滑肌細胞增生，作為神經傳導物質以及在免疫反應中扮演了重要角色。若細胞經由 LPS 或是由細胞因子(cytokines)，如 tumor necorsis factor-α (TNF-α)、interleukin-1β (IL-1β)、interferon-γ (IFN-γ) 的刺激下會誘使一般在正常情況下並不表現的一氧化氮合成系統(inducible NO synthase, iNOS)進一步表現並釋放出大量的 NO4,5。. 3.

(17) II. Endotoxin tolerance LPS 內毒素(endotoxin)的發現對於了解微生物是如何使生物生病的機制是極大的里程碑，再加上發現 LPS receptor 更促使了解許多微生物的毒性物質共享相同的傳遞機制。現今對內毒素的研究發現了一個問題，即 endotoxin tolerance, 簡稱 ET。Endotoxin tolerance 是一些免疫細胞如巨噬細胞或個體內經過小劑量 LPS 的刺激之後，會對於 LPS 的刺激呈現低反應或無反應的狀態. 6,7. ，但其具體的分子機制至今尚不清楚。也就是說，. 研究 endotoxin tolerance 對預防和或治療嚴重的感染，如敗血症，可能具有重要的臨床實用。近年來有研究指出，經過體外實驗測試發現 LPS 會誘使 endotoxin tolerance 以及抗發炎細胞因子，如 interleukin-10 (IL-10)， IL-1 receptor antagonist (Il-1ra)，對於其表達上升具有相關性；但在 toll-like receptor-4 (TLR4). 8,9. 和 monocytic scavenger receptor B110 會降低。而. toll-like receptor，簡稱 TLR，是免疫系統中相當重要的受器，主要的功能是去偵測外來病原體的入侵。一旦偵測到有病原體入侵，TLR 會啟動訊息傳導而活化 innate immune system，刺激巨噬細胞以及樹突細胞產生發炎細胞因子以及活化自然殺手細胞進而促使後天免疫系統(adaptive immune system)的啟動. 11,12. 。不同的 TLR 各有負責偵測的對象，例如 TLR3 負責. 偵測外來的雙股 RNA 病毒，TLR4 負責偵測細菌脂多醣的內毒素。. III. 細胞經 LPS 刺激其內部的訊號機制調控細胞因子產生的相關蛋白質為核轉錄因子(nuclear factor kappa-light- chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)。 NF-κB 是一蛋白質複合物，控制 DNA 的轉錄且可以調控細胞因子(cytokine)、趨化因子 (chemokine)以及黏附分子(adhesion molecule)的表現。當細胞受到刺激 4.

(18) 時，這些因子會被釋放出來，並且可以影響到細胞的生長、活化、發炎、免疫力、組織修補等功能。在細胞質中，原本和 NF-κB 結合在一起並抑制 NF-κB 功能的負調控蛋白(IκB)，因細胞接受外來的訊息刺激後，經磷酸化被降解(ubiquitination)進而失去作用，此時被釋放自由的 NF-κB 便進入細胞核。進入核內後，會與調控基因的啟動子(promoter)結合進而活化該基因的表現 13 (圖 2)。NF-κB 的活化作用除了與發炎反應之關係外，與癌症生成過程亦有關。其中包括調控細胞凋亡(apoptosis)、細胞循環 (cell cycle)、細胞分化(differentiation)以及細胞移動(cell migration) 14。由於 LPS 入侵個體若引發過度且高頻率性的發炎反應，可能會引發重度敗血症(severe sepsis)、感染性休克(septic shock)、全身發炎反應綜合症(systemic inflammatory response syndrome). 15. 或多重器官衰竭，一直. 是相當常見的死亡原因之一。因此，了解 LPS 造成的生物回應在臨床上具有重要價值。. 四、蛋白質分泌機制分泌蛋白質體(secretome)可被定義為細胞、組織或器官經由典型 (classical)或非典型(non-classical)分泌機制釋出之蛋白質 16。典型分泌機制即傳統分泌的途徑，在 1970 年代初期， Blobel 發現新合成的蛋白質，其本身的胺基酸序列中具有訊號序列(signal peptide)，來控制蛋白質在細胞內的運送。蛋白質在細胞內剛開始合成時，其胺基酸序列的 N 端會帶有特定的訊號序列，約由 3~60 個胺基酸構成；以分泌蛋白質體為例，在合成之初，核糖體(ribosome)會先轉譯出訊號序列，細胞質中有一種核蛋白，稱為 SRP (signal recognition particle)，能辨識該訊息序列並與此序列結合，此時核糖體合成蛋白質的工作會暫時停止，隨後 SRP 會牽引這條帶核糖體的 mRNA 與內質網(endoplasmic reticulum, ER)上的 SRP 受體結 5.

(19) 合。當 SRP 與受體結合時，已合成的胜肽片段包括訊號序列則進入內質網的囊腔中。接著核糖體會恢復合成蛋白質的工作，越來越長的胺基酸多肽鏈被推入內質網的囊腔中，而訊號序列則被內質網囊腔中的酵素切除。待蛋白質合成完畢，經摺疊、組裝及修飾後，會被送至高基氏體(Golgi complex)內，高基氏體之邊緣會突起形成囊泡(vesicles)，把蛋白質包裹在囊泡裡，藉由胞吐作用(exocytosis)將蛋白質釋放至細胞外。非典型分泌機制則是新合成的蛋白質不含有訊號胜肽、不送往內質網以及高基氏體的路線，較著名的例子包括 basic fibroblast growth factor (bFGF)、 β-galactoside-specific lectins (galectin 1, galectin 3)以及某些某些白細胞介素(interleukin, IL)家族成員，如 IL-1β，這些類型的蛋白質分泌需要一些具活性的 caspase 1 蛋白酶調控，但其相關機制仍須再做進一步探討 17。細胞的生理功能要能順利進行，端賴這些具功能性的蛋白質能正確無誤的送達目的地。因此，知道蛋白質在不同胞器的分佈可以幫助了解各蛋白質之間的交互作用與功能。利用 CBS Prediction Servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/)中的 SignalP、SecretomeP 等將質譜儀鑑定得到的蛋白質資料，以 FASTA 檔案進行分析。SignalP 可用來預測典型分泌的蛋白質，藉由胺基酸序列預測訊號胜肽的存在與切斷位置 18； SecretomeP 則是用來預測非典型分泌不具有細胞外訊號胜肽的蛋白質. 19. 。. 這些軟體可以幫助我們將鑑定得到的蛋白質於細胞中分布位置進行分類，更可以幫助我們了解這些蛋白質體中有那些訊號傳遞途徑或是細胞功能等可能受到影響。. 五、差異蛋白質體學(differential proteomics) 蛋白質體學的首要工作為蛋白質的身分鑑定，而定量分析蛋白質在不同生理狀態變化下的表現量則能進一步瞭解其功能或和病理機制之間的關 6.

