一、重組蛋白 XpsG-F120、XpsG-L69 的構築
因為要在 xpsG 基因上插入 7 個胺基酸(DHHHHHV)，所以首先配合 限制脢切位與胺基酸的電性，設計在 xpsG 基因上的基因序列作定點突 變，將原本的基因序列改成限制脢 sal I 的切位(GTCGAC)。在本論文中 成功得到兩個定點突變的突變基因: L69V、F120V。L69V 是 XpsG 蛋白 第 69 個氨基酸 Leucine 改為 Valine，F120V 則是將第 120 個氨基酸 Phenlyalanine 改為 Valine。經核酸定序確定突變成功後(附錄 2、3)，便繼 續進行互補實驗，以確定上述定點突變是否影響原有胞外蛋白分泌功能。 對照組，結果發現 L69V、F120V 皆能使 XC1713 恢復正常胞外酵素分泌 功能(圖一)。
確定定點突變 L69V、F120V 不影響原有胞外蛋白分泌功能後，便進 行基因插入重組實驗，在 L69、F120 位置插入 7 個氨基酸序列
(DHHHHHV)，經由核酸定序確定基因重組成功後(附錄 4、5)，將重組質 體(pCPP30-L69-I7、pCPP30-F120-I7)接合到 XC1713 中，以澱粉培養基 培養，結果發現含有重組基因 L69-I7、F120-I7 的 XC1713，皆不能恢復 正常胞外酵素分泌功能。再將 pCPP30-L69-I7、pCPP30-F120-I7 接合到 XC1701，以澱粉培養基培養，XC1701、1713 分別作為陽性、陰性對照 組，觀察具有正常胞外酵素分泌功能的 XC1701 是否會受到干擾，結果 發現重組基因 L69-I7、F120-I7 不會干擾正常胞外酵素分泌功能。(圖二)
L69-I7、F120-I7 不會恢復亦不干擾正常胞外酵素分泌功能，要了解
原因首先觀察重組基因是否會產生蛋白？將含有 L69-I7、F120-I7 的 XC1713 培養於 2 ml LB broth 中，待菌混濁後，取其 total cell lysate 進行 SDS-PAGE 電泳分離，以 XpsG 抗體作 western blot，並以 XC1701、XC1713 的 total cell lysate 作陽性、陰性對照組。結果顯示，XC1713/pCPP30-L69-I7 並沒有看到 XpsG 重組蛋白的表現(圖三、A)， XC1713/pCPP30-F120-I7 則看到分子量比原來 XpsG 蛋白較大的 XpsG 重組蛋白 F120-I7(重新命名 為 XpsG-F120)(圖三、B)。由此可知 L69-I7 不會恢復亦不干擾正常胞外 酵素分泌功能，其原因是重組蛋白產生後非常不穩定，很快便被分解掉 了，所以在 total cell lysate 的 western blot 結果中看不到重組蛋白的出現；
XpsG-F120 會產生重組蛋白，但不會恢復亦不干擾正常胞外酵素分泌功 能，故接下來便想針對此重組蛋白，探討 XpsG-F120 重組蛋白與正常 XpsG 的差異。
二、XpsG-F120 重組蛋白的分析
為了更進一步確定重組蛋白對於胞外酵素分泌的影響，於是便利用 以α-amylase 為抗體的 western blot，直接看澱粉酵素的分佈。以
XC1701、XC1713 分別為陽性、陰性對照組，實驗結果顯示在含有 F120-I7 基因的 XC1701 (XC1701/pCPP30-F120-I7)，在胞外可以看到α-amylase 的分佈；而 XC1713/pCPP30-F120-I7 在胞外看不到α-amylase(圖四)。由 此更加確定 XpsG-F120 不會恢復亦不干擾正常胞外酵素分泌功能。
為比較 XpsG-F120 重組蛋白與正常 XpsG 的差異，首先觀察蛋白在 細胞分佈中分佈情況。將 XC1701/pCPP30-F120-I7、
XC1713/pCPP30-F120-I7 細胞抽取液以超高速離心區分成可溶(細胞質、
膜外漿質)與不可溶(細胞膜)部分，以 XpsG 抗體作 western blot，結果發 現在 XC1713/pCPP30-F120-I7 菌株中，可溶部分並沒有偵測到 XpsG-F120 蛋白；XC1701/pCPP30-F120-I7 的正常 XpsG 蛋白則同時分佈在可溶與不 可溶部分，但是 XpsG-F120 蛋白仍然只分佈在不可溶部分(圖五)。由此 推測 XpsG-F120 蛋白無法恢復正常胞外酵素分泌功能，可能與
XpsG-F120 蛋白沒有分布在可溶部分有關；且由 XC1701/pCPP30-F120-I7 也發現 XpsG 蛋白仍能在可溶部分出現，表示 XpsG-F120 蛋白不會干擾
