一、莢膜型與序列型分佈
根據歐盟標準，當最小抑制濃度大於 2 g/ml 時，即為抗藥性菌株。
而在我們所收集的 26 株抗克痢黴素之克雷伯氏肺炎桿菌之中，有 30.8
% (8/26) 的菌株擁有高度抗藥性 (MICs 512 g/ml) (表一) ，於前人 研究中並不常見。其中菌株 Col14 及 Col40 同時具有碳青黴烯抗藥性，
且 Col14 菌株帶有雷伯氏肺炎桿菌碳青黴烯分解酶。
進一步為了了解台灣抗克痢黴素之克雷伯氏肺炎桿菌莢膜型與序 列分型的分佈。我們利用 wzc 的序列以及 rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、
infB、tonB 序列，比對資料庫後分別定出菌株之莢膜型與序列分型。莢
膜型的結果顯示，在 26 菌株中有 50 % (13/26) 為莢膜型 K64，11.5 % (3/26) 為莢膜型 K24，7.7 % (2/26) 為莢膜型 K54 (表一) 。序列型則有 53.9 % (14/26) 的菌株為序列型 ST11，15.4 % (4/26) 為序列型 ST15，7.7 % (2/26) 為序列型 ST421 (表一) 。結果顯示 K64 和 ST11 分別是台 灣抗克痢黴素之克雷伯氏肺炎桿菌主要的莢膜型和序列型。而大部分 莢膜型與序列分型具有高度相關性，可能是由於菌株的演化所造成。
二、脂多醣修飾可能為主要克痢黴素抗藥性產生的原因
先前研究指出，克痢黴素的抗藥性是藉由增加脂多醣 4-氨基-4-脫 氧-L-阿拉伯糖和磷酸乙醇胺的修飾所導致，而修飾的增加已知是藉由
pmrHFIJKLM 操縱子和 pmrC 的表現所達成 (Breazeale et al., 2005; Yan
et al., 2007) 。然而直接定量菌株的脂多醣修飾必須藉由質譜儀的分析
產生克痢黴素抗藥性，其中 10 株菌株同時增加磷酸乙醇胺的修飾。
三、偵測 mgrB 基因的改變
先前研究指出，pmrHFIJKLM 操縱子表現量上升，可能是由於上游 的調控子 mgrB 突變或受到外來插入序列破壞所導致 (Cannatelli et al., 2013; Cannatelli et al., 2014) 。因此我們利用聚合酶連鎖反應的方式將 26 株抗克痢黴素菌株的 mgrB 序列放大並定序來檢驗 mgrB 序列是否 有改變。結果顯示 26 株菌株中有 3 株之 mgrB 編碼區域 (coding region) 中存在外來插入序列 (insertion sequences)，而其中 5 株之 mgrB 啟動子 區域 (promotor region) 帶有外來插入序列 (圖二) (表一) ，經過比對可 知外來插入序列分別為 IS10R 和 IS5-like 序列 (DDBJ accession no.