(20) 聯性。為了找尋人體因疾病而改變之蛋白質體(proteome)，並期望找出具有潛力的生物標記(biomarker)應用於臨床疾病之診斷及治療，發展出差異蛋白質體學來對不同樣品其蛋白質體差異做相對定量分析。以下介紹一些差異蛋白質體學分析方法： I. 二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE) (1) 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE) 由於 1975 年 O’Farrel 成功利用二維凝膠電泳的技術將大腸桿菌上的蛋白質分離 20，之後二維凝膠電泳被大量運用在蛋白質體學的分析上 21-23。 2D-PAGE 是利用等電點(isoelectric point, pI)和分子量這兩個特性來分離蛋白質。蛋白質本身為兩性離子，會依據溶液 pH 值不同使蛋白質帶正或負電荷，當蛋白質在特定 pH 值其淨電荷為零，即為此蛋白質之等電點；而蛋白質等電點會因其本身序列、結構、形狀或後轉譯修飾的不同而不同。第一維時，在具有不同 pH 酸鹼梯度的膠體中施加電場，膠體中的蛋白質會依據其等電點不同進行等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)電泳分級分離；再根據蛋白質分子量大小不同，以 SDS-PAGE 做第二維分離。當樣品內蛋白質分離完成，加入染劑使蛋白質染色，常用的染色法為 Coomassie blue G-250 和銀染(silver staining)，依據蛋白質顏色的深淺可作相對定量，最後搭配質譜進行分析來鑑定蛋白質身分 24。 (2) 二維差異凝膠電泳(two-dimensional difference in gel electrophoresis, 2D-DIGE) 由於傳統 2D-PAGE 膠片間比對困難以及實驗再現性差，且常受限於染色技術的靈敏度，於是在 1997 年 Minden 提出進階的 2D-DIGE 技術 25。此技術是將欲比較的蛋白質樣品分別標示螢光染劑 Cyanine 3 (Cy3) 和 7.

(21) Cyanine 5 (Cy5)，以相同量混合後進行二維膠體分析。由於帶有不同染劑但相同的蛋白質會落在膠片相同的位置上，利用不同波長的光源激發螢光染劑，可於一片電泳膠片中藉由螢光強度的不同來比較兩種蛋白質樣品的差異，並可減少因多次操作而產生誤差的比例，最後送入質譜進行分析鑑定蛋白質身分以及其含量的多寡 26。 II. 代謝物標定(metabolic labeling) (in vivo) (1) 細胞培養胺基酸穩定同位素標定(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC) SILAC 技術首先由 Mann 提出. 27. ，是一種利用活體細胞在進行細胞培. 養時加入穩定的 13C、15N、2H 同位素來標定胺基酸，細胞經數代培養後，含有這些穩定同位素標定的胺基酸會完全摻入到細胞新合成的蛋白質中取代了原有的胺基酸。接著取出細胞內蛋白質以胰蛋白酶水解成較小段的胜肽，經質譜分析後發現以一般培養基培養和以同位素培養基進行培養的細胞株會因同位素標定而產生不同的質荷比，再利用所得譜峰進行蛋白質定量分析。SILAC 主要是細胞進行代謝時標定上同位素，有別於一般化學標定的方法，所以細胞內所有蛋白質皆會標定上同位素，可降低標定不完全之誤差，但此技術無法應用於組織或體液，只限用於活體細胞標定，且生長以及代謝率快速之細胞培養。. III. 化學標定(chemical labeling) (in vitro) (1) 同位素親和標定(isotope-coded affinity tags, ICAT) ICAT 技術首先由 Aebersold 提出，包含可與半胱胺酸(cysteine)結合的反應基(reactive group)，含有不同同位素 1H、2D 標定的連接區域(linker) 以及含有生物素(biotin)的親和基團(affinity grup) (圖 3)。首先蛋白質先經 8.

(22) 過變性(denature)及還原(reduction)，在蛋白質 sulfhydryl 基團上分別標定含有不同同位素 1H、2D 的 ICAT 試劑。接著混合樣品以胰蛋白酶水解成較小段的胜肽，再經由如 biotin-avidin 親和性層析法純化以及分餾 (fractionation)後送入質譜分析。由於標定上不同同位素 1H、2D 使分子量有 8 Da 之差異，利用化學性質理論上應完全相同之預測分別標定在不同樣品上，來比較樣品間含量上的差異. 27,28. 。但此技術易產生 1H、2D 同位. 素效應 (isotope effect) ，標定的胜肽片段無法在液相層析中共沖堤 (co-elute)出來，層析峰出現的時間不同易導致定量上的誤差；且 ICAT 試劑分子太大使標記後的胜肽不易進行碰撞誘導解離 (collision-induced dissociation, CID)，而胜肽碎裂的同時，biotin 的碎裂也會導致串聯式質譜圖譜的干擾。之後 Applied Biosystems 公司發展出 cICAT，在連接區域 (linker)由 9 個 12C 或 13C 組成，取代 1H、2D 的標定方式來降低同位素效應的情況發生；且在進行質譜分析前先將 biotin 及被標記胜肽分離，降低質譜分析時 biotin 碎裂譜峰造成的圖譜干擾。 (2) 同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 因為 ICAT 或 cICAT 只能分析含有半胱胺酸(cysteine)的蛋白質，為了突破此限制性希望可針對所有蛋白質作定量分析，在 2004 年發展出 iTRAQ 試劑 ( 圖 4) ，包括含有不同同位素導致質量不同的報導基團 (reporter group)、使標記總質量維持相同的平衡基團(balance group)以及可以與胜肽上的自由胺基(free amine group，通常位於 N 端和離胺酸 (lysine)上)產生鍵結的胜肽反應基團(peptide reactive group) 29-32。iTRAQ 試劑能夠應用於組織和細胞裂解(lysis)後，較能適用於生物系統作蛋白質定量分析，並不局限於細胞代謝培養。目前 iTRAQ 試劑一次能比較 4~8 個樣品，此次實驗選用四個 iTRAQ 試劑來一次比較四個樣品，因為其 9.

(23) reporter group 同位素的不同，質量分別為 114~117。將四個樣品以胰蛋白酶水解成較小段的胜肽後，分別和 iTRAQ 試劑 114~117 標定後再混合成一管，最後以液相層析串聯質譜進行分析。首先，標定不同試劑之胜肽總質量相同皆為 145 Da，所以在進行檢視質譜掃描(survey scan)時並不會有分子量上的差異，但在 MS/MS 時會將胜肽裂解成碎片離子並進行偵測，得到的 MS/MS 圖譜可知胜肽碎片的譜峰(fragment ion peaks)以及 reporter group 譜峰分子量 114~117 之碎片資訊。由胜肽碎片的譜峰分子量所得的資訊經過資料庫比對後可鑑定出蛋白質身分，而 reporter group 譜峰強度與面積可得知相同蛋白質在不同樣品間的相對含量(圖 5)。 (3) 串聯質譜標記(tandem mass tag, TMT) TMT 技術首先由 Hamon 提出 33，此試劑可一次比較 2~6 個樣品，與 iTRAQ 試劑原理相似，皆利用 N-hydroxy-succinimide (NHS)反應基團與胜肽產生鍵結(圖 6)。TMT 試劑包含因同位素取代的不同使分子量範圍為 126~131 的報導基團(reporter group)，以及依據 MS/MS 設定條件得出合適的斷裂鍵結區域(cleavable linker region)來幫助釋放 reporter group，使標記總質量維持相同的 mass normalization region，最後則是與胜肽鍵結的 protein reactive group30,34。 (4) 蛋白質水解進行胜肽 16O/18O 同位素標定(16O/18O peptide labeling during proteolysis) 將兩相互比較之樣品加入分別含有 16O 與 18O 的水中進行蛋白質水解，過程中 16O 與 18O 會逐漸標定在胜肽之 C-terminus，之後將分別標定完 16O 與 18O 的樣品混合，送入質譜進行分析。由於分子量上的差異，可由圖譜判斷同段胜肽來自不同樣品，再依據譜峰強度或面積得知其相對含量 35,36。雖然這是一種簡單而且可行的同位素標定方法，但 16O 與 18O 質量相距太小，在低解析度電噴灑游離質譜儀做定量分析會較困難； 10. 18. O 的交換會因.