XpsG 蛋白的分佈，推測兩者之間可能沒有交互作用。 Superdex HR-200 膠質篩濾層析管柱分析，緩衝平衡液分別含有 0.5%
DOC 或 1% Triton X-100，收集層析後的沖出液，以 4 倍體積的丙酮沉澱 風乾後，經 SDS-PAGE 進行電泳分離，並以 XpsG 抗體作 western blot。
結果顯示，不管以 DOC 或 Triton 為緩衝平衡液，XpsG-F120 蛋白主要都 出現在 retention time 15、16 分鐘，表示 XpsG-F120 蛋白會緊密簇集在一 起，同時在 22-26 分鐘偵測到一些小片段，這也顯示當 XpsG-F120 蛋白 大量產生時，也相對的容易被內生性蛋白酵素分解掉(圖六、A)。再以 1%
Triton X-100 為緩衝平衡液時，以 HR-200 膠質篩濾層析法分析 XC1701、
XC1701/pF120-I7 不可溶部分的膜蛋白萃取液，以 XpsG 抗體作 western blot，來比較正常與突變蛋白分子型式差異，結果顯示 XpsG-F120 蛋白 出現在 retention time 15、16 分鐘，而正常 XpsG 蛋白分佈在 retention time 18~26 分鐘。正常與突變 XpsG 蛋白同時存在時，發現 XpsG-F120 和 XpsG 蛋白的主要分佈並沒有交集(圖六、B)。故由此實驗證明 XpsG-F120 和 XpsG 蛋白之間沒有交互作用，而且 XpsG-F120 蛋白的分子形式和 XpsG 蛋白是不同的。
十字花科黑腐病菌屬於革蘭氏陰性菌，具有兩層膜構造。為了分析 XpsG 蛋白與 XpsG-F120 蛋白在內外膜的分佈，於是利用蔗糖濃度梯度 以超高速離心 23 小時(23000 rpm，4℃)，將內外膜部分分離，由蔗糖低 濃度至高濃度，以 1 ml 收集一管，以終濃度 10% TCA 沉澱後風乾，進 行 SDS-PAGE 電泳分離，並以 XpsG 抗體作 western blot，同時以 OmpA 蛋白、SDH 酵素活性作外膜與內膜的標誌，蔗糖密度作為梯度分層正確 的指標。由實驗結果顯示，XpsG 蛋白主要分佈在 11-17 管及 23-28 管兩 區域，而 XpsG-F120 蛋白分佈在 13-18 管，再經由 OmpA 蛋白、SDH 酵 素活性比對下，得知 XpsG 蛋白分佈在內外膜，XpsG-F120 蛋白只分佈
在內膜(圖七)。
綜合以上結果，因為 XpsG-F120 蛋白並沒有恢復正常胞外蛋白分泌 的功能，在可溶部分(細胞質、膜外漿質)並沒有出現，而且只分佈在內膜；
相對的，具有正常生理狀態下，XpsG 具有胞外蛋白分泌功能，同時分佈 在可溶部分(細胞質、膜外漿質)及不可溶部分(細胞膜) ，且以蔗糖濃度 梯度分析也發現 XpsG 是分佈在內外膜的，因此推測 XpsG 會在十字花科 黑腐病菌中形成一個橫跨內外膜的纖毛構造(圖八)。
三、以蔗糖濃度梯度探討各 xps 基因對 XpsG 蛋白內外膜分佈的影響
以蔗糖濃度梯度發現十字花科黑腐病菌野生菌 XC1701 的 XpsG 蛋 白會分佈在內外膜，為探討哪一個 Xps 蛋白會影響 XpsG 蛋白內外膜的 分佈，故利用蔗糖濃度梯度分析各個 xps 基因缺損菌株的 XpsG 蛋白分 布，以 1 ml 收集一管，以終濃度 10% TCA 沉澱後風乾，進行 SDS-PAGE 電泳分離，並以 XpsG 抗體作 western blot。由結果發現，在 XC1717(∆H)、XC1708(∆D)的 XpsG 蛋白分布上，內膜 XpsG 蛋白表現比外膜表現量較 少，兩者的差異較大。為了更清楚各個 xps 基因缺損菌株 XpsG 蛋白在內 外膜分布量的差異，便利用數位影像將內外膜 XpsG 蛋白分佈作定量分 析，以百分比為單位，內膜與外膜的蛋白總合為百分之百，將內膜所佔 的百分比與外膜作比較，再以 XC1701 的內外膜分佈百分比為基準，觀 察各個 xps 基因缺損菌株，結果發現 XC1717(∆H)、XC1708(∆D)的 XpsG 蛋白分佈差異最為明顯(圖九、B)。
為了確定 XC1717(∆H)、XC1708(∆D)的 XpsG 蛋白分佈差異，便重 複作 XC1717(∆H)、XC1708(∆D) 蔗糖濃度梯度分析，各取三次實驗的定 量數值，以 ORIGIN 分析軟體計算標準差後與 XC1701 作比較(圖十)。由 圖顯示 XC1701、XC1717、XC1708 的 XpsG 蛋白內外膜分佈量在統計學 上是有意義的。在本實驗中，顯示 xpsH 或 xpsD 基因缺損時，XpsG 蛋白 主要會傾向分佈在外膜區域。
