一、多重抗藥型菌株之莢膜型
以莢膜型分類我們所收集的 26 株抗克痢黴素抗藥性菌株，其中 K64 為主要的莢膜型，其次為 K24 和 K54 (表一) 。然而根據先前的研 究指出，在台灣抗碳青黴烯克雷伯氏肺炎桿菌的主要莢膜型為 K64，而 其次為 K62 和 K24 (Pan et al., 2015) 。由此資料顯示 K64 莢膜型的克 雷伯氏肺炎桿菌可能較容易產生抗藥性，而 K62 莢膜型儘管為抗碳青 黴烯克雷伯氏肺炎桿菌主要莢膜型，但在 26 株克痢黴素抗藥性菌株中，
僅有 1 株為莢膜型 K62，顯示不同的莢膜型菌株可能有較容易產生特 定的抗藥性的趨勢。
若特定莢膜型菌株較容易產生抗藥性，未來我們也可以選擇抗生 素以外的方式來治療多重抗藥性克雷伯氏肺炎桿菌的感染。以莢膜型 K64 菌株為例，我們可以從對莢膜型 K64 菌株具專一性的噬菌體中找 到專一胞外多醣解聚合酶 (extracellular polysaccharide depolymerase) 。 若使用此解聚合酶分解莢膜型 K64 菌株，則使菌株較容易被嗜中性球 所吞噬。若於動物實驗中使用胞外多醣解聚合酶進行克雷伯氏肺炎桿 菌感染的治療，更能增加小鼠的存活率 (Pan et al., 2015) 。
二、脂多醣修飾的比較
為了知道哪些菌株是藉由增加脂多醣的修飾產生抗藥性，我們比 較 pmrH 和 pmrC 的基因表現量。儘管大部份抗藥性菌株的 pmrH 表現 量相較於克痢黴素感受性菌株都有顯著的上升，但仍有 3 株抗藥性菌 株沒有顯著的上升，而其中兩株最後也被證明是藉由 mgrB 的改變導致 下游 pmrHFIJKLM 操縱子大量表現所產生的抗藥性 (表一) 。因此也 說明比較 pmrH 的相對基因表現量並不能完全代表最後脂多醣修飾的 多寡。若要用 pmrH 的基因表現量比較脂多醣的修飾，必需比較產生抗 藥性前的原始菌株 (parental strains) 和產生抗藥性後的菌株之基因表 現量，或者更進一步使用質譜儀 (mass spectrometry) 的分析才能反應 出臨床菌株中脂多醣修飾的真實情況。
三、PhoPQ 利用 PmrD 調控 pmrAB
研 究 顯 示 ， mgrB 的 變 異 無 論 在 國 內 外 均 為 主 要 的 抗 藥 機 制 (Cannatelli et al., 2013; Cannatelli et al., 2014) 。由於 MgrB 的改變導致 MgrB 無法抑制 PhoQ 的磷酸化，以及我們也發現 PhoQ L26P 的改變也 會使得下游 pmrHFIJKLM 操縱子大量表現，讓菌株產生抗藥性。然而 根據先前的研究指出，MgrB 會影響 PhoPQ 的活化，而 PhoPQ 的訊號 可以經由 PmrD 傳遞至 PmrAB (Cheng et al., 2010) 。但在我們的研究
結果中顯示，相較於克痢黴素感受性菌株，僅 PmrB 和 CrrB 有突變的 抗藥性菌株有顯著 pmrC 的表現量上升 (pmrC 受到 pmrAB 所調控) (表 一) (圖一) ，即顯示儘管 PmrD 可以連接 PhoPQ 和 PmrAB 兩套雙分子 訊息調控系統，但 MgrB 和 PhoPQ 的突變在真實的情況下可能無法使
pmrC 基因表現量顯著的上升。
四、crrAB 及其鄰近序列的分析
在我們所收集的抗藥性菌株中，CrrB 的突變為台灣次要的克痢黴 素抗藥性產生原因，然而僅有半數的感受性菌株在基因中帶有 crrAB 的 序列，比對 NCBI 資料庫中克雷伯氏肺炎桿菌的序列也顯示，crrAB 及 其鄰近基因常常被噬菌體或跳躍子所破壞或取代，因此代表 crrAB 和 鄰近 crrC、H239_3063、H239_3064 和 H239_3065 並不是生長所必需 的基因，所以經過演化後逐漸從基因體中被剔除。
而以 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) (Letunic et al., 2015;
Schultz et al., 1998) 分析本研究中所偵測到的 6 個可以導致克痢黴素抗 藥性產生的 CrrB 突變位置，電腦模擬蛋白質結構後發現，其中 4 個胺 基酸位置 (第 140、141、151 和 195 個胺基酸) 都位於 CrrB 的組氨酸 激 酶 區 (histidine kinase domain) ， 而第 31 個 胺 基 酸位 於 穿 膜區 (transmembrane domain) ，以及第 10 個胺基酸無法歸類於任何區域之