LC016697 to LC016704) 。而相較於克痢黴素感受性菌株，有 4 株抗藥 性菌株的 MgrB 有胺基酸的改變，其中包含先前報導過可以導致抗藥 性的點突變位置 (C28Y) 和我們新發現的突變位點，MgrB 的停止碼 (stop codon) 改變 (Stop48Y) ，因此導致 MgrB 的序列延長 15 個胺基 酸 (DDBJ accession no. LC016506 to LC016508) 。並且有 2 株抗藥性菌 株無法利用聚合酶連鎖反應的方式放大 mgrB 的片段 (圖三) ，南方墨 點法也證實這兩株菌株之 mgrB 片段已經從基因體中被剔除 (圖四)。
mgrB 編碼區域被外來序列插入已知可以破壞 mgrB 的正常功能
(Cannatelli et al., 2013; Cannatelli et al., 2014) ，然而外來序列插入啟動 反轉錄聚合酶連鎖反應的結果顯示，MgrB Stop48Y 的改變造成 NTUH-K2044 菌株顯著的增加下游 pmrH 的基因表現 (表四) ，證實 MgrB Stop48Y 的改變是藉由 pmrHFIJKLM 操縱子表現量上升，增加脂多醣 的修飾而導致克痢黴素抗藥性的產生。
總結上述的實驗結果可知，我們收集到的 26 株抗克雷伯氏肺炎桿 菌之中，共有 8 株在 mgrB 區域有外來插入序列，而其中 2 株的 mgrB 被剔除，以及 4 株的 mgrB 序列帶有胺基酸的改變。整體來說，在台灣 有 53.8 % (14/26) 的抗克痢黴素之克雷伯氏肺炎桿菌是藉由 mgrB 的改 變 (包含被外來序列插入、點突變以及剔除等方式所造成) 而造成克痢 黴素的抗藥性產生，為台灣主要抗藥性產生的機制。
四、PhoPQ 和 PmrAB 突變導致克痢黴素抗藥性的產生
除了 mgrB 之外，pmrHFIJKLM 操縱子已知可以被 PhoPQ 和 PmrAB 兩套雙分子訊息調控系統所調控，也有研究指出 PhoPQ 和 PmrAB 的胺基酸突變可以造成克痢黴素的抗藥性 (Cheng et al., 2010;
Jayol et al., 2014) 。因此我們利用聚合酶連鎖反應的方式分別放大
phoPQ 和 pmrAB 以及兩套系統之連接者 pmrD 的基因片段並且進行定
序，再將其序列與 8 株對克痢黴素敏感菌株的序列做比較。結果發現 抗藥性菌株在 PhoP 有兩個位置的胺基酸改變 (V3F 和 S86L) 、PhoQ 有三個 (L26P、D150G 和 V258F) 、PmrB 則有三個位置不同 (T157P、R256G 和 V280L) (表一) ，而在 PmrA 和 PmrD 中則沒有發現可能導致 克痢黴素抗藥性的胺基酸改變。在我們發現的胺基酸改變中，PmrB T157P 已經被指出和克痢黴素的抗藥性相關 (Jayol et al., 2014) ，而
PmrB V280L 因為改變同樣是支鏈胺基酸 (branched chain amino acid) 所以猜測這個胺基酸改變應不會導致抗藥性的產生。為了驗證其他胺 基酸的改變是否成造成克痢黴素抗藥性的產生，我們同樣將 NTUH-K2044 菌株中 PhoP、PhoQ 和 PmrB 的序列分別置換成不同的胺基酸，
結果顯示僅有 PhoQ L26P 能造成菌株對克痢黴素的感受性改變 (表四)，
PhoQ L26P 的改變使 NTUH-K2044 菌株產生對克痢黴素的抗藥性 (MICs = 32 g/ml) 。PhoPQ 的突變已知可以導致下游 pmrHFIJKLM 操 縱子表現量上升，因而產生克痢黴素抗藥性 (Miller et al., 2011) 。因此 我們利用定量反轉錄聚合酶連鎖反應檢驗 pmrH 的基因表現量，結果 顯示，和 K2044 野生型菌株相比，帶有 PhoQ L26P 突變的 NTUH-K2044 菌株顯著的增加 pmrH 基因的表現量 (表四) 。因此證實 PhoQ L26P 的胺基酸改變可以造成下游 pmrHFIJKLM 操縱子的大量表現，導 致克雷伯氏肺炎桿菌產生克痢黴素的抗藥性。整體來說，扣除 mgrB 的 變異以及被證實的 pmrB 和 phoQ 突變後，仍然有 9 個克痢黴素抗藥菌 株不清楚抗藥性產生的分子機制。