因為 XC1717 的 XpsG 蛋白主要會傾向分佈在外膜區域，於是想探討 XC1717/pFH 能否回復 XpsG 蛋白的分佈比例？便利用蔗糖濃度梯度分析 XC1717/pFH，以 XpsG 抗體作 western blot 觀察 XpsG 蛋白的分佈，同時
作定量分析(圖十一)。比較 XC1701、XC1717、XC1717/pFH，發現 XC1717/pFH 能回復 XC1717 在 XpsG 蛋白的分佈差異。同樣的方式，比 較 XC1701、XC1708、pKC118 的 XpsG 蛋白的分佈，結果與 XC1717 相 似(圖十二)。
XpsD 蛋白是外膜蛋白，會由 10-12 個蛋白組成大分子複合體，形成 類似孔洞的構造。對於位在外膜的 D 蛋白研究認為其 C 端會插入膜中，
而 N 端會暴露在胞外漿質(Koebnik et al., 2000)。既然 pKC118 經蔗糖濃 度分析，發現能回復 XC1708 的 XpsG 蛋白分佈比例，接著便想探討是 XpsD 蛋白的 C 端或是 N 端區域改變 XpsG 蛋白分佈的？首先分別將 C 端(pCD105)、N 端基因(pMH7)接合入 XC1708，取其 total cell lysate 作 western blot，XC1701、XC1708、XC1713 作控制組，以 XpsD-C、XpsD-N、
XpsG 抗體偵測。pCD105 的 XpsD 約 39kDa，pMH7 表現的 XpsD 蛋白約 43kDa，由結果確定菌種沒有問題(圖十三)。
以 pCD105、pMH7 進行蔗糖濃度梯度分析並定量，結果發現 XpsD-C 與 XpsD-N 皆能明顯回復 XC1708 的 XpsG 蛋白分佈比例(圖十四)。
四、以膠質篩濾層析法比較內膜與外膜 XpsG 蛋白差異
將 XC1701 經蔗糖濃度梯度區分的內外膜部分經 Triton 萃取後，以 膠質篩濾層析法分析，並以 XpsG 抗體作 western blot，發現內膜部分的 XpsG 蛋白出現在 24、25 分鐘，外膜部分出現在 23-25 分鐘的位置，兩 者蛋白分子型式無明顯差異(圖十五、A)。
為了探討在內外膜的 XpsG 蛋白與其他蛋白交互作用關係，便利用 C 端含有 His 氨基酸序列的 xpsG 基因接合入 XC1713( XC1713/pFG(His6))，
會產生 His-tagged XpsG 蛋白。以蔗糖濃度梯度區分 XpsG 內外膜部分，
再經超高速離心以獲得內外膜，Triton X-100 萃取後，其內外膜蛋白萃取 液分別通過 Ni-NTA column，收集 Flow throw、wash、elution 部分，各 取 500 µl 以丙酮沉澱風乾。同時以 XC1713/pFG 作為控制組。將 Flow throw、wash、elution 部分，利用 SDS-PAGE 電泳分離後，以蛋白硝酸銀 染色，發現 His-tagged XpsG 會出現在 elution 部分，不含 His-tagged 的 XpsG 蛋白幾乎都留在 Flow throw、wash 部分。而比較內外膜的差異，
結果發現在 XC1713/pFG(His6)外膜部分，於 elution-1 中 26、27kD 處有 微弱的蛋白出現(星號所標之處)，而在內膜部分及 XC1713/pFG 並沒有，
推測這些蛋白和 XpsG 之間有交互作用。
五、xps 基因缺陷的菌株並不會影響蛋白分子形式
由蔗糖濃度梯度分析各個 xps 基因缺陷的菌株的結果，發現
XC1717、XC1708 內外膜的 XpsG 蛋白分佈與 XC1701 不同，接著便想 探討各個 xps 基因缺陷的菌株其 XpsG 蛋白分子型式是否有不同？將 XC1701、XC1717( ∆xpsH)、XC1718( ∆xpsJ)、XC1721( ∆xpsK)、
XC1714( ∆xpsM)、XC1708( ∆xpsD)的膜蛋白萃取液，通過 Superdex HR-200 膠質篩濾層析管柱分析， 以 1% Triton X-100 為緩衝平衡液，收 集層析後的沖出液，以 4 倍體積的丙酮沉澱抽乾後，以 SDS-PAGE 進行 電泳分離，並以 XpsG 抗體作 western blot。結果顯示在這些 xps 基因缺 陷菌株的 XpsG 蛋白主要皆分佈在 19-26 分鐘 (圖十六、A)。再以含有 0.5% DOC 為緩衝平衡液，將 XC1701、XC1716 膜蛋白萃取液，以膠質 篩濾層析法分析，發現皆出現在 30、31 分鐘(圖十六、B)。由此實驗得 知 XpsG 蛋白分子型式並不因這些 xps 基因缺陷而有所改變。