利用 GeneEditor
TMin vitro site-directed mutagenesis system (Promeg 製備而成。此系統適用於具有 Ampicilin resistance 標誌的載體，產生
重組載體除了保有 Ampicilin resistance 的特性之外，還會產生一個新的
篩選標誌 resistance GeneEditorTM Antibiotic selection Mix。
本文中定點突變的 primer:
xpsG-L69V: 5’-GAACTTCCAGGTCGACACGGG-3’
xpsG-F120V: 5’-CAAACCGGTCGACCTCAACGACC-3’
步驟:
(1) Primer 5’-Phosphorylation:在 25µl 的反應體積中，加入適當的 primer (100 pmol)，kinase 10x buffer 2.5ul，T4 polynucleotide kinase 5 units，
ATP 25mM，再以無菌二次水補到最後體積 25µl。於 37℃反應 30 分鐘，馬上置入 70℃水浴 10 分鐘終止 kinase 活性，即可完成。反 應物可置入-20℃冷藏保存或直接進行 Annealing 反應。
(2) Annealing reaction:加入 ssDNA 5µl，Top select oligonucleotide 1µl，
phosphorylated mutagenic oligonucleotide (100 pmol/25µl)1µl，
annealing 10x buffer 2µl，加入無菌水到最終體積為 20µl。將反應物 置於 75℃水浴加熱 5 分鐘，之後慢慢加水降溫到室溫(20-30 分鐘)。
將反應物置於冰上，加入 synthesis 10x buffer 3.5µl，2.5mM dNTPs 6µl，T4 DNA polymerase 10 units，T4 DNA ligase 2 units，10x BSA 2µl。於 37℃反應二小時，即可完成 mutant strand synthesis 和 ligation。( Top select oligonucleotide 這條 primer 的選擇，主要是根 據 f1 origin 的方向來決定。)
(3) Transformation to BMH71-18 mutS：將已完成 annealing 的 DNA
(4) Transformation to JM109 : 以 CLONTECH Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit 抽取質體，經 1﹪agarose gel 確定有抽到質體後，取 5µl 加入 100ul JM109 competent cell 中，置於冰上 30 分鐘，再於 42℃加熱 2 分 45 秒後，馬上置於冰上 5 分鐘，再均勻塗在含 125µg/ml Ampicilin 及 100µl GeneEditorTM Antibiotic selection Mix 抗生素的培養基上，於 37℃培養 O/N。
(1)載體的製備(prepare vector) : 利用 CLONTECH Nucleospin Plus Plasmid Miniprep Kit 抽取 DH5α/pCPP30-FG 質體。以 1﹪agarose gel 檢查有沒有抽到 plasmid (pCPP30-FG)，再用限制脢 BamHI 及 HindIII 作 enzyme digestion，以 1﹪agarose gel 分離 DNA 片段，利 用 CLONTECH GEL EXTRATION Kit 將較大片段 7.5kb 的載體純化 出來。
(2) prepare insert DNA：抽定位突變成功的質體(mutant
DNA/pBluKS-)，用限制脢 Bam HI 及 Hind III 水解 DNA，以 1﹪
agarose gel 分離 DNA 片段，利用 CLONTECH GEL EXTRATION Kit 將較小片段 790bp 的 insert 萃取出來。
(3) ligation：在 10µl 的反應體積中，insert(mutant DNA)：vector (pCPP30)=1:1，加入 T4 DNA ligase 1µl，10x T4 DNA ligase buffer 1µl。16℃ O/N。
