環糊精應用

由於環糊精有著特殊的圓桶狀且具有外水內有的特殊分子結構，有 著分子容器的功能，可以誘捕欲包覆的客體分子進入環糊精主體分子的 孔洞中。加上因為客分子包覆到環糊精中後，環糊精將改變並修飾客分 子的物理性質，此外，環糊精的結構組成係由天然葡萄糖環狀鏈結而 成，是天然可分解不具毒性的材料，因此環糊精可以當作廣泛性的應用 載體。目前在環糊精所應用的範圍以涵括在藥物載體^[38][39]、化妝品^[40]、 化學工程^[41]、食品工業^[42]以及香料香精^[43]製備上。

5. 環糊精的物理與化學性質影響在中藥製劑上的應用

5.1 改善有效成份的溶解度，提高製劑的溶出速率和生物可利用度 由於環糊精有著特殊的圓桶狀且具有外水內油的特殊分子結構，使 疏水性的分子可以進入環糊精中。這對許多中藥成分裡難溶性的分子，

提供水性化的途徑，增加藥物在水中的溶解度以及在製劑中的溶出速 率，使得藥物可以容易通過細胞膜，進而提高生物利用度^[44-46]。

5.2 防止揮發性成分的揮發，提高中藥製劑穩定性

由於大多數中藥有效成分都具有揮發性，以揮發油成分中為例，單 萜、倍半萜以及其含氧衍生物占大多數。這些成分不僅易氧化，對光、

氧都極易形氧化作用而變質影響效用，甚至進一步產生具有毒性的副產 物。當以環糊精進行包覆後，藥物的有效成分會被包合在環糊精的圓柱 孔洞中，環糊精保護藥物分子不穩定的部分，切斷藥物分子與周遭環境 的接觸，有效防止揮發。同時，避免光、氧以及水解條件形成的影響，

增加穩定性^[47-49]。

5.3 降低藥物刺激性及毒副作用，掩蓋不良氣味

一般中藥比較不為社會大眾接受的原因不外乎具有特殊氣味，影響 病患用藥的情緒及觀感，尤其以小孩及女性比較難忍受。而有些藥物具 刺激性成分，若直接應用在人體上會造成不舒服甚至傷害。環糊精本身 不具任何氣味，當藥物包覆在環糊精中將掩蓋不良氣味，降低藥物成分

直接的刺激身體，此一功用對於中藥製劑有很大幫助^[50][51]。 5.4 使液體藥物粉末化

由於中藥中重要的揮發油成分容易揮發，以環糊精包覆後可以將其 粉末化，也變的容易與其他藥品製成所需要的劑型，克服了原本藥物劑 型所存在的缺點，利用價值提高^[52]。

5.5 調節藥物釋放速率

許多藥物的揮發油在應用上因易揮發、化學作用而變質的原因，使 得中藥製劑效果變的較差。當環糊精包覆這些揮發油後，便控制了這些 揮發油成分的釋放與否。另外有些環糊精先經過化學官能基修飾後，可 以發揮不同功效。例如將水溶性藥物包覆後，降低藥物對水的溶解度，

延緩藥物在水中釋放的速度，增加水溶性藥物作用時間^[53][54]。 5.6 作為標靶藥物的載體

藥物在體內常常尚未到達作用區域便解離失去了活性，而環糊精包 覆藥物後成為一個複合體。由於環糊精包合物在水中屬於動態平衡的條 件，此一複合體的解離取決於包合物穩定常數之影響。因此環糊精藥物 包合物可以提供藥物在標靶器官或組織部位試放的目的^[55][56]。

