實驗材料與方法

一、菌株及培養條件

為研究抗克痢黴素之抗藥機制，我們與台北榮民總醫院林邑璁醫 師合作，從 2013 年二月至八月共收集 26 株抗克痢黴素克雷伯氏肺炎 桿菌臨床菌株 (表一)。26 株抗藥性菌株均來自於不同病房及病患，其 中菌株 Col13 和 Col14 同時為碳青黴烯抗藥性菌株，且菌株 Col14 帶 有雷伯氏肺炎桿菌碳青黴烯分解酶。在 26 個病人中，16 個病人曾經在 台北榮民總醫院中進行過克痢黴素的治療，其餘則無法追蹤其用藥歷 史。為了與抗藥性菌株進行基因序列和表現量比較，我們隨機挑選 8 株 克痢黴素感受性菌株作為對照。並且使用大腸桿菌 (Escherichia coli) ATCC 25922 菌株做為抗生素感受性測試之品質管制組。大腸桿菌 DH10B 菌株則做為勝任細胞 (competent cell) 以方便進行去氧核醣核 酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 的剪輯和保存。所有菌株皆使用溶菌 培養基 (Lysogeny broth, LB) 置於 37°C 培養箱中培養，且於固態培養 基中添加 1.5% 瓊脂 (agar) 。若進行菌株篩選則再分別於培養基中添 加 100 g/ml 氨苄青黴素 (ampicillin) 、50 g/ml 康黴素 (kanamycin) 或 100 g/ml 氯黴素 (chloramphenicol) 。

二、抗生素感受性測試

依據臨床與實驗室標準研究所 (Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI) 所發表的準則，我們使用瓊脂稀釋法 (agar dilution) 的 方式分別稀釋克痢黴素或其他待測抗生素，並將其加入米勒-欣頓瓊脂 培養基 (Müller-Hinton agar) 中。將待測菌株以生理食鹽水沖洗過後，

把含有 10⁴菌落的點在含有抗生素的瓊脂培養基上。並於隔夜培養後判 讀該抗生素之最小抑制濃度 (minimum inhibitory concentrations, MICs) 之實驗結果，每次實驗皆使用大腸桿菌 ATCC 25922 菌株做為品質管制 組，以確認該次實驗步驟正確。

三、辨別莢膜型和序列分型

為了辨別臨床菌株之莢膜型，我們根據實驗室先前的研究，利用聚 合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 的方式增幅菌株的莢膜 合成必須基因 wzc 的序列，定序反應產物後將其比對已發表的 80 種莢 膜型 wzc 序列，以此決定出臨床菌株之莢膜型 (Pan et al., 2013; Pan et

al., 2015)。

而辨認序列分型方面，我們根據法國巴斯德研究所提供的引子序 列，分別增幅菌株的八個生長所需基因 (rpoB、

gapA

、

mdh

、

pgi 、phoE 、

infB 和 tonB) (Brisse et al., 2009; Diancourt et al., 2005) ，同樣分別定序

反 應 產 物 後 將 其 比 對 巴 斯 德 研 究 所 提 供 之 資 料 庫 (http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/) ，決定其菌株之序列分型。

四、偵測基因表現量

為了比較不同菌株間 pmrH、pmrK、pmrA、pmrC、phoP、mgrB、

H239_3059、H239_3062、H239_3063、H239_3064 和 H239_3065 的基

因表現量，我們將臨床菌株及突變株培養至生長指數期後，約取 310⁸ 的菌落並利用 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 分別萃取其核醣核酸 (RNA) ， 再取其中 400 ng 的核醣核酸並使用 SuperScript II Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) 進 行 互 補 去 氧 核 醣 核 酸 (complementary deoxyribonucleic acid, cDNA) 的合成。個別基因之互補脫氧核醣核酸再 利用 Power SYBR® Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 和 ABI 7900 Real-Time PCR (Applied Biosystems) 進行定量逆轉錄聚合酶連鎖 反應 (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR) ，並利用 23S rRNA 的表現量做為內部控制組 (internal control) ， 其中聚合酶連鎖反應所需之引子皆列在表 2 中。基因的相對表現量則 是利用Ct 的估計所計算，並使用 23S rRNA 的表現量進行標準化。

