一、克雷伯氏肺炎桿菌 (Klebsiella pneumoniae)
克雷伯氏肺炎桿菌屬於格蘭氏陰性桿菌、腸桿菌科。其特色為帶有 大量多醣類交錯而成的莢膜層，故在電子顯微鏡的視野下可以看見豐 富的莢膜層包覆於菌體外，且於瓊指平板上培養時可以觀察到光滑且 具黏性的菌落型成。克雷伯氏肺炎桿菌為人體腸道的正常菌叢之一，同 時存在於呼吸道及表皮上，為伺機性的病原菌。除此之外也能在植物、
土壤和水中發現克雷伯氏肺炎桿菌的存在。克雷伯氏肺炎桿菌不僅可 以造成院內感染，甚至可以造成社區感染，例如肺炎、化膿性肝膿瘍、
尿道感染等疾病 (Lederman and Crum, 2005; Podschun and Ullmann, 1998; Siu et al., 2012) 。近年來在台灣更發現克雷伯氏肺炎桿菌所造成 的原發性化膿性肝膿瘍有逐年增加的趨勢 (Pope et al., 2011) 。
為了治療克雷伯氏肺炎桿菌的感染，臨床上常使用第三代頭孢菌 素 (third-generation cephalosporin) 做為治療 (Rapp and Urban, 2012) ， 然而 TEM、SHV 和 CTX-M 等廣效性乙內醯胺酶 (extended-Spectrum β-Lactamases, ESBL) 能分解第三代頭孢菌素，因此使得第三代頭孢菌 素對帶有廣效性乙內醯胺酶的克雷伯氏肺炎桿菌失去效用。近年來的 研究也發現台灣 75 % 的克雷伯氏肺炎桿菌均為帶有廣效性乙內醯胺
酶的菌株 (Mendes et al., 2013) ，迫使我們必須使用後一線抗生素來治 新德里金屬β-內醯胺酶 (New Delhi metallo-β-lactamase, NDM-1) 和雷 伯氏肺炎桿菌碳青黴烯分解酶 (K. pneumoniae carbapenemase, KPC) 等 酵素分解碳青黴烯類藥物，而產生抗碳青黴烯克雷伯氏肺炎桿菌 (carbapenem-resistant K. pneumoniae, CRKP) 。同時也有研究指出帶有 廣效性乙內醯胺酶的雷伯氏肺炎桿菌加上細菌孔蛋白 (porin) 的缺陷，
也 能 導 致 克 雷 伯 氏 肺 炎 桿 菌 對 碳 青 黴 烯 類 藥 物 產 生 抗 藥 性 (Tzouvelekis et al., 2012; Webster et al., 2010; Yang et al., 2009) ，而當克 雷伯氏肺炎桿菌對碳青黴烯類藥物產生抗藥性之後臨床上通常僅剩最
faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa 和 Enterobacter species) 菌株的其
中一員 (Santajit and Indrawattana, 2016) ，因此研究最後一線抗生素的 抗藥性產生機制顯得更為重要。二、克痢黴素
克痢黴素也稱為多粘菌素 E (polymyxin E) ，為多粘菌素之一。早 在 1947 時，於多粘芽孢桿菌 (Bacillus polymyxa var. colistinus) 中就已 經被發現，為非核醣體合成之抗生素。克痢黴素在 1950 年後被廣泛的 使用，而由於克痢黴素會產生神經毒性以及腎毒性，1980 年後逐漸停 用 (Biswas et al., 2012) 。近年來，為了治療多重抗藥性革蘭性陰性菌 (multidrug-resistant Gram-negative bacteria) 的感染，克痢黴素成為僅存 的最後一線藥物之一，因此克痢黴素的抗藥機制也受到世界的關注。
克痢黴素包含帶有正電的胜肽鏈和脂肪酸鏈，胜肽鏈形成環狀的 結構與脂肪酸鏈以醯胺鍵 (-amide linkage) 的方式連結。克痢黴素的 分子量為 1750 Da。由於脂肪酸可能為 6-甲基辛酸 (6-methyloctanoic acid) 或者是 6-甲基庚酸 (6-methyleptanoic acid) 而分成硫酸粘菌素 (colistin sulfate) 和黏菌素甲磺酸鈉 (colistimethate sodium) 兩種結構，
