六種胞外分泌途徑包括有 type I、typeII、typeIII、typeIV、TPS(Two partner secretion ) 、自動運輸途徑(autotransport pathway)。其中 type I、type III 以單 一步驟便可將蛋白分泌至胞外，type I pathway 利用三個蛋白組成橫跨內外膜 的分泌通道，type III pathway 至少需要 20 個蛋白構成，兩種方式皆藉由形 (general secretory pathway；GSP) (Sandkvist, 2001b)。TPS pathway 則藉由 FhaC 在外膜形成孔洞，蛋白便由此通過外膜再分泌至胞外，經由此方式分泌出的 蛋白，分子量都大於 100kDa，甚至高達 400-500kDa ( Francoise, et al., 2001)。
而以 autotransport pathway 分泌的蛋白，在通過外膜時並不需要其他蛋白輔 助，此類蛋白的 C 端會插入外膜中形成孔洞，將 N 端蛋白傳送至細胞表面，
再經蛋白脢切割後釋放到胞外，達到胞外蛋白分泌的目的。Type IV pathway 藉由形成纖毛 pili 構造，接合宿主與細菌之間，細菌的 DNA 會和蛋白形成 複合體，經 type IV pili ( Tfp)形成得的中間孔洞分泌出；而對於毒素蛋白的
分泌，會藉由內膜上的 Sec 分泌系統，將蛋白由細胞質傳送過內膜到達胞外 漿質，再藉由 type IV pili ( Tfp)通過外膜，Type II pathway 則與此很相似 (Sandkvist, 2001b； Wolfgang et al., 2000； Peter J. Christie, 2001)。
在本論文所研究的對象-十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.
campestris)，是屬於革蘭氏陰性致病菌，主要感染十字花科類的植物，當此 病菌經由植物傷口感染後，會分泌一些酵素或蛋白質，包括澱粉酵素
（α-amylase）、果膠酵素（polygalacturonate lyase）、蛋白水解酵素（protease）、 及纖維酵素（cellulase）等，使病菌容易由植物導管蔓延擴散。當植物受感 染後會葉片逐漸枯黃，植物莖部、葉面出現黑點及腐化現象，主要原因是因 為黑腐病菌會產生胞外黏多醣(exopolysaccharide)，造成導管水分輸送發生問 題，進而導致植物的枯黃壞死(Swings and Civerolo, 1993)。而此細菌的胞外 蛋白分泌便是利用 type II pathway，幫助病菌有效感染宿主。
參與 type II 外膜分泌機制的基因，依菌種的不同有 12~15 個基因參與，
其基因的命名多依各菌種的基因英文順序排列。而從十字花科黑腐病菌中，
分離到一段與胞外蛋白分泌有關的 DNA 片段，約 12 kb 長，經由核甘酸定 序分析後，發現此 DNA 片段中含有 11 個首尾相連的 open reading frames (ORFs)，其胺基酸序列和負責 Klebsiella oxytoca pullulanase 分泌的蛋白有很 高相似性，故依其基因同源性，依序命名為 xpsE, F, G, H, I, J, K, L, M, N 及
Koster et al., 2000；Collins et al., 2001)。而其蛋白結構上，1996 年 Chen 等 人推論 Xanthomonas campestris XpsD 蛋白的 C 端與複合體形成有關(Chen, et al.,1996)。其他研究也指出 secretins 的 C 端會插入外膜中，而 N 端會暴露在 胞外漿質，並與其他參與分泌的蛋白產生交互作用( Shevchik et al., 1997；
Koebnik et al., 2000)。在最近的研究報告以電子顯微影像觀察指出，PulD 蛋 白的 C 端在經由蛋白質水解（proteolysis）的作用後，進而堆疊成一個通道，