五、CrrB 突變導致克痢黴素抗藥性的產生
近年來有研究指出，新發現的雙分子訊息調控系統 CrrAB 和克痢 黴素的抗藥性有關。將正常的 crrAB 基因送入帶有點 CrrB 突變的克痢
黴素抗藥菌株，即使克痢黴素抗藥菌株轉變成感受性菌株 (Wright et al., 2015) 。該研究也利用次世代定序比較 CrrB 突變株之基因表現量，並 觀察到 CrrB 的突變可以導致 pmrHFIJKLM 操縱子、pmrC 和 crrAB 鄰 近的兩個基因 H239_3059 和 H239_3062 的基因表現量提升 (Wright et
al., 2015) 。而 H239_3059 經過胺基酸序列比對，為一個帶有 TupA-like
ATP grasp 相似序列的醣基轉移酶 (glycosyltransferase) 。因此作者推 測，CrrB 的突變會使的 pmrHFIJKLM 操縱子、pmrC 和 H239_3059 大 量表現，這些基因進而增加酯多醣的修飾，而產生克痢黴素的抗藥性CrrB 有 6 個不同的胺基酸改變 (Q10L、Y31H、W140R、N141I、P151S 和 S195N) (表五) 。為了檢驗這 6 個胺基酸的改變是否真的會造成克痢 黴素的抗藥性，我們分別將這 6 個胺基酸送入感受性菌株之一的 A4528 菌株之中製造基因體的點突變，結果顯示 6 個胺基酸的改變均可以造 成克痢黴素的抗藥性 (表六) ，其中 5 個位點的改變 (Q10L、W140R、
N141I、P151S 和 S195N) 更可以造成高度克痢黴素抗藥性的產生 (MICs 512 g/ml) (表六) 。這些實驗證實，在 26 個抗藥性菌株之中，
有 8 株克痢黴素抗藥性菌株是藉由 crrB 的突變導致克痢黴素抗藥性的 產生。顯示 crrAB 突變所導致的克痢黴素抗藥性在台灣佔有重要的角 色。
六、CrrB 藉由 H239_3062 導致克痢黴素抗藥性
儘管上述實驗證實 CrrB 的突變可以導致克痢黴素抗藥性，但其詳 細分子機制尚不清楚。而前人研究指出，CrrB 的突變可以造成鄰近的 兩個基因 H239_3059 和 H239_3062 基因表現量大幅上升，更推測可能 是 藉 由 H239_3059 增 加 脂 多 醣 的 修 飾 而 產 生 克 痢 黴 素 的 抗 藥 性 (Wright et al., 2015) 。為了驗證前人研究，我們利用定量反轉錄聚合酶 連鎖反應偵測臨床菌株中 H239_3059 和 H239_3062 的基因表現量，結 果顯示相較於克痢黴素感受性菌株，8 株帶有 CrrB 突變的抗克痢黴素
臨床菌株都有顯著提升 H239_3059 和 H239_3062 的基因表現量 (圖 六) 。而相較於 A4528 野生型菌株，分別帶有 6 個 CrrB 胺基酸改變的 A4528 突變株，H239_3059 和 H239_3062 的基因表現量也有顯著的升 高 (圖六) 。
為了證實 H239_3059 和 H239_3062 基因表現量的提升是否造成克 痢黴素抗藥性，我們在帶有 CrrB N141I 胺基酸改變的 A4528 突變株分 別將 H239_3059 和 H239_3062 進行基因剔除。實驗結果顯示，剔除
H239_3059 並不影響 crrB 突變所造成的克痢黴素抗藥性，而剔除 H239_3062 意外的造成克痢黴素抗藥性大幅下降 (MICs 2 g/ml) (表