(4) transformation to JM109:將上述已經 ligation 完成的 10µl plasmid 全 部送入 50µl JM109 competent cell，均勻混合後，置於冰上 30 分鐘，
42℃加熱 2 分 45 秒(勿超過 3 分鐘)，馬上置於冰上 5 分鐘，均勻混 合後全部塗在含 Tetracyclin(15µg/ml)的 LB plate 上，37℃ O/N。
5. xpsG 插入突變基因的製備
(1)為配合限制脢的切位，將定點突變成功的質體(pCPP30-mutant DNA) 以限制脢 BamH I 及 Hind III 水解後，取其 insert 部份，與經 Bam HI 及 Hind III 水解後載體 pET32a 進行 ligation，再轉殖入 JM109 competent cell。之後再養菌抽取質體，以 Sal I 作 enzyme digestion 篩 選正確的質體 DNA。
(2)抽取大量的成功質體(pET32a-mutant)，以 sal I 作 enzyme digestion，
將 6.7kb 的載體純化出來。加入牛小腸磷酸化脢(CIP)1ul，1/10V 10Xbuffer，30℃反應 45 分鐘用以去除載體兩端磷酸根，以 1﹪
agarose gel 分離 DNA 片段，利用 CLONTECH GEL EXTRATION Kit 將載體萃取出來。
(3)將兩個 primer: sal-His(+):5’-TCGACCACCATCATCATCATG-3’、
sal-His(-): 5’-TCGACATGATGATGATGGTGG-3’各取 100ul 混合 後，於 100℃加熱 10 分鐘，自然冷卻至室溫，於 4℃保存，此片段 作為 inser，稱為 I7。將此 inser 與(2)製備的載體 ligation 後，轉殖入 JM109 competent cell 之後，再養菌抽取質體，作 DNA sequencing。
(5) 成功的 pET32a-mutant-I7 再以 BamH I 及 Hind III 插入 pCPP30 中，
構築 pCPP30-mutant-I7。
6. 接合作用 (Conjugation):
(1) 將 Helper cell(H)，E.coli DH5α(pRK2013)劃在含 Km(50µg/ml)的 LB plate 上。
(2) 劃 recipient cell (XC1701;XC1713 或其他 knockout strain mutant)於 含 Rif(100µg/ml) 的 LB plate 上。
(3) 將 donor cell(D) JM109/pCPP30-mutant 劃在含 Tetracyclin(15µg/ml) 的 LB plate 上。
(4) 準備一個 LB plate，將 Helper cell、donor cell 在 LB plate 劃一縱線 (如下圖)，再取適量的 recipient cell，橫劃過 Helper cell＆donor cell，
將此 plate 置 30℃培養 24 小時。
(5) 取箭頭右側長出的菌落，在含 Rif 及 Tetracyclin 的 LB plate 上劃成 三區，於 30℃培養 3-5 天。選在第三區長出的單一菌落，以斜線的 方式劃在同時含 Rif 及 Tetracyclin 的 LB plate 上，30℃，O/N，作 為增菌。之後再將菌點在 starch plate 上作功能測試。
H D R
7.互補實驗：
將構築好的重組質體經接合作用送入 XC1713(xpsG knockout)變 異株，增菌後，再將此菌點在澱粉培養基(starch plate)上，以 XC1701 以及 XC1713 當作陽性和陰性對照組。觀察菌落周圍透明圈的大小，
以測試各變異株澱粉酵素分泌功能正常與否，來判斷重組質體是否能 回復原有基因的功能。
8.干擾實驗：
將構築好的重組質體經接合作用送入澱粉酵素分泌正常
XC1701，增菌完後，將菌點在澱粉培養基(starch plate)，觀察菌落周 圍透明圈的大小，以測試各變異株澱粉酵素是否因送入重組質體，而 改變原本正常的分泌功能。
9.西方點墨法：(Western Blot)
(1) 配置 13.8﹪SDS-PAGE(2) sample 與 sample buffer 混合後煮沸 5 分鐘，使蛋白變性，再 loading 到 polyacrylamide gel，用 125V 進行電泳分析。
