XpsG 會形成橫跨內外膜的纖毛構造
一般革蘭氏陰性致病菌靠著細胞表面的大分子纖毛，附著在宿主細 胞進行複製，並分泌胞外酵素來幫助感染。Type IV pathway 藉由形成長 纖毛(pili)構造，將蛋白分泌至胞外。而GspGHIJK 蛋白其 N 端序列與 type IV pilin 有很高的相似性，並稱為 pseudopilin，推測也會形成類似纖毛 的結構。
在 1996 年，Pugsley 利用 cross-linking 實驗看到 PulG 可形成
multimer(dimmer-pentamer)。之前浴伶學姊的實驗中，對於十字花科黑腐 致病菌 XpsG 蛋白的研究，認為可分為兩種型式，水溶部份(包括細胞質、
胞外漿質) 以 multimer 型式存在，酯溶部份(細胞膜) 以 dimmer 型式存在；
又因 XC1713/pCPP30-FG 大量表現 XpsG 時，在胞外可偵測到 XpsG 蛋白，
進一步以膠質篩濾層析法分析，也發現胞外的 XpsG 蛋白和水溶部分的 XpsG 分子形式是一樣的，故推測在正常生理狀況下，XpsG 於膜上會形成 纖毛結構。
XpsG 是由 143 個氨基酸構成的蛋白，將 XpsG 與其他 GspG 作序列比 對時，發現除了 N 端厭水區域外，在 C 端區域亦有較高的相似性。本論文 實驗中，原本期望在 XpsG 蛋白上插入 7 個胺基酸( DHHHHHV )，在不改 變蛋白活性下，利用 Ni-NTA 對 XpsG 蛋白進行純化。因此在實驗設計上，
配合限制脢切位與胺基酸的特性，先以定點突變方式，成功拿到 L69V 和 F120V 突變株。L69V 是將第 69 個氨基酸 Leucine ( CTC)改成 valine (GTC)，
F120V 是將第 120 個氨基酸 phenylalanine ( TTC)改成 valine ( GTC)，因為 Leucine、valine、phenylalanine 屬中性氨基酸，且具有厭水性，因此定點突 變對整個蛋白的厭水性並沒有改變，所以以澱粉培養基看蛋白分泌功能 時，也確定 XpsG 正常功能不受定點突變的影響(圖一)。
插入 7 個胺基酸(DHHHHHV)後，由 L69-I7、F120-I7 互補、干擾實 驗得知，兩者皆不會回復胞外蛋白分泌的功能，也不干擾正常 XpsG 蛋白的
XC1701 小，可能是因為以澱粉培養基看蛋白分泌功能只是簡略的初步鑑 定，很容易受到菌量的多寡、培養時間長短、菌的新鮮與否等，影響澱粉 培養基暈圈的判讀。所以若要精確判定蛋白分泌是否受影響，則必須直接 以 western 方式看澱粉酵素的分泌。
L69-I7 和 F120-I7 變異株，以 XpsG western blot 發現 L69-I7 沒有重組 蛋白出現，F120-I7 則有。分析 XpsG-F120 重組蛋白發現，XpsG-F120 重組 蛋白只出現在不可溶部分（圖五）。以膠質篩濾層析法分析，發現不管是在 DOC 或 Triton 情況下，XpsG-F120 重組蛋白都出現在 retention time 15、16 分鐘，而 XpsG 則出現在 retention time 19~26 分鐘(圖六)。而 DOC 是一種 帶負電的 ionic detergent，可以有效的從細胞膜中將 integral membrane protein 萃取出來，會形成 4-6kDa 的 small micelles；Triton X-100 屬中性 detergent，
亦能將細胞膜中將 integral membrane protein 萃取出來，但會形成較 DOC 大 的 micelles。然而這兩種 detergent 皆無法將 XpsG-F120 重組蛋白解離，推 測在 detergent 存在下，XpsG-F120 重組蛋白會產生 aggregate，從結果也顯 示 XpsG-F120 重組蛋白與 XpsG 沒有交互作用。而因為第 120 位置恰好位 於 C 端區域， 因此推測 XpsG 的 C 端區域可能在組成較大結構上扮演重要 角色。
而進一步以蔗糖濃度分析 XpsG、XpsG-F120 在內外膜的分佈時，發現 XpsG 會分佈在內外膜區域，XpsG-F120 重組蛋白只存在內膜。綜合以上結 果更加確定在十字花科黑腐病菌中，XpsG 極可能會形成橫跨內外膜的纖毛 構造(圖八)。接著分析內外膜 XpsG 差異，發現內外膜的 XpsG 蛋白分子形 式幾乎是一樣的(圖十五)，這表示纖毛由內膜以同樣方式組合至外膜，而在 可溶部分看到的 XpsG 即為纖毛斷掉的部分。