(24) 為尿素的存在而被抑制，而且交換速率會因結構不同而改變。 (5) 雙甲基之穩定同位素標定法(stable isotope dimethyl labeling) 還原胺化反應(reductive amination)是一著名有機反應(圖 7)。首先，胜肽 N-terminus 和賴氨酸殘基(lysine residues)會先和甲醛反應，形成 Schiff base ，再由還原劑氰基硼氫化鈉 (sodium cyanoborohydride, NaBH3CN)形成二級胺(secondary amine)。所以當蛋白質樣品經水解後，雙甲基會標定在胜肽 N-terminus 以及賴氨酸殘基(lysine residues)上，使其轉換成雙甲基胺(dimethylamines)。接著將衍生後具不同雙甲基同位素標記樣品混合，以質譜進行分析，由於分子量上的差異，判斷胜肽之訊號 37,38. 。此試劑優點為成本花費不高，過程並不複雜易自動化操作，適用於. 高通量蛋白質體實驗上。本次實驗使用的為同重元素相對與絕對定量標定(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)，其優點為：(1)可一次比較 4~8 組不同樣品；(2)因在檢視質譜掃描(survey scan)時四種標記總質量一樣，所以不會增加質譜對樣品分析時的複雜度；(3)且因加總各個樣品來自同一蛋白質，在 MS/MS 時可提高分析靈敏度和 S/N 比值，對蛋白質鑑定信心程度較高。. 六、液相層析分離技術近幾年隨著軟性游離源以及質譜技術不斷推陳出新，使得在鑑定生化大分子上成為強而有力的工具，但生物檢體之組成通常極為複雜，若是想分析細胞、組織或個體中的蛋白質，以現階段質譜技術還是無法一次鑑定到數千以上的含量。因此在進行質譜分析前，為了降低這些蛋白質樣品的複雜度，發展了一些蛋白質分離技術做為輔助，而運用此技術可促使看到低含量蛋白質(low abundance proteins)的機會。由於傳統二維凝膠電泳雖 11.

(25) 可分離大量蛋白質，但技術上有很多的限制，例如：(1)疏水性膜蛋白溶解度低；(2)分子量過小或過大的蛋白質(小於 16 kDa 或大於 150 kDa)或極酸極鹼蛋白質不易觀察且回收率低；(3)微量蛋白質在膠體上不易呈色，易被高含量蛋白質遮蔽。雖然有諸多限制，但具高解析能力在分離樣品比較其差異性還是有良好表現。而多維度高效能液相層析(multidimensional high performance liquid chromatography, MD HPLC)的發展促使廣泛應用在蛋白質體學的分析上，來補充傳統電泳在分離蛋白質所不能給予的訊息 39。MD HPLC 可結合多種不同性質之液相層析技術，依據極性、分子大小、帶電荷程度使樣品分離並降低其複雜度，因此可以提升質譜鑑定蛋白質的能力。此法優點如：(1)使樣品溶解度提高，能增加分離疏水性、分子量過大或過小、極酸或極鹼蛋白質的能力；(2)為高通量(high throughput) 分離技術；(3)再現性佳；(4)為自動化技術可與質譜直接連接；(5)對低含量蛋白質有富集(enrichment)效果。本次實驗使用二維液相層析(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)的技術，結合兩種不同層析技術來達到分離效果。此種分離機制可提高層析的解析度，且能增加訊號數目(peak capacity)40。在 2005 年 Martin Gilar 利用多種二維液相層析方法分離之正交性(orthogonality)和訊號數目判斷二維層析分離系統的分離效能. 41,42. ，因此，依據樣品性質以及實驗設. 計串聯不同的分離技術可達到理想的分析效能。最常使用在 iTRAQ 標定胜肽的分餾策略上為第一維使用強陽離子交換(strong cation exchange, SCX)層析法，第二維則是結合了逆相(reverse phase, RP)層析法，依胜肽電荷以及親疏水性不同而達到分離，由於具有良好的正交性，所以可提高樣品分離的效能 32。本實驗所選用的 SCX 層析法，為一種離子交換層析法(ion exchange chromatography, IEC)，是從複雜的混合物中分離性質相似大分子的方法 12.

(26) 之一，依據的原理是物質的酸鹼性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換樹脂有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和 pH 值，物質就能依次從層析管柱中分離出來。SCX 選用的管柱內部包覆一親水性、陰離子聚合物的樹脂，本實驗使用材質為 poly(2-sulfoethyl aspartamide)，是一種強陽離子交換之材料。在酸性條件下設定緩衝溶液 pH 值若小於胜肽的等電點(isoelectric point)時，胜肽較易帶正電荷。接著配製 KCl 溶液，利用低濃度逐漸拉至高濃度比例的 KCl 緩衝溶液沖堤，則 KCl 的 K+離子會逐漸取代胜肽而與樹脂結合，使胜肽依價數低至價數高被沖提出來。實驗所用另一個分餾(fractionation)方法是使用 OFFGEL 等電聚焦分析儀(solution isoelectric focusing electrophoresis, sIEF)當作第一維分離，接著以 RP 層析連結進行第二維分析 43-46。在 2008 年由 Guette 等人利用 OFFGEL 以及 SCX 為第一維分析來分析經過標定的 iTRAQ 胜肽和無標定的胜肽，結果發現 OFFGEL 可得到較佳定量結果 47. ，且 OFFGEL 對複雜生物樣品的分離有良好效果很適合分析 iTRAQ 標. 定胜肽 48。等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF)原理是將兩性電解質載體放入電泳槽中，並施加直流電，使兩性電解質形成一個由陽極至陰極逐步增加 pH 形成一梯度。當胺基酸在特定某一 pH 值下其分子內淨電荷為零且在電場中不移動時，即為此蛋白質之等電點，而大部份蛋白質於等電點的 pH 值下，其溶解度最小將會沉澱。等電點聚焦電泳有兩種產生 pH 梯度的方式：(1)人工 pH 梯度，原理為在電場環境下，混合兩個不同 pH 的緩衝液使其互相擴散，在其混合區間即形成 pH 梯度，此 pH 梯度受緩衝液電解質離子受電場遷移及擴散的影響，導致 pH 梯度很不穩定且再現性差，現已不再使用；(2)天然 pH 梯度，是在 60 年代初由 Svensson 引入。原理是施加一系列兩性電解質混合物在電泳管中，在電場作用下會按各自等 13.