(3) 將電泳後的 gel，以 transfer buffer 進泡，於室溫溫和搖盪十分鐘，
重複 3 次。
(4) Transfer: 將 gel 緊貼於 PVDF 上，置於 mini-Trans-Blot Cell
(Bio-Rad)，100V，通電一小時。( PVDF 使用前處理：將 PVDF 以 適量甲醇中浸濕，接著再用二次水洗去甲醇，並在室溫中搖盪五 分鐘，最後將 PVDF 浸泡再 transfer buffer 至少十分鐘。)
(5) Blotting: 將 PVDF 浸泡於 50ml TBS buffer (含 3﹪skim milk)，室 溫下溫和搖晃至少三十分鐘或 4℃放置過夜。
(6) 1s t-Ab: 將 PVDF 置於塑膠袋中，加入 5ml TBS buffer (含 3﹪skim milk)，再加入 1.7µl XpsG Ab(1/3000)或 1.7µl XpsD Ab(1/3000)，將 塑膠袋密封，室溫搖晃至少一小時。
(7) wash: 以 TBS buffer 浸泡 PVDF，室溫溫和搖晃至少十分鐘，洗 4 次。
(8) 2nd –Ab: 將 PVDF 置於塑膠袋中，加入 TBS buffer (含 3﹪skim milk)，再加入 1.7µl anti-rabbit Ab(1/3000)，將塑膠袋密封，室溫搖 晃一小時。
(9) wash: 重複 step 6。
(10) 呈色：使用 SuperSignal Western blotting Kit，先將第一劑與第二 劑以 1：1 的比例加入盒中，再將 PVDF 放進盒內，室溫下均勻反 應 5 分鐘，再以 X 光片感光呈色。
10.澱粉酵素電泳分析(α-amylase western blot)
(1) 培養 2 ml 小量菌至混濁後，取 100 ul 以 12000rpm 離心 5 分鐘，留 下 pellet 部分。
(2) Pellet 以 10﹪maltose 溶液回溶，加入 XOL 中。最終體積為 3 ml 的 XOL 菌液中，含有 0.4% maltose 及適當濃度的抗生素。將菌液
於 30℃培養箱中培養，起始 OD600為 0.1~0.2，以速度 175rpm 震 盪。
(3) 培養至 OD600到 1.0~1.2 時，取 1 ml 的菌液，以 12000rpm 離心 5 分鐘。取 800 ul 上清液再離心一次，取 720 ul 上清液以 TCA 沉澱，
之後再以 43 ul sample buffer 回溶，此為胞外部分(extracellular)。原 本剩下的 pellet 部份以 1ml 二次水回溶再離心，重複 2 次，最後 pellet 以 60 ul sample buffer 回溶，此作為胞內部分(cellular)。
(4) 將胞外及胞內部分進行 western-blot，以 amylase 抗體來偵測。
11.可溶性蛋白與膜蛋白萃取液的製備：
將各個突變株的菌種，分別養在含 rifampicin 及 tetracyclin 2ml LB 的培養液中，並置入 30℃培育箱震盪，待菌液菌液呈現混濁後，換到 200ml LB 的培養液中繼續培養，直到菌液呈現混濁後為止。接著利用 高速離心 10000 rpm，10 min 將細胞收下來，再用適量的二次水將細 胞懸浮，以 12000 rpm，10 min 高速離心，將細胞外多醣類洗掉，重 複兩次，再用 lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM PMSF，0.1 mM DTT)將細胞懸浮，通過 French Press (18000-20000 lb/in，流速 1 滴/2-4 秒)3~4 次，將細胞打破後，先用以 12000 rpm，10 min 離心除去未破 細胞，接著進行超高速離心(56000 rpm，60 min)，所得到的上清液為 可溶性蛋白。沉澱物回溶在 2 ml 的 20 mM Tris-HCl pH8.0，0.5% DOC 或 2 % Triton X-100 buffer，4℃溫和搖晃至少2小時，超高速離心(30000 rpm，60 min)，並取上清液備用，為膜蛋白萃取液。
12.膠質篩濾層析法 (gel filtration chromatography)