以 Ni-NTA column、蛋白質硝酸銀染色觀察內外膜 XpsG 的差異時，發 現在 XC1713/pFG-His6外膜部分 26、27kDa 出現的蛋白與內膜的蛋白表現 不同。這些蛋白和 XpsG 蛋白一樣在外膜的 elution-1 出現，表示可能和 XpsG 有交互作用。但這些蛋白表現量很微弱，可能和本身所產生的蛋白量不多 有關，再加上經萃取、Ni-NTA column 分析所造成的蛋白流失，因此在蛋白
所佔比例不高的情況下，以蛋白質硝酸銀染色仍很難清楚的看到明顯的蛋 白表現。而就目前研究得知，在 P. aeruginosa 的 xcpA 基因突變株中，XcpU 會分佈在內外膜，在野生株中則 XcpU 分佈在外膜上( Bally et al., 1992)。同 時在 cross-linking 的實驗中，發現 GspG 和 GspH、I、J 皆有交互作用(Lu et al., 1997)，而 GspH、I、J 的蛋白表現也較 XpsG 少。然而就外膜蛋白而言，
在十字花科黑腐病菌中只發現 XpsD 在外膜上，而 XpsD 蛋白約 79kDa，另 外 XpsH、I、J 蛋白分子量約 18、15、22kDa，與這兩個蛋白出現位置不符。
那麼這兩個蛋白只有在外膜部分出現，是不是代表當 XpsG 形成纖毛到達外 膜時，需要其他蛋白來控制纖毛完成正常蛋白分泌功能，而這些蛋白主要 位於纖毛的頂端，或與纖毛於外膜部分有交互作用，所以才會在外膜部分 出現？而又是哪些蛋白？若以 Xps 蛋白分子量來判斷，則以 XpsK(27kDa)、
XpsN(26kDa)可能性較大，但也可能為其他非 Xps 蛋白。因此若要進一步證 實，則需要以相關實驗來觀察了。
XpsH、XpsD 會影響 XpsG 內外膜的分佈
在十字花科黑腐病菌野生株 XC1701 中，XpsG 分佈在內外膜。而 XC17433/pFG 的 XpsG 亦分佈在內外膜，由此可知要形成類似纖毛構造可 能不需要其他蛋白的參與。而 1996 年 Pugsly 也認為 PulG 蛋白在細胞膜會 形成類似葡萄串的結構，而不需要 PulO 或其他 Pul 蛋白的參與，此纖毛的 形成與 type IV pilin 生成是不同的。雖如此，但仍不能排除其他蛋白對 XpsG 分佈的影響，因為 XC17433 沒有含任何的 xps 基因，當送入質體
pCpp30-FG，使蛋白大量表達後分析其分佈，不能代表自然狀態下的 XpsG 蛋白表現。以 XpsHIJK 而言，在菌中的蛋白含量比 XpsG 少很多，但是當 其中一個基因缺損時，便造成整個第二型蛋白分泌機制不能正常運作。而 之前研究指出 GspG 與 GspH、-I、-J 皆有 interaction，既然不是影響 XpsG 纖毛的組成，那麼可能在正常情況下，其他蛋白與纖毛分解、分佈、運動 狀態(伸縮)、受質的認知結合、訊息傳遞等有關。
形式並無差異(圖十六)。利用不同基因缺損的菌株進行蔗糖濃度梯度分析，
發現 XpsG 蛋白在 XC1717(∆H)及 XC1708(∆D)中的內外膜分佈，比其他菌 株有明顯差異(圖十)。與 XC1701 相比下，XC1717、XC1708 內膜蛋白分佈 量比外膜少，而其互補株均能將 XpsG 內外膜分佈回復(圖十一、圖十二)。
對於 XC1717、XC1708 外膜 XpsG 比內膜多，推測有二個可能原因:
1. XpsH 和 XpsD 有交互作用: 由於 XpsD 位在外膜上，形成孔洞構造，
當 XpsG 纖毛逐漸形成後，可將分泌性蛋白引領至由 XpsD 組成的孔洞，蛋 白藉由此通道通過外膜分泌至胞外。然而當沒有 XpsD 形成孔洞構造時，纖 毛無法正確形成，於是便堆積在外膜，造成外膜 XpsG 蛋白比較多。而 XpsH 和 XpsG 之間有交互作用，當 XpsH 沒有表現時，外膜蛋白比較多，推測可 能是作為認知正確 XpsD 孔洞的媒介。因為膜是具有流動性的，沒有 XpsH 時，纖毛無法找到 XpsD 正確位置，便一直往外膜堆積以尋找 XpsD。就像 電扶梯，假設 XpsD 是出口，XpsH 是梯子與出口橋樑，XpsG 為電扶梯成 員，當 XpsD、XpsH 兩者缺一時，XpsG 便一直往上堆積。
2. XpsH 和 XpsD 無交互作用: XpsH 不是認知正確 XpsD 孔洞的媒介，
而是作為幫助纖毛穩固在內膜的基石。當沒有 XpsH 時，纖毛便無法很穩固 的停在內膜。
因為 XC1708 可看出 XpsG 內外膜分佈的不同，於是分別將 N 端 XpsD 蛋白(pMH7)及 C 端 XpsD 蛋白(Pcd105)看 XpsG 內外膜分佈，結 果發現兩者皆可回復 XpsG 蛋白內外膜分佈(圖十四)，是什麼原因使得 XpsG 蛋白內外膜分佈比例沒有差異，目前尚無法解釋。