環糊精的釋放控制機制

在環糊精包覆作用下形成穩定的複合體分子結構，並沒有共價鍵在 包覆作用中生成或斷裂。而當環糊精處在水溶液中，水分子單純地附著 在環糊精分子的外圍，表現了它們的水溶性，導致分子空間結構的微小 變化，環糊精與活性物的接合力被削弱了，複合物成了不穩定的主-客 體，活性物質便從環糊精中釋放出來^[59]。在水溶液中環糊精與客分子結 合成複合體，主要是原來已溶劑化的包覆物質與水分子的重新排列和移 除的過程。氫鍵、釋放能量和電荷轉移都是複合物形成和穩定的驅動 力。當複合物形成時所產生的熱能變化是因為偶級-偶級作用力所產生的 能量，是極為小且穩定。因此，環糊精包覆過程的熱力學、客分子疏水 部分進入環糊精疏水性的內部，跟客分子去水合作用有關，也與生成的 氫鍵和釋放空腔內原有的水分子，內部張力所導致的變化現象有關。直 到接觸水性物質之前，此一環糊精複合體的活性微囊受到相當程度保 護，穩定了對光、熱和空氣氧化的影響條件^[60-65]。控釋有很多的優點，

它增加了產品的功效，特別是在環糊精提供對活性物的保護上面^[66]。相 類似的機制有微脂體，脂質體也是一種奈米的介質，然而將活性成份塞

入脂質體很昂貴，對油性很敏感，這對中草藥大多主要成分是揮發油而 言效果並不好。而環糊精則提供了包覆油性物質條件，價格也較為低 廉，因此，利用環糊精來進行中草藥開發是值得期待的新製程(圖 2.9)。

圖 2.9 環糊精奈米技術包覆示意圖 7. HP-β-環糊精概述

羥丙基倍他環糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin; HP-β-CD) 是β-環糊精的一種羥烷基化衍生物。它是近幾年有關製備方法，毒理試 驗，應用範圍研究的比較透徹的 β-環糊精衍生物之一。HP-β-環糊精不 但可以與β-環糊精一樣對許多化合物具有優良的包覆作用，提高被包覆

物質的穩定性，而且它還具有水溶性高和在生物體內提高被包覆藥物的 釋放速度和生物利用度。因此，HP-β-環糊精具有一些特殊的優良特性，

應用範圍更廣，在醫藥上最具有應用前途。HP-β-環糊精是在 β-環糊精 的 C2 、C3 和 C8 位的羥基被羥丙基取代生成的衍生物^[67] 。而目前以 β-環糊精應用較為廣泛，而在食品應用及安全性也經較多國家認可 (表 2.2)(表 2.3)^[68][69]。我們使用HP-β-環糊精來與 β-環糊精做一個對照，

順便觀察水溶性較差的 β-環糊精與水溶性較好的 HP-β-環糊精是否有所 差異。

表 2.2 各國環糊精應用許可情形

表 2.3 環糊精安全性一覽

第三章、 實驗材料與方法

本研究主要分為(1)牡丹皮粗萃物之製備與分析(2)牡丹皮萃取物、純 丹皮酚環糊精包合物的製備(3)牡丹皮萃取物、純丹皮酚及其環糊精包合 物的抗氧化與抑制酪胺酸酶活性能力評估，大綱如下表所列(表 3.1)。各 實驗所用之儀器設備、材料、試劑與實驗方法分述如下：

表 3.1 實驗流程大綱

一、實驗材料、藥品與儀器設備

1. 中藥材料之來源

本實驗所使用之牡丹皮皆購自彰化縣員林鎮弘益中醫診所，由黃美 華中醫師鑑定並確認藥材無誤。

2. 藥品

2.1 中藥材萃取物之製備 z 無水乙醇 購自 Panreac z 牡丹皮 購自弘益中醫診所

2.2 含中藥萃取物之 β-環糊精包合物製備

z β-環糊精 Beta-cyclodextrins ( β- CD ) 購自 ALDRICH

z 羥丙基 β-環糊精 Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD) 購自 ALDRICH

z 中藥萃取物

z 丹皮酚 Paeonol pure compound 購自 ALDRICH z 無水乙醇 購自 Panreac

2.3 中藥萃取物抗老化能力 清除自由基之效果

z α,α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl ( DPPH ) radical 購自 SIGMA

z 對苯二酚 Hydroquinone ( HQ ) 購自 SIGMA z 無水乙醇 購自 Panreac

2.4 中藥萃取物對美白的有效能力評估

中藥萃取物體外抑制酪胺酸酵素活性的影響 z Tyrosinase 購自 SIGMA, T8566

z L-Tyrisine 購自 SIGMA, T3824 z Phosphate Buffer Saline ( PBS )