中，這些結果發現組氨酸激酶區對抗藥性的產生扮演了重要的角色。然 而 CrrAB 已知可以調控 H239_3059 和 crrC，儘管先前研究推測
H239_3059 可 能 和 克 痢 黴 素 抗 藥 性 相 關 ， 但 經 過 實 驗 證 實 剔 除 H239_3059 不影響 CrrB 突變所導致的克痢黴素抗藥性。因此大量表現 H239_3059 是否能造成細菌的其他改變及其生理意義並不清楚。然而
CrrAB 儘管可以藉由 CrrC 調控 pmrAB，但 CrrAB 是否直接調控 CrrC 的啟動子或者 CrrC 是否能直接調控 pmrAB 的啟動子，都還需要更進 一步實驗驗證。後續我們也發現 H239_3063、H239_3064 和 H239_3065 會受到 CrrAB 所 調 控 ， 而 CrrB 的 突 變 使 得 H239_3063 、 H239_3064 和
H239_3065 大量表現。而這三個基因經過比對分別可能是 ABC 轉運蛋
白 (ABC transporter) 、RND 排出幫浦 (RND efflux pump) 和乙醯轉移 酶 (acetyltransferase) ，其中 H239_3063 和 H239_3064 證實和克痢黴素 的抗藥性相關。由於 H239_3063 和 H239_3064 為可能的運輸蛋白，因 此也顯示 H239_3063 和 H239_3064 即有可能和其他抗生素的抗藥性相 關 。 然 而 H239_3065 的 大 量 表 現 是 否 可 以 增 加 胞 外 多 醣 (exopolysaccharide) 的修飾或有其他生理意義則需要更進一步研究來 證實。五、H239_3063 和 H239_3064 增加四環黴素類抗生素耐受性
為了了解 H239_3063 和 H239_3064 是否會影響克痢黴素之外的抗 生素的抗藥性，我們測試 A4528 野生型菌株和其 CrrB 突變株以及
H239_3063 和 H239_3064 的 剔 除 菌 株 對 氯 霉 素 、 環 丙 沙 星
(ciprofloxacin) 、四環黴素 (tetracycline) 和頭孢黴素 (cefotaxime) 的 最小抑制濃度。結果顯示，H239_3063 和 H239_3064 的剔除對氯霉素、環丙沙星和頭孢黴素的感受性並無差異。而相較於 A4528 野生型菌株，
CrrB 的突變能造成對四環黴素抗藥性上升兩倍，剔除 H239_3064 後則 使得 CrrB 突變造成對四環黴素的抗藥性下降，然而剔除 H239_3063 則 不會改變對四環黴素的感受性。老虎黴素同樣為四環黴素類的抗生素，
因此我們也測試了 A4528 野生型及其突變菌株對老虎酶素的感受性，
結果顯示 CrrB 的突變使得菌株對老虎酶素的抗藥性上升兩倍，剔除
H239_3064 後使得菌株對老虎酶素的抗藥性下降，並回到野生型菌株
的感受性。實驗結果證實 CrrB 的突變不但能造成克痢黴素抗藥性的產 生，同時也能藉由 H239_3064 使克雷伯氏肺炎桿菌對最後一線抗生素 老虎酶素的耐受性上升。六、偵測臨床菌株是否帶有 mcr-1 基因
除了基因的變異造成抗藥性的產生之外，近年也第一次發現可以
轉移的克痢黴素抗藥性基因 mcr-1 (Liu et al., 2016; Xavier et al., 2016) ，
mcr-1 為磷酸乙醇胺轉移酶類酵素 (phosphoethanolamine transferase
enzyme family) 並且位於質體上，因此可以藉由水平轉移的方式，在於 不同細菌之間轉移，而 mcr-1 能使脂多醣進行磷酸乙醇胺的修飾而產 生抗藥性。近年來的研究也指出 mcr-1 廣泛的存在大腸桿菌和克雷伯 氏肺炎桿菌當中，使得克痢黴素抗藥性的問題日趨嚴重 (Gao et al., 2016; Liakopoulos et al., 2016) 。然而我們利用聚合酶連鎖反應偵測我 們 26 個克痢黴素抗藥菌株是否帶有 mcr-1 基因，結果顯示所有菌株皆 不帶有 mcr-1 基因，因此也推測我們唯一不清楚抗藥性機制的菌株 Col5，並不是利用 mcr-1 基因而產生抗藥性。
七、未來研究方向
不論是 mgrB 的改變或是 crrB 的突變，最終都造成脂多醣的修飾 增加，而脂多醣的結構改變很可能使得菌株對其他種類的抗生素產生 交叉抗藥性，甚至使部分抗生素的感受性下降。而經過實驗，我們已經 知道 crrB 的突變對氯霉素、環丙沙星和頭孢黴素的感受性並無改變，
然而我們並未測試碳青黴烯類藥物的感受性。因此後續我們會觀察這 些突變造成脂多醣修飾的增加後，是否會改變菌株對碳青黴烯類藥物 的感受性。