將 Superdex HR-200 (size 25ml，可分 10-600kDa，Pharmacia)膠質 篩濾層析管柱安裝於 HPLC 上，以二倍體積(50ml)的 buffer 平衡，流 速為 0.5 ml/min。將 sample 以微量針筒取 200µl 注射到 HPLC，收集 retention time 14-38 min，每管 0.5 ml。每管取 300µl 加入四倍體積的 丙酮，在-20℃沉澱至少一個小時，高速離心(12000rpm, 15 min)，去上 層液。將沉澱物風乾，最後加入 25µl SDS-PAGE 1x sample buffer，進
行 SDS-PAGE 電泳以及西方點墨法分析。
13.蔗糖濃度梯度分析法(sucrose gradient sedimentation analysis)
(1) sample 製備:將 200ml 菌液養至 OD600 約為 1.0~1.2 時，將菌液收下
接著利用高速離心 10000 rpm，10 min 將細胞收下來，再用適量的 二次水將細胞懸浮，以 12000 rpm，10 min 高速離心將細胞外多醣 類洗掉，重複兩次，此時再用 lysis buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0，
1mM PMSF，0.1mM DTT)將細胞懸浮，通過 French Press
(18000-20000 lb/in，流速 1 滴/2-4 秒)3~4 次，將細胞打破後，以 3000 rpm，20 min 離心除去未破細胞，再以 12000rpm，1hr 離心，所取 得的沉澱物以 1 ml 的 10 mM Tris-HCl pH8.0 回溶即成。
(2) 蔗糖溶液的充填: 分別配置 61%、54%、46%、39%、32%、25%的 蔗糖溶液由下而上充填，形成梯度分層。
(3) 將 sample 充填於蔗糖梯度分層的最上層，進行超高速離心
(23000rpm,23hr)。離心完後由上而下 1ml 收集 1 管，每 1 管再個別 取 200ul 作 TCA 沉澱。
(4) TCA 沉澱: 取 200ul sample 與 TCA 充分混合後，置於 4℃，30 分 鐘以上(TCA 最終濃度為 10%)。之後離心 15 分鐘，倒掉上清液，
加入有機溶液(乙醚:酒精=1:1)混合，再離心 5 分鐘，重複兩次，主 要是為了洗去殘留的 TCA，剩下的 pellet 風乾即可。
(5) pellet 風乾，最後加入 40µl sample buffer，進行西方點墨法分析。
(6) 分析 SDH(succinate dehydrogenase)酵素活性:主要作為內膜標誌。
取 50 ul 收集液與 930 ul 反應液(50 mM Tris-HCl，pH8.0，4 mM KCN，40 mM succinate)混合，於室溫反應 5 分鐘，加入 10 ul 的 4 mM DCPIP，10 ul 的 20 mM PMS，以波長 600 測其吸光值連續 2 分鐘，
根據所得的變化值換算酵素活性。
(7) 蔗糖濃度偵測:利用糖度計測量糖濃度含量，確定糖梯度正確。
14. Ni-NTA affinity chromatography
Ni-NTA resin 先以 extraction buffer(1% triton x-100，20 mM Tris-HCl，200 mM NaCl)平衡後，再以膜蛋白萃取液與 1 ml Ni-NTA resin 混合，於 4℃搖盪 O/N。之後將混合物充填入 10 cm x 1 cm(diameter) column 中，收集流下來的液體，重新回填至 column 中，再收集流下 來的，此為 FT(flow throw)部分。加入 30ml wash buffer(1% triton x-100，20 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，25 mM Imidazole)將雜蛋白清 洗下來，收集第一管與最後一管，此為 W1、W2。加入 elution buffer(1%
triton x-100，20 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，250 mM Imidazole)，每 1ml 收集一管，共收集 4 管，此為 E1~E4。將所收集到的，每管取 500µl 加入 1ml 的丙酮，在-20℃沉澱至少一個小時，高速離心(12000rpm, 15 min)，去上層液。將沉澱物風乾，最後加入 10µl sample buffer，進行 SDS-PAGE 電泳及蛋白質硝酸銀染色。