五、序列分析

為了分析 MgrB、PhoP、PhoQ、PmrD、PmrA、PmrB、CrrA 和 CrrB 等基因是否有胺基酸變異導致菌株產生克痢黴素抗藥性。我們利用聚 合酶連鎖反應的方式分別放大這些基因片段，聚合酶連鎖反應所需的 引子皆列於表二。反應產物經過定序後，分別將其轉譯成胺基酸序列並 和克痢黴素感受性菌株進行序列比較。26 株抗藥性菌株之 MgrB、PhoP、

PhoQ、PmrD、PmrA 和 PmrB 皆與 8 株感受性菌株進行比對，以剔除 胺基酸的多型性，並將可能造成抗藥性產生的胺基酸位置列出。

而經過實驗驗證 MgrB、PhoP、PhoQ 和 PmrB 的部分胺基酸突變 能導致抗藥性過後，仍有 9 株抗藥性菌株不清楚抗藥性產生的機制，

因此進一步定序菌株 Col4、Col5、Col7、Col20、Col21、Col22、Col28、

Col36 和 Col44 之 CrrA、CrrB 序列，其中 Col5 並無法利用聚合酶連鎖 反應增幅 crrAB 之片段。而 8 株感受性菌株中也僅有 4 株 (A4528、ref.

64、N4252 和 N5906) 可以利用聚合酶連鎖反應增幅 crrAB 之片段，因 此將 8 株抗藥性菌株之 crrA、crrB 序列與 4 株感受性菌株進行比對。

由於只有比對 4 株感受性菌株之序列略顯不足，因此同時於與基因庫 (Genebank) 上帶有 crrAB 序列之 46 株克痢黴素感受性菌株做比較 (表 三) ，將可能造成抗藥性產生的胺基酸位置列出。

六、南方墨點法 (Southern blotting)

由於無法用聚合酶連鎖反應的方式增幅 Col13 和 Col14 菌株的

mgrB 序列，為了確認菌株中的 mgrB 是否不存在菌株 Col13 和 Col14

的基因體中，我們分別萃取 NTUH-K2044、Col13 和 Col14 菌株之去氧 核醣核酸，並利用限制酶 HpaI 處理過後進行電泳分離不同大小之去氧 核醣核酸片段。再將瓊脂糖凝膠 (agarose gel) 轉漬至 Hybond-N+

(Amersham) 上。而轉漬膜分別與專一序列之長葉毛地黃配質標記的去 氧核醣核酸探針 (digoxigenin-labeled DNA probe) 進行雜交反應，長葉 毛地黃配質標記的去氧核醣核酸探針則由聚合酶連鎖反應的方式所合 成，反應所需的引子皆列於表二。雜交後的長葉毛地黃配質標記的去氧 核 醣 核 酸 探 針 再 與 抗 長 葉 毛 地 黃 配 質 鹼 性 磷 酸 酶 抗 體 (anti-digoxigenin-alkaline phosphatase antibody) (Roche) 作用，並利用 CDP-Star 化學發光試劑 (chemiluminescence reagent) 進行呈色反應。

同樣為了偵測克痢黴素抗藥性菌株 Col5 和 4 株無法利用聚合酶連 鎖反應增幅 crrAB 的克痢黴素感受性菌株是否帶有 crrAB，我們同樣萃 取其基因體去氧核醣核酸並利用限制酶 PstI 進行處理。專一性之 crrA 和 crrB 長葉毛地黃配質標記去氧核醣核酸探針探針同樣使用聚合酶連 鎖反應的方式合成，其餘步驟皆與 mgrB 相同。

七、定點突變 (Site-directed mutagenesis)

為了驗證在 mgrB、phoP、phoQ 和 pmrB 所找到胺基酸改變的位置 是否真的能造成克痢黴素抗藥性的產生。我們利用融合聚合酶連鎖反 應 (fusion PCR) 的方式製造單一點突變位點的聚合酶連鎖反應產物，