(27) 電點從陽極到陰極逐漸產生平滑且連續的 pH 梯度，且此 pH 梯度取決於兩性電解質的 pI 值、濃度和緩衝溶液性質，當施加電流穩定就可維持穩定的 pH 梯度。在此 pH 梯度中，樣品內蛋白質會遷移到各自的等電點而達到分離效果。Svensson 認為理想的兩性電解質載體應具備下列條件：(1) 易溶於水，且在其等電點處有足夠的緩衝能力形成穩定的 pH 梯度，不至被蛋白質或其他兩性電解質改變 pH 梯度；(2)在等電點處應有良好的導電力及相同的導電係數來維持電場導電均勻；(3)分子量小，可通過透析或分子篩與生化大分子分開；(4)化學性質穩定，要與被分離物質組成不同且也不會和被分離物起化學反應和變性作用。 2006 年 Agilent Technologies 公司開發出等電聚焦分析儀(OFFGEL)，有別於之前如二維凝膠電泳分離後樣品存在於膠體之中，OFFGEL 分離原理為進行電泳時，待測樣品會在膠條間移動，當樣品內蛋白質移動到其等電點時會從膠條中釋出，存在於 pH 梯度孔膠體上層的緩衝液中，最後再把上層緩衝液回收(圖 8)。此法不論是再現性或便利性都很高，對於分離分子量較小的胜肽樣品也有一定優勢，現已被廣泛利用在分離蛋白質和胜肽樣品 49。. 七、質譜儀技術質譜儀的結構主要可分為五大部分，分別為樣品進樣區(sample inlet)、離子源(ion source)、質量分析器(mass analyzer)、偵測器(detector)以及資料處理系統(data system)。其基本原理是分析物在離子源中會產生游離轉變成氣相具不同質荷比的帶電離子，經由電場電位差以及真空度的差異，而將帶電離子引導進入質量分析器，在質量分析器中利用電場或磁場使不同質荷比的離子(mass-to-charge ratio, m/z)在空間上或時間上分離，最後送至偵測器偵測以及資料處理便可從電荷推算分析物的質量。早期最常使 14.

(28) 用的游離法為電子碰撞游離法(electron ionization, EI)以及化學游離法 (chemical ionization, CI). 50,51. ，因其使用上分析物需高揮發性且分子量不. 能過大之限制，所以均無法有效偵測生化大分子。直到 1980 年代末 John B. Fenn 提出了電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI). 52. 及. Hillenkamp 、 Tanaka 等人提出了基質輔助雷射脫附游離法 (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 53 成功的偵測到蛋白質分子後，游離法的技術才有了重大突破，進而促使質譜法從分析小分子拓展至生化大分子，尤其以分析蛋白質體成為一不可缺的工具 54。本實驗使用電噴灑游離法(圖 9)，以施加正電場的毛細管為例，當分析物溶液藉由施加高電壓的毛細管流出時，高電壓使得溶液中的正負離子分離，溶液中的負電荷離子會往施加正電場的方向移動，正電荷離子則會受到正電場排斥而聚集於毛細管管口處，由於電場和溶液表面張力的影響最後在毛細管尖端會累積大量正電荷離子並形成類似圓錐的帶電液滴，稱之泰勒錐(Taylor cone). 55. 。當施加於毛細管的電壓夠大時，這些帶電液滴便. 會從泰勒錐前端噴灑出來，緊接著帶電的液滴會因電位差以及真空差被送入質譜儀質量分析器中。帶電液滴進入質量分析器前的飛行過程會因不斷的與空氣接觸導致溶劑揮發使液滴體積變小，但是因液滴所帶的電荷總數仍維持不變，因此電荷密度高產生的庫倫斥力若大於表面張力時，帶電液滴會分裂成體積更小的液滴，更因隨著飛行過程溶劑不斷揮發促使帶電液滴不斷爆裂使得分析物得以形成帶多價電荷的氣相離子進入質量分析器中。且由於 ESI 具備 concentration-dependent 的特性，本實驗參考 Goodlett 提出的 nanoLC 分流進樣系統 56，利用此系統可以有效增加質譜偵測微量樣品時的靈敏度(圖 10)。其組成包含一組 Agilent 1100 series HPLC、一個 QSTAR XL 質譜儀上的六向閥、兩個 peek microtee (IDEX Health & Science, US) 接頭、一段連接高電壓的 metal union、一根 15.

(29) pre-column、一根 RP-µLC column 以及提供背壓(back pressure)連接系統各段的管路毛細管(50 µm I.D.)。當系統在 load-mode 時，連接在質譜上的六向閥是在打開的位置,由於 RP-µLC column 提供很高的背壓，所以分析樣品及溶劑均會通過 pre-column 直接導入廢液桶，此時胜肽會被 pre-column 抓住，經由一段時間的沖堤，即達到 on-line 去鹽的效果；當系統在 injection mode 時，連接在質譜上的六向閥是在關閉的位置且同時打開分流通往廢液桶的管路，所以溶劑會被迫通過 RP-µLC column，此時在 metal union 上提供高電壓，經由 liquid junction，使通過 RP-µLC column 的溶劑及樣品可以進行帶電噴灑游離。而分流管路的長短決定其提供的背壓，進一步決定了分流及進樣的流速。本實驗採用 50 µm I.D.的毛細管進行分流，使溶劑最後通過 RP-µLC column 達到約 200 nL/min 的進樣流速。在質譜儀技術快速發展下，現今常使用串聯式質譜法(tandem mass spectrometry, MS/MS)來鑑定蛋白質 57-59。本實驗設計 iTRAQ 複雜樣品第一維使用 SCX 或是 sIEF 的分餾技術，接著以實驗室自己設計的 RP-µLC 毛細管柱進行第二維分離降低胜肽複雜度後，搭配 Q-TOF 串聯式質譜儀 (QSTAR XL, Applied Biosystems Sciex)來鑑定蛋白質的身分 (圖 11)。 Q-TOF 的質量分析器包含了兩段四極桿(quadrupole)與一個飛行時間質量分析器(time-of-flight, TOF)。四極桿質量分析器是由四支平行排列的電極棒所構成，電壓會改變電場大小，決定離子是否能通過四極桿，且在特定電場下只會有某一質荷比範圍的離子能穿出四極桿。首先蛋白質經過蛋白質水解酶，如 Trypsin，使其水解成較小段胜肽後送入串聯式質譜儀，先通過 Q0，其作用為 ion guide，為一段維持在 RF-only 模式的四極桿。Q0 後面連接著 Q1、Q2 這兩段四極桿，Q1 四極桿在 RF-only 模式時，功能為讓離子通過；而若是 DC 與 RF 交互作用下時，則是作為一個質量篩選 16.