而兩者皆於臨床上被使用 (Biswas et al., 2012; Li et al., 2005) 。
帶有正電的克痢黴素會和帶有負電的脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS) 進行交互作用。克痢黴素會取代細胞外膜上的鎂離子和鈣離子與 脂多醣形成穩定的結合。而克痢黴素的累積使得細菌的外膜受到干擾，
整個過程造成細胞膜的通透性的改變，最終使細胞膜破損最終導致細 菌死亡 (Hancock, 1997) 。
然而伴隨克痢黴素的使用，抗克痢黴素的克雷伯氏肺炎桿菌也逐 年增加。國外近年來的研究已顯示抗碳青黴烯克雷伯氏肺炎桿菌同時 具有克痢黴素抗藥性的比例約為 43 % (Monaco et al., 2014) 。而根據 2013 年的研究，台灣的抗碳青黴烯克雷伯氏肺炎桿菌約有 17 % 對克 痢黴素具有抗藥性 (Chiu et al., 2013) 。因此也凸顯研究克雷伯氏肺炎 桿菌對克痢黴素產生抗藥性機制的重要性。
三、克痢黴素的抗藥性
在克痢黴素的使用之下，抗克痢黴素的克雷伯氏肺炎桿菌逐漸產生。
研究指出，細菌可以藉由改變脂多醣的負電性使其對克痢黴素的親和 性下降，在部分菌種甚至演化出沒有脂多醣的突變株藉以逃避克痢黴 素的結合 (Beceiro et al., 2014; Garcia-Quintanilla et al., 2014) 。也有研 究指出，部分輸出幫浦 (efflux pumps) 可以增加克痢黴素的耐受性，例 如 acrAB (Padilla et al., 2010) 。儘管如此，在臨床上尚未發現因大量表
現輸出幫浦而產生克痢黴素抗藥性的臨床案例。
脂多醣主要藉由 4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖 (4-amino-4-deoxy-L-arabinose, Ara4N) 和磷酸乙醇胺 (phosphoethanolamine, PEtN) 兩種修 飾來中和脂多醣上的負電荷 (Breazeale et al., 2005; Chen et al., 2011;
Gunn et al., 2000; Tran et al., 2005; Yan et al., 2007) 。而這兩種修飾分別 是藉由基因 pmrHFIJKLM 操縱子 (operon) 和 pmrC 所達成 (Gunn et
al., 2000; Olaitan et al., 2014) 。先前研究指出 pmrHFIJKLM 操縱子被
兩套雙分子訊息調控系統 (two-components system) PmrAB 和 PhoPQ 所正向調控 (McPhee et al., 2006) ，其中 PmrAB 更能同時調控 pmrC 的表現。而 PhoPQ 還有一個負向調控子 mgrB。MgrB 為膜上的短胜肽 鏈，在許多菌株中都發現有相似的基因存在，僅由 47 個胺基酸所組成，已知可以抑制 PhoQ 的自磷酸化，若 mgrB 被破壞或產生突變則無法抑 制 PhoQ 的磷酸化，使其磷酸根傳遞至 PhoP 而使下游 pmrHFIJKLM 操 縱子大量表現，進而產生對克痢黴素的抗藥性 (Cannatelli et al., 2013;
Cannatelli et al., 2014; Gaibani et al., 2014) 。不僅是 mgrB，其下游 pmrAB 和 phoPQ 的胺基酸改變也可能增加脂多醣的修飾，進而導致克痢黴素 抗藥性的產生 (Jayol et al., 2014; Miller et al., 2011) 。
四、研究目的
為了了解克痢黴素的抗藥性機制，本研究共收集 26 株抗克痢黴素 之克雷伯氏肺炎桿菌，首先分析其莢膜型以及序列型，了解其在流行病 學上的分佈。同時檢驗這些菌株是否有脂多醣修飾相關調控基因 (mgrB、pmrA、pmrB、pmrD、phoP、phoQ、crrA 和 crrB) 的突變，而 導致脂多醣的修飾增加，使得菌株產生克痢黴素的抗藥性。並進一步了 解調控子突變對下游基因的影響和調控，以及最終產生克痢黴素抗藥 性的機制。