七) 。由於實驗證實 H239_3062 和克痢黴素抗藥性相關，因此我們也 將 H239_3062 命名為 crrC。七、CrrC 藉由 PmrAB 調控 pmrHFIJKLM 操縱子
最開始的實驗已指出，帶有 CrrB 胺基酸改變的 8 株抗藥性菌株可 能也是藉由 PmrHFIJKLM 調控 4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖的修飾而產 生克痢黴素的抗藥性，加上我們證實 crrC 與克痢黴素抗藥性相關，所 以推測 CrrAB 可能是藉由 CrrC 調控 pmrHFIJKLM 操縱子的表現量。
為了驗證這個理論，我們先利用定量反轉錄聚合酶連鎖反應比較 A4528 野生型以及其 CrrB 點突變株之 pmrH 的基因表現量。結果顯示，6 個
CrrB 的胺基酸突變均會造成 pmrH 基因表現量顯著的上升 (圖七) 。
同樣受到 pmrAB 所調控的基因 pmrC 也和 pmrH 一樣，在 crrC 和 pmrAB 剔除後顯著的下降，且接近 A4528 野生型菌株的基因表現量 (圖八) 。 這些實驗證明 CrrC 調控 pmrHFIJKLM 操縱子是藉由 pmrAB 所導致，
而 CrrC 無法直接調控 pmrHFIJKLM 操縱子和 pmrC 的基因表現，必須 透過 pmrAB。
八、CrrB 突變導致較高克痢黴素的抗藥性
在 26 株抗克痢黴素的菌株之中，其中 14 株因為 mgrB 有外來插入 序列、缺失、以及點突變造成 mgrB 表現量減少甚至無法轉譯出正確核 醣核酸導致下游大量表現 pmrHFIJKLM 操縱子。而分別有 2 株和 1 株 為 PmrB 或 PhoQ 突變造成 pmrC 和 pmrHFIJKLM 操縱子表現量提升而 導致克痢黴素的抗藥性。然而 8 株 CrrB 突變的抗藥性菌株雖然也同樣 利用 pmrC 和 pmrHFIJKLM 操縱子表現量提升而導致克痢黴素的抗藥 性，但有 CrrB 突變的臨床菌株的對克痢黴素的最小抑制濃度明顯較其 他臨床菌株高 ( MICs 512g/ml ) (表一) 。因此我們推測 CrrAB 不僅 可以調控 pmrC 和 pmrHFIJKLM 操縱子表現量，同時還調控其他可以 產生克痢黴素抗藥性的分子機制。
為了了解除了利用 pmrC 和 pmrHFIJKLM 操縱子之外的抗藥機制，
我們利用建構跳躍子突變株庫的方式來尋找其他可能的抗藥機制。將
帶有 CrrB N141I 胺基酸改變的 A4528 菌株與帶有 pUT-Km1 的大腸桿 菌 S17-1 進行接合作用後，即可得到帶有跳躍子的 A4528 crrB(N141I) 突變株。在利用 1024 g/ml 的克痢黴素篩選 2976 個跳躍子突變株之 後，我們共得到 49 株克痢黴素抗藥性下降的跳躍子突變株，而我們再 利用半隨機聚合酶連鎖反應以及定序的方式確認突變株中跳躍子所插 入的位置及辨認其所破壞的基因。在 49 個突變株中，其中 20 個突變 株的跳躍子分別位於 crrC、crrA 和 crrB 之間，而 3 個突變株的跳躍子 分別位於 pmrH 和 pmrF 的啟動子區域和編碼區中。其餘 24 個突變株 的跳躍子則位於基因體的不同區域中，例如脂多醣合成相關基因、排出 幫浦 (efflux pump) 等 (表八) 。而其中 2 株跳躍子突變株經過半隨機 聚合酶連鎖反應以及定序後發現其跳躍子旁的序列仍然是質體 pUT-km1 的區域，推測應為原本提供質體的大腸桿菌。
九、CrrB 突變導致 H239_3064 的表現量上升
為了區別跳躍子突變株的克痢黴素抗藥性下降是藉由 CrrB 胺基酸
為了區別跳躍子突變株的克痢黴素抗藥性下降是藉由 CrrB 胺基酸