(30) 器，僅允許特定離子通行再送入 Q2 進行碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)撞碎 60。Q2 為一碰撞室，維持 RF-only 模式，內部會充填少量惰性氣體分子如氮氣或是氬氣，除了可增加四極桿的離子傳送效率外，也可以與待測離子相互碰撞後產生游離碎片。當待測離子通過 Q2 後，緊接著被加速進入飛行時間質量分析器；飛行時間質量分析器是一個不施加任何場壓的飛行管，離子經由相同的加速電壓進入飛行管，這些質量不同的離子會得到相同的電位能，電位能會再轉換成離子的動能，由於不同質量的離子有不同的飛行時間，質量大的離子飛行速度較小，質量小的離子則反之，進而從抵達偵測器之時間推算其質量。而 Q-TOF 採用反射式飛行時間質量分析器，由一系列的環電極所形成的離子鏡(ion mirror)，讓具有不同初速度的相同離子，可以同時抵達偵測器增加訊號的解析度。 Q-TOF 的離子偵測器是一套微通道片(microchannel plate, MCP)，會收集大量的電子產生一脈衝電流，此電流經轉換後會送至訊號收集儀器(time to digital converter, TDC)上，產生質譜訊號。由於胜肽在質譜的氣碰撞相環境中特別容易斷裂在其胜肽鍵，其離子片段的命名如圖所示(圖 12)；由同一系列的碎片，如 y1、y2、y3...等，從之間的質量差距可計算出該胜肽前驅離子部分甚至全部序列，以此序列資訊和資料庫中的理論蛋白質水解胜肽資訊比對，稱為胜肽碎片指紋 (peptide fragment fingerprinting, PFF). 61,62. 比對。除了原來的胺基酸排列. 組合後的胜肽質量，還多了由胜肽碎片得到特定的一段或多段胜肽序列，因此比對結果的專一性以及正確率，皆遠高於胜肽質量指紋(peptide mass fingerprinting, PMF) 63 鑑定得到的結果，常用於蛋白質身分的確認或後轉譯修飾結構鑑定上。. 八、細胞因子微陣列(sandwich-based antibody array) 17.

(31) 細胞因子(cytokine)為細胞分泌具有生物活性的小分子蛋白物質的統稱。由於細胞因子對細胞的生長、發炎、免疫等過程起重要作用，因此檢測細胞因子對臨床疾病診斷、病程觀察、療效判斷及治療監測方面具有重要價值，本實驗所用檢測細胞因子的方法是利用抗原抗體會特異性結合的特性來對其定量。首先，將和細胞因子具特異性之抗體固定在微量孔盤上，置入樣品來捕捉感興趣的細胞因子(capture antibody)，接著加入可以和細胞因子上不同的抗原決定位置(epitope)相結合的抗體，此抗體上有標定 biotin (biotinylated antibidy)，可和後續加入的 streptavidin-conjugated enzyme 進行結合。最後將沒有結合上的分子洗去，加入受質使 enzyme-substrate 結合並利用如化學發光方式產生印跡，其印跡深淺和細胞因子結合的數量成比例顯現(圖 13)。. 九、西方墨點法(Western blot) 為了驗證(verification)實驗過程以及方法的正確性，本實驗使用西方墨點法(Western blot) (圖 14、圖 15) 對感興趣的蛋白質做進一步的確認 (validation)。實驗的原理首先對蛋白質樣品進行 SDS-PAGE，利用樣品內蛋白質分子量的不同來進行分離，完成電泳後取出膠體，將膠體內的蛋白質轉印到可吸附蛋白質的硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)或 PVDF 膜(polyvinylidene difluoride membrane)等纖維膜片上，再利用抗體與相對應抗原具專一性結合的原理，加入與目標抗原專一性結合之抗體稱為一級抗體(primary antibody)，偵測膜上目標蛋白質的含量以及分子量 64-66。實驗設計分成直接法和間接法，直接法是直接在一級抗體上標定可產生訊號的分子，藉由此訊號可觀測目標蛋白質的位置以及提供定量的資訊；間接法則是除了一級抗體外還添加了對一級抗體具有專一性之二級抗體 (secondary antibody)，在此二級抗體上標定可產生訊號的分子並觀測目標 18.

(32) 蛋白質的位置以及提供定量的資訊。本實驗採用間接法，二級抗體上標定產生訊號之分子為一種酵素，即 horseradish peroxidase (HRP)酵素，利用化學發光受質 (chemiluminescent substrates) ，如 enhanced chemiluminescence (ECL) 試劑，以及在氧化劑過氧化氫(H2O2)的存在下促使 HRP 氧化且在波長 428 nm 放出冷光(luminescence)，藉由偵測冷光得知目標蛋白質位置以及定量。. 十、研究動機分泌蛋白質體(secretome)是指細胞、組織或器官，在正常或特殊的情況下如：加藥或接受訊息傳遞因子等作用時所分泌的蛋白質之總稱 67。而分泌蛋白質體學(secretomics)為蛋白質體學(proteomics)的子集，即研究分泌蛋白質的一門學問。由於巨噬細胞經 LPS 刺激活化產生不同的免疫反應對巨噬細胞的生存或死亡發揮了關鍵作用。目前已經有很多文獻探討受 LPS 激活之基因、蛋白質以及其途徑，但之前探討的這些標靶分子大多數為細胞內蛋白質，比較少研究經過施藥或刺激分泌至細胞外的蛋白質 68-70。因此，期望分析經 LPS 刺激後的分泌蛋白質體可針對因發炎反應產生的疾病來發現新穎的治療標靶。由於質譜儀技術日新月異的進展，近年來有關差異蛋白質體文獻以同位素標定法搭配質譜分析技術的策略之研究逐漸增加，常用來判斷病人與健康受試者蛋白質表達之差異。本實驗結合差異蛋白質體學分析技術，利用 iTRAQ 標定方法搭配串聯式質譜技術來比較經 LPS 刺激以及無刺激的小鼠巨噬細胞產生差異之分泌蛋白質體研究。其中會以二種不同分餾策略來分離標定 iTRAQ 試劑之胜肽，藉此提升鑑定到低含量蛋白質的機會促使鑑定到總蛋白質數目增加，期望可以有效率的鑑定以及從中發現新穎或較少被探討的與發炎相關的分泌蛋白質，實驗總流程如圖所示(圖 16)。 19.

(33) 第二章實驗材料與方法. 一、樣品 RAW 264.7 (murine leukaemic monocyte macrophage cell line, 小鼠白血病單核巨噬細胞株)，由工業技術研究院曾湘文博士所提供。其中包括 control、LPS、ACPS 以及 BB-G2 四組樣品。樣品製備方式如圖所示(圖 17)，將 RAW 264.7 巨噬細胞株，在培養基(culture medium)上添加營養物質，如本實驗使用胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)來進行細胞培養。其中 RAW 264.7 medium 上添加 FBS 培育 6 小時後，以 PBS 清洗三次再置換到另一無血清干擾且不再額外添加營養物質的 medium 上使其自由生長 12 小時，收集上面的分泌蛋白質體 (secretome)，此視為控制組(control)。而 medium 上若分別添加 LPS (lipopolysaccharides)、ACPS (antrodia cinnamomea polysaccharides) 以及 BB-G2 (soybean polysaccharides)刺激並以同樣的方式培育，收集其分泌蛋白質體(secretome)會得到 LPS、ACPS 以及 BB-G2 三組樣品。 ACPS 為牛樟芝多醣體，具有免疫、預防及控制腫瘤等生理活性，主要含 β-D-葡聚糖(β-D-glucan)，其作用是透過激發巨噬细胞、T 细胞及 B 细胞等來增強免疫功能，進而達到抗腫瘤的效果 71,72；BB-G2 為黑豆多醣體，具有免疫調節活性，抑制人類血癌細胞生長並誘導血癌細胞分化成正常細胞及具有活化造血系統的功能. 73. 。最後將此四組樣品利用 Amicon®. Ultra-0.5 (3 kDa)去鹽濃縮，即完成樣品製備。. 20.