而 N 端的部份會在 C 端蛋白形成複合體之後，往中央通道部分摺疊回去，
所以在平常時這個通道會是關閉的（Nouwen, et al., 2000）。
Type II 外膜分泌機制的外膜蛋白，除了 GspD 外，在某些菌中會發現 GspS 蛋白，功能上主要是穩定 GspD 蛋白且促進 GspD 插入外膜中( Koster, M., et al. 1997； Shevchik, V. E., et al, 1997)。然而 type IV pilus 生成系統及 type III 分泌系統，其外膜蛋白 PilQ、InvG 要插入外膜，並沒有出現和 PulS 相似性高的蛋白(Drake et al., 1997；Daefler and Russel, 1998)
和 GspD 蛋白有交互作用出現的，以目前研究發現有 GspN 和 GspC。
GspN 為內膜蛋白，在 Xanthomonas campestris 中，從免疫共沉澱的實驗結果 中發現，XpsN 會和 XpsD 有 coprecipitation 的現象(Lee, H.-M., et al., 2000)。
而 GspC 則同時出現在內外膜，以 cross-liking 的實驗顯示，在 PulD 存在時，
pulD 與 PulC 會形成大複合體( Possot et al., 1999)。進一步研究也發現 GspC 和內膜蛋白 GspL、GspM 有交互作用( Possot et al., 2000)。
在 Type II 外膜分泌機制中位於內膜上的蛋白，包括有 GspO、L、M、
N、F、E。GspO 有 prepilin peptidase 和 N-methyltransferase 的活性( Hardie, K.
R., et al, 1996；Shevchik, V. E., et al, 1997)。在 P. aeruginosa 中，XcpA/PilD ( GspO family)蛋白會將 PilA 纖毛前驅物的 N 端 leader sequence 水解進一步 進行甲基化，因而產生成熟的 PilA 纖毛( Bally, M., et al., 1991)。 目前知道 GspL、M 有交互作用而形成穩定的複合體(Michel et al., 1998)。而在
Xanthomonas campestris pv. campestris 研究中，在 xpsN 基因缺損的菌株下，
偵測不到 XpsL 和 XpsM；將帶有 xpsLMN 基因的質體，送入不包含所有 xps 基因的菌株(XC17433)，使此菌株只表現 XpsLMN 蛋白，再以免疫共沉澱法 實驗，發現 XpsL-XpsM、XpsM-XpsN、XpsL-XpsN 均有 coprecipitation 的現 象，因此推論 XpsN 和 XpsL-XpsM 形成複合體有關( Lee, H. –M., et al., 2001 )。GspF 蛋白則為具有三個 transmembrane domain 的蛋白。而 GspE 蛋 白須專一性的和 GspL 蛋白結合才能穩定的附著在內膜上( Ball et al.,
1999)，有研究指出 GspE 蛋白具有 ATPase 的功能，能提供能量打開外膜通 道，或促進 GspGHIJK 穿過內膜組裝成 Pili-like 的結構( Sandkvist et al., 2000)。
GspGHIJK 蛋白和 type IV pili 的 subunits 很相似，將這些蛋白與纖毛 PilA 進行同源比對，發現在兩者蛋白的結構上，其 N 端皆具高度厭水區（約
20-30 個胺基酸所組成），且都有可被 signal peptidase 切斷的 signal peptide。
因為與 PilA 相似度很高，所以為了和 PilA 組成的纖毛（type IV pili）有所 區別，一般稱 GspGHIJK 蛋白為 pseudopilins；type IV pilins 可組成很長的纖 毛，故推測 GspGHIJK 蛋白也可能會形成 pili-like 的構造。最近研究發現，