並將帶有帶有點突變的去氧核醣核酸片段選殖進入經過限制酶 NotI 處 理並補平的 pKO3-km 質體中 (Link et al., 1997)。而後將帶有不同點突 變片段的 pKO3-km 質體以電穿孔 (electroporation) 的方式送入克痢黴 素感受性菌株 NTUH-K2044 當中，並將其培養在 30°C 培養箱中使 pKO3-km 質體在菌體中進行複製，同時使用康黴素進行篩選。之後將 帶有質體之 NTUH-K2044 菌株轉移至 43°C 環境中進行培養，由於 pKO3-km 質體無法在高溫時進行複製，因此促使質體利用同源置換 (homologous recombination) 的方式嵌入基因體中。最後再將確認有 pKO3-km 質體嵌入基因體之菌株培養在含有 5%蔗糖 (sucrose) 的瓊脂

同樣利用融合聚合酶連鎖反應的方式創造帶有特定點突變的去氧核醣 核酸片段並將其選殖進入 pKO3-km 當中，得到的質體同樣以電穿孔的 方式送入感受性菌株 A4528 當中。後續的步驟則與於 NTUH-K2044 菌 株相同，最後同樣以定序的方式確認是否得到正確點突變的 A4528 突 變株。

八、剔除株的建立

為了建立 pmrAB、H239_3059、H239_3062、H239_3063、H239_3064 和 H239_3065 的剔除株。我們分別利用不同引子 (表二) 將 A4528

crrB(N141I)菌株的 pmrAB、H239_3059、H239_3062、H239_3063、

H239_3064 和 H239_3065 及其鄰近區域 (flanking region) 利用聚合酶

連鎖反應增幅。並將反應所得到的產物選殖進入 CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific) 當中。再分別利用不同引子 (表二) 進行 反向聚合酶連鎖反應 (inverse PCR) 分別將 pmrAB、H239_3059、

H239_3062、 H239_3063、 H239_3064 和 H239_3065 的基因編碼區

(coding region) 剔除。剔除後的基因片段利用聚合酶連鎖反應增幅後再 將其選殖進入經過 NotI 處理並補平的 pKO3-km 質體之中。所得到的 pKO3-km 質體同樣利用電穿孔法送入 A4528 crrB(N141I)菌株，後續步 驟則與建立點突變菌株相同。最後利用聚合酶連鎖反應確認是否得到

pmrAB、H239_3059、H239_3062、H239_3063、H239_3064 和 H239_3065

的突變株。

九、建立跳躍子突變株庫 (transposon mutants library)

為 了 建 立 A4528 crrB(N141I)菌株之跳躍子突變株庫，我們將 A4528 crrB(N141I)菌株與帶有 pUT-km1 質體之大腸桿菌 S17-1 隔夜培 養之後各取 10⁸ CFU 於 1ml 之 10mM MgSO4中，並將此混合液滴至 0.22 m 的薄膜上。將薄膜置於培養基上培養 4 個小時，再以 3ml 之 10mM MgSO4 將菌落沖下，將沖洗液塗於含有康黴素之基本培養基 (minimal media agar) 中，並置於 37°C 培養箱中培養。隔天長出的菌落 即為帶有跳躍子之 A4528 crrB(N141I)突變株。

十、半隨機聚合酶連鎖反應 (semi-random polymerase chain reaction) 為了知道跳躍子所插入基因體的位置，我們先利用跳躍子上的序 列設計引子 (long-F 或 long-R) 搭配隨機序列引子 (CEKG2C) 對突變 株進行第一次聚合酶連鎖反應。將得到的反應產物稀釋 100 倍後作為 模板 (template) ，配合跳躍子上的引子 (4647F 或 2921R) 及隨機序列 引子 CEKG2C 之確定序列 (CEKG4)，再進行第二次聚合酶連鎖反應 (Salama et al., 2004) ，所需的引子序列皆列於表二。而第二次聚合酶連

鎖反應所得到的產物再進行定序分析，即可得知跳躍子插入基因體的 位置。

在文檔中 台灣克雷伯氏肺炎桿菌抗克痢黴素機制之研究 (頁 18-27)