(34) 二、藥品 1.. Bovine serum albumin (Sigma-Aldrich). 2.. Sequencing grade modified trypsin (Promega). 3.. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) (Sigma-Aldrich). 4.. Potassium chloride (KCl) (J.T Baker). 5.. Sodium dodecyl sulfate (J.T. Baker). 6.. Ammonium persulfate (Bio-Rad Laboritories Inc.). 7.. Dithiothreitol (Sigma-Aldrich). 8.. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Bio-Rad Laboritories Inc.). 9.. Bromophenol blue (Bio-Rad Laboritories Inc.). 10. Glycine (Bio-Rad Laboritories Inc.) 11. Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) (J.T. Baker) 12. Sodium chloride (NaCl) (J.T. Baker) 13. Skim milk powder (Sigma-Aldrich). 三、試劑 1.. Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories Inc.). 2.. Acetonitrile HPLC grade (Merck KGaA). 3.. Formic acid (J.T. Baker). 4.. 40% acrylamide/bis solution 37.5:1 (Bio-Rad Laboritories Inc.). 5.. N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (Bio-Rad Laboritories Inc.). 6.. Isopropyl alcohol (J.T. Baker). 7.. Methanol HPLC grade (Merck KGaA). 8.. Hydrochloric acid (HCl) (J.T. Baker) 21.

(35) 9.. Prestained Protein Ladder (PageRulerTM). 10. Glycerol (Sigma-Aldrich) 11. Tween® 20 (Sigma-Aldrich). 四、儀器設備 1.. 超純水系統 (Millipore Direct-Q3). 2.. 微量分析天平 (METTLER TOLEDO, EL 20). 3.. 電子防潮箱 (Eureka, AD-98). 4.. 多功能試管震盪器 (Scientific Industries, G-560). 5.. 桌上型離心機 (FOCUSBIO, pc-200). 6.. 可見光譜盤式分析儀 (Thermo Scientific, Multiskan FC). 7.. 真空離心濃縮機 (miVAC, DUC-12060-C00). 8.. 超音波震盪洗淨器 (Delta, DC150H). 9.. 分液收集器 (Pharmacia Biotech, FRAC-100). 10. 管柱恆溫器 (Torrey Pines Scientific, EchoThermTM CO20) 11. UV 偵測器 (Hewlett Packard, G1314A) 12. 二元幫浦 (Agilent Technologies, G1312A) 13. 等電聚焦分級分離儀 (Agilent Technologies, 3100 OFFGEL Fractionator) 14. 電磁加熱攪拌機 (Thermo Scientific, Cimarec® 2) 15. 電磁加熱攪拌機 (IKA, C-MAG HS7) 16. 高效能液相層析系統 (Agilent Technologies, Agilent 1100 series) 17. 高效能液相層析系統 (Agilent Technologies, Agilent 1200 series) 18. Q-TOF 串聯式質譜儀 (QSTAR XL, Applied Biosystems Sciex) 19. 迷你電泳槽系統 (Bio-Rad Mini-PROTEIN® Tetra System) 22.

(36) 20. 數字型恆溫乾浴槽 (Major Science, MD-02N-110) 21. 蛋白質轉漬設備 (Bio-Rad Mini-PROTEIN® Tetra System) 22. 酸鹼度計 (Mettler Toledo, EL20) 23. 冷光影像分析系統 (GE Healthcare, LAS 4000 mini). 五、蛋白質濃度測定(Bradford protein assay) 【實驗步驟】 1. 配製 BSA 標準液(0.1 µg/µL)，分別稀釋濃度 80 µg/mL、60 µg/mL、 40 µg/mL、20 µg/mL、15 µg/mL、10 µg/mL 及 0 µg/mL，且每管體積為 80 µL。 2. 將樣品取少量(2 µL~10 µL)並以 milli-Q H2O 稀釋至 80 µL。 3. 稀釋後的樣品和 BSA 標準液各加入 20 µL protein assay dye。 4. 在室溫下震盪混合均勻，以 1,500 x g 離心後靜置 10 分鐘。 5. 吸取樣品與不同濃度的標準液至 96 孔盤中待測。 6. 使用可見光譜盤式分析儀偵測 O.D. 595 nm 吸收值。 7. 將所得數據以 Microsoft Excel 軟體繪出吸收值對濃度之校正曲線，再藉由此校正曲線推算樣品的濃度。. 六、蛋白質水解(in-solution digestion)和標定 iTRAQ® 試劑【材料】 iTRAQ® Reagent Multi-plex Kit (AB Sciex): 四管 iTRAQ® reagent 114~117 皆能夠標定 5~100 µg 蛋白質 1.. Dissolution buffer: 0.5 M triethyl ammonium bicarbonate (TEAB). 2.. Denaturant: 2% sodium dodecyl sulfate (SDS). 3.. Reducing reagent: 1 mM tris- (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) 23.

(37) 4.. Cysteine blocking reagent: 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS) in isopropanol (IPA). 【實驗步驟】 1. 四組樣品分別取 100 µg 以真空離心濃縮機抽乾後再加入 20 µL dissolution buffer 回溶。 2. 為了使蛋白質變性(denaturation)，加入 1 µL denaturant 混合均勻。 3. 加入 2 µL reducing reagent，進行還原反應。 4. 混合均勻後在 60℃下培育一小時。 5. 加入 1 µL cysteine blocking reagent，混合均勻後在黑暗處室溫下靜置 10 分鐘。 6. 依蛋白質和 trypsin 重量比 1 : 50 的比例，分別將 2 µg 的 trypsin 加到樣品中，混合均勻後在 37℃的水浴槽中培育 12 小時進行 digestion。 7. 取出 iTRAQ® reagent 置於室溫下在各加入 70 µL ethanol，混合均勻。 8. 將四管 trypsin 水解後的胜肽樣品分別標定上 iTRAQ® reagent (m/z = 114~117)，混合均勻後放置在室溫下培育 2 小時。 9. 將四管經 iTRAQ® reagent 標定後的樣品混合成一管，再等量分成二管，每管約 200 µg 的量，並以真空離心濃縮機抽乾儲存於-20℃冰箱，以利後續實驗進行。. 七、第一維分餾策略 I.. 強陽離子交換層析法(SCX). 【管柱與緩衝溶液配置】 1. Javelin guard cartridge guard column (2.1 x 10 mm, 5 µm, 300 Å ) (PolyLC) 24.