當在 E. coli 大量表現 K. oxytoca 的 type II 蛋白分泌基因時，PulG 會組成很 長的類似纖毛結構，但在正常生理情況下，並不能偵測到這樣的構造，可能 因為蛋白表現量很少，或出現時間很短的關係(Sauvonnet et al., 2000)。也因 為此因素，使得一直沒有直接證據證明 GspGHIJK 蛋白會形成 pili-like 的構 造。而在 2001 年針對 type IV pili 結構的研究中指出，k122-4 (29-150) pilin 的 三級結構是由 4 個β-sheet 及 1 個α-helix 組成，再藉由電性的不同，五個 pilin 會以螺旋狀排列組成一個”圈”(turn)的 pilus 結構(Keizer et al, 2001)。
針對纖毛組成與其他蛋白的關係的探討，發現在 P. aeruginosa 以 cross-linking 的實驗中，GspG 和 GspH、I、J 皆有交互作用(Lu et al., 1997)。
另外在 Sauvonnet 研究指出 PulI 在纖毛構成上可能作為組裝起始點，或位於 膜上的支持點，而 PulJ 和 PulK 對於纖毛的組成並沒有影響(Sauvonnet et al., 2000)。再以 Nesseria gonorrhoeae 的 type IV pili ( Tfp)而言，構成此 pili 的 主要蛋白為 PilE，PilE 由 PilD 修飾後，經由 PilF 組成纖毛構造，再通過由 PilQ 在外膜形成的通道，將 pili 延伸出去，而正常情況下，PilT 會將 pili 分 解掉，藉由此功能平衡了 PilF 功能，也因此穩定了整個系統的正常運作 (Wolfgang et al, 2000)。但在菌體內，GspGHIJ 的量並不相同，其中 XcpU-W(GspH-J)蛋白含量較少，約佔 XcpT(GspG)蛋白量的
25%~6.25%(Strom et al,1991)。雖然在 type II 蛋白分泌系統中，pseudopilins 和合成 type IV pili 的蛋白很相似，但卻未能清楚找出蛋白和蛋白之間的關
XC1701 以超高速離心後，區分成可溶部份(包括細胞質、胞外漿質)及不可 溶部份(細胞膜)，而 XpsG 蛋白會同時分佈在細胞質、膜外漿質與細胞膜部 分。再以膠質篩濾層析法分析可溶部份及不可溶部份時，發現可溶部份的 XpsG 主要以 multimer 型式存在，不可溶部分以 dimmer 型式存在。當 XpsG 蛋白大量表達時，在胞外可偵測到 XpsG 蛋白。由以上實驗結果認為 XpsG 在正常生理狀況下會形成纖毛構造。同時在實驗中，學姐也分別將位於 xpsG 基因上第 70、103、121、128、139 高度保留的 Aspartate(D)，以定位突變法 改成 glutamate(E)，其中 D70E、D121E、D128E、D139E 能回復 XC1713 胞 外酵素分泌功能，只有 D103E 不能回復。
為了進一步研究這些位置對 XpsG 蛋白是否有特殊意義，同時也希 望能利用 Ni-NTA 純化出有功能蛋白，所以在本論文研究中，配合限制 脢切位與胺基酸的電性，設計在第 69、100、120 位置上插入 7 個胺基 酸(DHHHHHV)。結果得到 F120-I7 蛋白，此變異蛋白失去將胞外蛋白 分泌出細胞的功能，同時不干擾正常 XpsG 蛋白的正常蛋白分泌功能。
在細胞分佈上與正常 XpsG 不同，沒有分佈在細胞質、胞外漿質。而以 膠質篩濾層析法、蔗糖濃度梯度分析，發現此變異蛋白以大分子形式存 在，且主要存在內膜上，與正常 XpsG 同時分佈在內、外膜不同。由此 推測 XpsG 在正常生理狀況下，會形成橫跨內外膜的纖毛構造。而更進 一步利用蔗糖濃度梯度，分析各個 xps 基因缺損的菌株中 XpsG 蛋白內 外膜分佈，發現在 xpsH 及 xpsD 基因缺損(XC1717、XC1708)的菌株下，
其 XpsG 蛋白內外膜分佈有所差異，由此推測在正常生理狀況下，形成 橫跨內外膜的 XpsG 纖毛構造與 XpsH 及 XpsD 蛋白有關。