5.7 用於有效成分的分離與含量測定

環糊精在化學分析上常用來鑑定分離異構物、官能基以及鏡像異構 物，也用於化學分子吸附力的分析。甚至一些微量級技術上，例如，毛

細管電泳、微量透析及微柱高效液相色譜分析上。而中藥要現代化、科 學化，分離純化技術是關鍵所在^[57][58]。

6. 環糊精的釋放控制機制

在環糊精包覆作用下形成穩定的複合體分子結構，並沒有共價鍵在 包覆作用中生成或斷裂。而當環糊精處在水溶液中，水分子單純地附著 在環糊精分子的外圍，表現了它們的水溶性，導致分子空間結構的微小 變化，環糊精與活性物的接合力被削弱了，複合物成了不穩定的主-客 體，活性物質便從環糊精中釋放出來^[59]。在水溶液中環糊精與客分子結 合成複合體，主要是原來已溶劑化的包覆物質與水分子的重新排列和移 除的過程。氫鍵、釋放能量和電荷轉移都是複合物形成和穩定的驅動 力。當複合物形成時所產生的熱能變化是因為偶級-偶級作用力所產生的 能量，是極為小且穩定。因此，環糊精包覆過程的熱力學、客分子疏水 部分進入環糊精疏水性的內部，跟客分子去水合作用有關，也與生成的 氫鍵和釋放空腔內原有的水分子，內部張力所導致的變化現象有關。直 到接觸水性物質之前，此一環糊精複合體的活性微囊受到相當程度保 護，穩定了對光、熱和空氣氧化的影響條件^[60-65]。控釋有很多的優點，

它增加了產品的功效，特別是在環糊精提供對活性物的保護上面^[66]。相 類似的機制有微脂體，脂質體也是一種奈米的介質，然而將活性成份塞

入脂質體很昂貴，對油性很敏感，這對中草藥大多主要成分是揮發油而 言效果並不好。而環糊精則提供了包覆油性物質條件，價格也較為低 廉，因此，利用環糊精來進行中草藥開發是值得期待的新製程(圖 2.9)。

圖 2.9 環糊精奈米技術包覆示意圖 7. HP-β-環糊精概述

羥丙基倍他環糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin; HP-β-CD) 是β-環糊精的一種羥烷基化衍生物。它是近幾年有關製備方法，毒理試 驗，應用範圍研究的比較透徹的 β-環糊精衍生物之一。HP-β-環糊精不 但可以與β-環糊精一樣對許多化合物具有優良的包覆作用，提高被包覆

物質的穩定性，而且它還具有水溶性高和在生物體內提高被包覆藥物的 釋放速度和生物利用度。因此，HP-β-環糊精具有一些特殊的優良特性，

應用範圍更廣，在醫藥上最具有應用前途。HP-β-環糊精是在 β-環糊精 的 C2 、C3 和 C8 位的羥基被羥丙基取代生成的衍生物^[67] 。而目前以 β-環糊精應用較為廣泛，而在食品應用及安全性也經較多國家認可 (表 2.2)(表 2.3)^[68][69]。我們使用HP-β-環糊精來與 β-環糊精做一個對照，

順便觀察水溶性較差的 β-環糊精與水溶性較好的 HP-β-環糊精是否有所 差異。

表 2.2 各國環糊精應用許可情形

表 2.3 環糊精安全性一覽

第三章、 實驗材料與方法

本研究主要分為(1)牡丹皮粗萃物之製備與分析(2)牡丹皮萃取物、純 丹皮酚環糊精包合物的製備(3)牡丹皮萃取物、純丹皮酚及其環糊精包合 物的抗氧化與抑制酪胺酸酶活性能力評估，大綱如下表所列(表 3.1)。各 實驗所用之儀器設備、材料、試劑與實驗方法分述如下：

表 3.1 實驗流程大綱

一、實驗材料、藥品與儀器設備

1. 中藥材料之來源

本實驗所使用之牡丹皮皆購自彰化縣員林鎮弘益中醫診所，由黃美 華中醫師鑑定並確認藥材無誤。

2. 藥品

2.1 中藥材萃取物之製備 z 無水乙醇 購自 Panreac z 牡丹皮 購自弘益中醫診所

2.2 含中藥萃取物之 β-環糊精包合物製備

z β-環糊精 Beta-cyclodextrins ( β- CD ) 購自 ALDRICH

z 羥丙基 β-環糊精 Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD) 購自 ALDRICH

z 中藥萃取物

z 丹皮酚 Paeonol pure compound 購自 ALDRICH z 無水乙醇 購自 Panreac

2.3 中藥萃取物抗老化能力 清除自由基之效果

z α,α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl ( DPPH ) radical 購自 SIGMA

z 對苯二酚 Hydroquinone ( HQ ) 購自 SIGMA z 無水乙醇 購自 Panreac

2.4 中藥萃取物對美白的有效能力評估

中藥萃取物體外抑制酪胺酸酵素活性的影響 z Tyrosinase 購自 SIGMA, T8566

z L-Tyrisine 購自 SIGMA, T3824 z Phosphate Buffer Saline ( PBS )