(38) 2. PolySULFOETHYL A column (2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å ) (PolyLC) 3. SCX buffer A:10 mM KH2PO4 in 25% ACN, pH 3.0 4. SCX buffer B:10 mM KH2PO4 in 25% ACN with 350 mM KCl, pH 3.0 【實驗步驟】 1. 取其中一管 200 µg 的樣品以 SCX buffer A 回溶稀釋至 1.9 mL，降低樣品含鹽類的濃度。 2. 管柱恆溫器設定為 30℃，以流速每分鐘 0.2 mL 的 2% SCX buffer A 平衡管柱 1 小時。 3. 設定梯度(表 2)以及 UV 波長為 214 nm，接著注入樣品至管柱進行分餾。利用分液收集器，流速每分鐘 0.2 mL，設定每一分鐘收集一管，共收集 80 分鐘，最後將樣品匯集成 24 管(圖 20)，用真空離心濃縮機抽乾後儲存於-20℃冰箱。. II.. 等電聚焦分級分離儀(sIEF). 【藥品與試劑】 3100 OFFGEL Starter Kit (Agilent Technologies): 1.. Glycerol solution. 2.. OFFGEL ampholyte buffer 3-10: 根據 IPG 膠條的選用. 3.. Cover fluid (mineral oil). 【材料】 1. ImmobilineTM dry strip pH 3-10, 24 cm (GE Healthcare) 2. Electrode pads 3. Frames 4. cover seal 25.

(39) 【溶液配置】 1. 1.25X OFFGEL stock solution: 600 µL OFFGEL ampholyte buffer 3-10 in 6 mL glycerol solution, and add milli-Q H2O to the 50 mL. 2. IPG rehydration solution: 0.96 mL 1.25X OFFGEL stock solution and 0.24 mL milli-Q H2O 【實驗步驟】 1. 取另一管 200 µg 的樣品以 0.72 mL milli-Q H2O 回溶。 2. 加入 2.88 mL 1.25X OFFGEL stock solution 混合均勻，降低樣品含鹽類濃度。 3. 取出乾的 IPG 膠條，撕下背面膠片，把膠體朝上置於樣品盤中。 4. 將樣品槽壓進樣品盤內，不要移動到 IPG 膠條。 5. 吸取 40 µL IPG rehydration solution 於每個樣品孔內，靜置 15 分鐘後等待 IPG 膠條逐漸膨脹。 6. 吸取 IPG rehydration solution 沾濕四片電極護墊(electrode pad)且分別置於樣品槽兩側，而上層的電極護墊每 24 小時需更換一次。 7. 吸取樣品 150 µL 於每個樣品孔內，將 cover seal 覆蓋到樣品槽上。 8. 於 IPG 膠條兩側加入 10 µL milli-Q H2O。 9. 吸取 200 µL 和 400 µL 的保護液體(cover fluid)分別加在 IPG 膠條的正負電極，等待 1 分鐘。 10. 再吸取 200 µL 的保護液體於 IPG 膠條的兩端電極，等待 3 分鐘。 11. 最後在 IPG 膠條正電極處加入 200 µL 的保護液體。 12. 正負電極安裝在樣品盤兩側後，放入儀器連接器內並將機器開蓋闔上，設定參數方法(圖 21)後，開始進行分級分離。 13. 當樣品分離完成後，分別吸取至 tube 中，總共收集 24 管，將液體用真空離心濃縮機抽乾後儲存於-20℃冰箱。 26.

(40) 八、自製碳 18 離心管柱(C18 spin column)去鹽【材料】 1. Empty macro spin columnTM, 20 µm filter (Hoefer) 2. POLYGOPREP 60-50 C18, 40~63 µm, 60 Å (Macherey-Nagel) 【溶液配置】 1. Activation solution: 50% ACN 2. Equilibration/wash solution: 0.1% FA in 2% ACN 3. Elution solution: 70% ACN 4. Reused solution: 90% ACN 【碳 18 離心管柱製備】 1. 以 milli-Q H2O 潤洗管柱，用 1,500 x g 離心後去除液體。 2. 秤量 C18 beads，加入 70% ACN 且以攪拌子持續攪拌混合均勻。 3. 吸取等體積液體至每一空的離心管柱內，使離心管柱最後填充約 8~10 mg 的 C18 beads。 4. 以 1,500 x g 離心後將液體去除，完成 C18 離心管柱製備。【實驗步驟】 1. 將 SCX、OFFGEL 分餾收集後的樣品以 150 µL equilibration solution 回溶靜置在 4℃冰箱約 30 分鐘。 2. 用 200 µL activation solution 活化 C18 管柱，以 1,500 x g 離心 1 分鐘，並丟棄 flow-through。 3. 重複步驟 2 做 2 次。 4. 加入 200 µL equilibration solution 平衡 C18 管柱，以 1,500 x g 離心 1 分鐘，並丟棄 flow-through。 5. 重複步驟 4 做 4 次。 6. 吸取樣品至 C18 管柱中，以 1,500 x g 離心 1 分鐘，收集 flow-through。 27.

(41) 7. 為了確保樣品能夠完全被 C18 beads 捕捉到，把步驟六收集下來的 flow-through 再加入到 C18 管柱中，以 1,500 x g 離心 1 分鐘。 8. 重複步驟 7 做 1 次，之後丟棄 flow-through。 9. 加入 200 µL wash solution 洗去樣品內的鹽類，以 1,500 x g 離心 1 分鐘，丟棄 flow-through。 10. 重複步驟 9 做 4 次。 11. 更換回收管，加入 30 µL elution solution 至 C18 管柱，1,500 x g 離心 1 分鐘，以高有機相將樣品沖堤出來。 12. 重複步驟 11 做 2 次，並將所有去鹽完樣品利用真空離心濃縮機抽乾後儲存於-20℃冰箱。 13. 加入 200 µL reused solution 於 C18 管柱，以 1,500 x g 離心 1 分鐘，將可能殘留在 C18 beads 上的樣品完全沖堤出來，丟棄 flow-through。 14. 重複步驟 13 做 1 次後，將 C18 管柱保存於室溫，以利重複使用。. 九、奈米級液相層析電噴灑游離串聯式質譜(nanoLC ESI tandem Mass spectrometry) 【材料】 1. PKG MTL Magic C18AQ (Michrom Bioresources) 2. NUCLEOSIL 100-3 C18 (Macherey-Nagel) 3. Flexible fused silica capillary tubing, O.D. 375 µm, I.D. 75 µm (Polymicro Technologies) 4. Flexible fused silica capillary tubing, O.D. 375 µm, I.D. 100 µm (Polymicro Technologies). 28.

(42) 【自製液相層析管柱】 (A) Pre-column: 2 cm L X 100 µm I.D., 5 µm, 200 Å Magic C18AQ 1. 裁切一段 100 µm I.D. x 10 cm 的毛細管，在其前端以高溫火焰燒結約 0.2 cm 之 Si60。 2. 準備約 5 mg Magic C18AQ 溶於 1~1.5 mL 的甲醇溶液於小玻璃瓶中，並加入磁攪拌子，再將小玻璃瓶放置在 pressure bomb 中，於電磁加熱攪拌器上均勻攪拌。 3. 將未鍛燒那端的毛細管，穿過 pressure bomb 的上蓋，浸入含有 C18AQ 的甲醇中，調整至適當高低，鎖上毛細管及 pressure bomb 的上蓋。 4. 打開氣體鋼瓶壓力閥，提供毛細管 50~60 bar 的背壓，開始填充管柱。 5. 管柱填充至 2 公分長，將毛細管往上拉離液面，將殘餘的甲醇吹乾。 6. 最後當毛細管不再有液珠冒出，立即關掉氣體鋼瓶取出毛細管，即製備完 pre-column。 (B) RP-µLC column: 10 cm L x 75 µm I.D., 3 µm, 100 Å C18 1. 裁切一段 75 µm I.D. x 18 cm L 的毛細管，將毛細管一端黏貼固定，在其另一端夾上約 100 g 的重物，以高溫火焰定點鍛燒，毛細管因受到高溫以及重力的拉力，末端塑形成約 I.D.5 µm 細尖針狀。 2. 準備約 5 mg C18 溶於 1~1.5 mL 的甲醇溶液於小玻璃瓶中，並加入磁攪拌子，再將小玻璃瓶放置在 pressure bomb 中，於加熱板均勻攪拌。 3. 將未鍛燒那端的毛細管穿過 pressure bomb 上蓋，浸入含有 C18 的甲醇溶液，調整至適當高低，鎖上毛細管及 pressure bomb 的上蓋。 4. 打開氣體鋼瓶壓力閥，提供毛細管約 100 bar 的背壓，開始填充管柱。 5. 管柱填充至 10 公分長，將毛細管往上拉離液面，將殘餘的甲醇吹乾。 6. 最後直到毛細管不再有液珠冒出，關掉氣體鋼瓶取出毛細管，即製備完 RP-µLC column。 29.

(43) 【溶液配置】 1. LC mobile phase A: 0.1% FA in 2% ACN 2. LC mobile phase B: 0.1% FA in 98% ACN 【實驗步驟】將去鹽後的樣品以 40 µL 的 LC mobile phase A 回溶，混合均勻後靜置於 4℃冰箱 30 分鐘，以確保樣品回溶完全。之後吸取約 2 µg 樣品加進樣品瓶中，將樣品瓶放置在自動進樣器的樣品盤上。設定儀器參數以及方法：首先利用 pre-column 進行樣品 on-line 去鹽和濃縮，流速設定每分鐘 10 µL， 2% LC mobile phase B 持續 5 分鐘，接著使用實驗室架設的毛細管分流進樣裝置(圖 10)，設計分流後流速變為 200 nL/min 使胜肽在 RP-µLC column 中進行分離。在 90 分鐘內梯度從 2% LC mobile phase B 拉到 60% LC mobile phase B，接著維持在 80% LC mobile phase B 清洗 5 分鐘，最後以 2% LC mobile phase B 平衡 15 分鐘(表 3)。利用電噴灑游離(electrospray ionization, ESI)將沖堤出的胜肽離子化，以 Q-TOF 串聯式質譜儀(QSTAR XL, Applied Biosystems Sciex)進行分析。胜肽離子在質譜進行分析時，會先做一個檢視質譜掃描(survey scan)，設定掃描在 400 m/z~1,200 m/z 範圍內的所有胜肽離子，在資料依靠收集模式(information dependent acquisition, IDA)中，挑選超過 25 counts、二價到四價的胜肽離子，且訊號強度為前三名的做 MS/MS 分析，以碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)將胜肽離子碎裂且其掃描範圍在 75 m/z~1,500 m/z，當同樣一段胜肽離子於 180 秒內被掃描到 2 次以上，則不會再執行 MS/MS，且質量誤差的容許範圍為 200 ppm。【質譜參數設定】 IonSpray voltage (IS): ~1,000 V through liquid junction Declustering potential (DP): 60 V 30.

(44) Focusing potential (FP): 265 V Declustering potential 2 (DP2): 15 V Scan events: survey scan (400 m/z~1,200 m/z, 1 sec); product ion scan x 3 (75 m/z~1,500 m/z, 2 secs/each). 十、資料分析(data analysis) 【軟體版本】 1. Mascot server version 2.3.2 (Matrix Science) 2. Mascot Daemon version 2.3.0 (Matrix Science) 3. Scaffold Q+ 3.0.9 (Proteome Software) 4. ProteinPilotTM Software 2.0.1 (Applied Biosystems Sciex) 【方法】將所有經質譜分析後的資料利用 Mascot 軟體進行蛋白質身分鑑定，並搜尋其 decoy database，確定資料可信度(FDR < 5%)，再將 Mascot 鑑定完的結果轉成.dat 檔案，送進 Scaffold Q+比較，繪製出 Venn diagram。同樣的，將所有經質譜分析後的資料利用 ProteinPilotTM 軟體進行蛋白質身分鑑定以及定量，再將其結果轉出.txt 檔，之後挑選樣品間具有顯著差異性的蛋白質。. 【Mascot Daemon 參數設定】 Database: SwissProt_2011_08 (531,473 sequences, 188,463,640 residues) Enzyme: Trypsin Taxonomy: Mus musculus (Mus.) Type of search: MS/MS Ion Search 31.

(45) Peptide charge: 2+, 3+ and 4+ Quantitation method: iTRAQ 4-plex (Applied Biosystems iTRAQ® 4-plex) Fixed modifications: Methylthio (C), iTRAQ 4-plex (N-term), iTRAQ 4-plex (K) Variable modifications: Oxidation (M), iTRAQ 4-plex (Y) Peptide mass tolerance: ± 0.2 Da (# 13C=1) Fragment mass tolerance: ± 0.2 Da Max missed cleavages: 1 Instrument type: ESI-QUAD-TOF. 【Scaffold Q+鑑定門檻設定】 Scaffold Q+的胜肽與蛋白質可信度，由 Protein Prophet algorithm 演算而來 57,74，實驗選擇胜肽和蛋白質可信度大於 80%，且至少對應到兩條胜肽序列，繪製 Venn diagram，來比較不同分餾法樣品間的互補性。. 【ProteinPilotTM Software 參數設定】 Database: SwissProt_2011_08 (531,473 sequences, 188,463,640 residues) Sample Type: iTRAQ 4-plex (Peptide Labeled) Cys. Alkylation: MMTS Species: Mus musculus (Mus.) Digestion: Trypsin Instrument: QSTAR ESI Detected Protein Threshold (Unused ProtScore (conf) > 1.3 (95%) 32.

(46) 十一、資料驗證(verification)以及確認(validation) 為了驗證(verification)過程以及方法的正確性，實驗總共做了三重複，再個別將三次重複實驗經質譜分析後的資料利用 ProteinPilotTM 軟體得出的蛋白質定量結果，挑選出在三次重複實驗中皆有鑑定到且具有顯著差異性的蛋白質，再從其中挑選出比較感興趣的蛋白質以西方墨點法 (Western blot)進行蛋白質確認(validation)。. I. 西方墨點法(Western blot) 此實驗分為(a)及(b)兩部分： (a) 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 【材料】 Bio-Rad Mini-PROTEIN® Tetra System 【溶液配置】 1.. 膠體溶液: 30% acrylamide/bis solution 37.5:1 mixture, milli-Q H2O, 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 10% SDS, TEMED and APS, 詳細比例請參考表(表 4). 2.. 電泳緩衝溶液(10X running buffer): 0.25 M Tris, 1.918 M glycine and 0.035 M SDS. 3.. 2X sample buffer: For 10 mL (2X concentration): 2.5 mL 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 2 mL glycerol, 1 mg bromophenol blue, 0.4 g SDS, 0.31 g DTT and 5.5 mL milli-Q H2O. 33.