３. 儀器設備

z 分光光度計 (Chromtech UV-3100)

z ELISA 分光光度計 (Spectramay340 PC-384) z 減壓濃縮機 (EYELA N-1)

z 電子天秤 (Denver instrument TB-214) z 冷凍乾燥機 (EYELA FDU-1200) z 水流抽氣機 (EYELA )

z 真空烘箱 (Instruments corp. VO-27) z 循環冷卻機

z 超音波震盪器 z 4℃ 冰箱

z -20℃ 冷凍櫃 z 粉碎機

z 96 - well plate z 八孔分注器 z 微量分注器

z 15 ml 與 50 ml 無菌離心管 z 燒杯

z 血清瓶

z 100 ml 定量瓶

二、實驗方法

1. 牡丹皮粗萃物之製備與分析 1.1 牡丹皮粗萃膠之製備

將購買回來的牡丹皮分批放入粉碎機中打碎，將所有打碎之牡丹皮 粉末收集到塑膠袋中攪拌均勻，放入密封罐中放置防潮箱中保存。

取牡丹皮粉 150 g 加入 1000 ml 以無水乙醇製備好的 95% 酒精溶 劑中提取，置於室溫下 24 小時，以濾紙濾除雜質及其他不溶的部分，

濾液再以減壓濃縮機除去乙醇後，將濃縮液放置冷凍乾燥機以 -50℃ 進 行烘乾，得到萃取膠後再置於防潮箱中備用。

1.2 牡丹皮粗萃物之分析

a. 紫外光圖譜繪製及波長選擇

精密秤取標準品丹皮酚適量置於定量瓶中，加入經無水乙醇稀釋過 後而得之 95% 乙醇作為溶劑，使其溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得到 丹皮酚的標準溶液。以 95% 乙醇當作空白，在 200 nm ~ 400 m 波長範

圍掃描，得到274 nm 為最大吸收波長並訂定為測定波長。

b. 丹皮酚乙醇溶液標準曲線制備、測定與繪製

取丹皮酚乙醇標準溶液至不同定量瓶中，以 95% 乙醇稀釋至刻 度，配製成丹皮酚乙醇標準系列溶液。以 95% 乙醇為空白，於 274 nm 此 波長測定吸光值可分別得到一系列均值。以吸光值為縱座標，溶液濃度 為橫坐標，計算一元線性迴歸與相關係數並繪製成表，即得到範圍內良 好線性關係。

c. 牡丹皮濃縮液內丹皮酚含量測定

精密秤取牡丹皮粗萃膠1 mg 精密稀釋 100 倍。依照標準曲線制備 所述方法測定，並將所得到之結果帶入標準方程式，計算牡丹皮粗萃膠 所含丹皮酚濃度。

2. 環糊精包合物的製備

2.1 含牡丹皮粗萃物之環糊精奈米包覆藥物的製備

採過飽和溶液法進行包合，秤環糊精適量於樣品瓶，加入適量二次

表 3.3 HP-β-環糊精包覆製程 HP-β-CD:

Extract

EtOH Inclusion Temp

3. 清除自由基能力

3.1 DPPH 測試樣品溶液配製：

先計算實驗中所需要用到的測試樣品量，再進行 DPPH 的樣品配 製。取α,α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl ( DPPH ) 2 mg 置於褐色瓶中，加入 適量體積之50% 乙醇溶液配置成 20 μg/ml，置入超音波震盪器中震盪

先計算實驗中所需要用到的測試樣品量，再進行 DPPH 的樣品配 製。取α,α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl ( DPPH ) 2 mg 置於褐色瓶中，加入 適量體積之50% 乙醇溶液配置成 20 μg/ml，置入超音波震盪器中震盪