３. 儀器設備

z 分光光度計 (Chromtech UV-3100)

z ELISA 分光光度計 (Spectramay340 PC-384) z 減壓濃縮機 (EYELA N-1)

z 電子天秤 (Denver instrument TB-214) z 冷凍乾燥機 (EYELA FDU-1200) z 水流抽氣機 (EYELA )

z 真空烘箱 (Instruments corp. VO-27) z 循環冷卻機

z 超音波震盪器 z 4℃ 冰箱

z -20℃ 冷凍櫃 z 粉碎機

z 96 - well plate z 八孔分注器 z 微量分注器

z 15 ml 與 50 ml 無菌離心管 z 燒杯

z 血清瓶

z 100 ml 定量瓶

二、實驗方法

1. 牡丹皮粗萃物之製備與分析 1.1 牡丹皮粗萃膠之製備

將購買回來的牡丹皮分批放入粉碎機中打碎，將所有打碎之牡丹皮 粉末收集到塑膠袋中攪拌均勻，放入密封罐中放置防潮箱中保存。

取牡丹皮粉 150 g 加入 1000 ml 以無水乙醇製備好的 95% 酒精溶 劑中提取，置於室溫下 24 小時，以濾紙濾除雜質及其他不溶的部分，

濾液再以減壓濃縮機除去乙醇後，將濃縮液放置冷凍乾燥機以 -50℃ 進 行烘乾，得到萃取膠後再置於防潮箱中備用。

1.2 牡丹皮粗萃物之分析

a. 紫外光圖譜繪製及波長選擇

精密秤取標準品丹皮酚適量置於定量瓶中，加入經無水乙醇稀釋過 後而得之 95% 乙醇作為溶劑，使其溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得到 丹皮酚的標準溶液。以 95% 乙醇當作空白，在 200 nm ~ 400 m 波長範

圍掃描，得到274 nm 為最大吸收波長並訂定為測定波長。

b. 丹皮酚乙醇溶液標準曲線制備、測定與繪製

取丹皮酚乙醇標準溶液至不同定量瓶中，以 95% 乙醇稀釋至刻 度，配製成丹皮酚乙醇標準系列溶液。以 95% 乙醇為空白，於 274 nm 此 波長測定吸光值可分別得到一系列均值。以吸光值為縱座標，溶液濃度 為橫坐標，計算一元線性迴歸與相關係數並繪製成表，即得到範圍內良 好線性關係。

c. 牡丹皮濃縮液內丹皮酚含量測定

精密秤取牡丹皮粗萃膠1 mg 精密稀釋 100 倍。依照標準曲線制備 所述方法測定，並將所得到之結果帶入標準方程式，計算牡丹皮粗萃膠 所含丹皮酚濃度。

2. 環糊精包合物的製備

2.1 含牡丹皮粗萃物之環糊精奈米包覆藥物的製備

採過飽和溶液法進行包合，秤環糊精適量於樣品瓶，加入適量二次

表 3.3 HP-β-環糊精包覆製程 HP-β-CD:

Extract

EtOH Inclusion Temp

3. 清除自由基能力

3.1 DPPH 測試樣品溶液配製：

先計算實驗中所需要用到的測試樣品量，再進行 DPPH 的樣品配 製。取α,α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl ( DPPH ) 2 mg 置於褐色瓶中，加入 適量體積之50% 乙醇溶液配置成 20 μg/ml，置入超音波震盪器中震盪 30 秒，取出搖晃均勻並將 DPPH 試液放置冰桶上避光儲存。

3.2 對照組與實驗組樣品溶液配製：

對苯二酚（HQ）是一種脂溶性的酚類化合物，在皮膚的美白方面，

HQ 會抑制黑色素生合成的作用，是因為抑制了酪胺酸酶的活性及抑制

黑色小體的形成或增加黑色小體的分解作用，而產生了美白的效果。但 是因為具刺激性，高濃度（5﹪）長期使用會引起皮膚炎以及色素沉澱，

1987 年時已經被列入藥用品，一般化妝品不能使用。 取 HQ 0.01 g 加 入95% 乙醇溶液，配置成 1 mg/ml。置入超音波震盪器中震盪 60 秒，

取出搖晃均勻後，再配製成不同濃度樣品，將HQ 試液靜置儲存。

實驗組待測樣品溶液配製：牡丹皮粗萃膠 Extract Paeonol。丹皮酚 Paeonol pure compound。粗萃奈米包覆藥物 β-CD-1。β-CD-2。β-CD-3。

HP-β-CD-1。HP-β-CD-2 樣品溶液配製方法同上。

3.3 清除 α,α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl ( DPPH ) 自由基之實驗方法：

分別以 pipet 取配製好的各樣品溶液不同濃度 50 μl，注入 96-well

plate 且進行三重複驗證。自冰桶中取出 DPPH 試液以 pipet 取 100 μl 加入所有待測試液的well 中，充分混合均勻，蓋上鋁箔紙放置抽屜中避 光30 分鐘，以 ELISA 分光光度計測定 517 nm 吸光值，並且以公式計算 捕捉率。

捕捉率 ( % ) = ﹝( Ac – AS ) / Ac﹞ X 100%

As：含有待測物之樣品在 517 nm 吸光值。

Ac：不含待測物之對照組在 517 nm 吸光值。

4. 中藥萃取物對酪胺酸酶的抑制能力評估

4.1 體外抑制酪胺酸酶活性試驗之測試樣品溶液配製：

先計算實驗中所需要用到的測試樣品量，再進行 Tyrosinase 和 Tyrosine 的樣品配製。

取 Tyrosinase 2 mg ( 5370 unit/mg) 置於褐色瓶中，加入 1 ml 之 0.1 M PBS 配成 10 U ，利用 vortex 搖晃均勻，並將 Tyrosinase 試液放置冰桶 上避光儲存。

取 Tyrosine 0.018 mg 置於褐色瓶中，加入 100 ml 之 0.1 M PBS 配成 2.5 mM 試液，利用 vortex 搖晃均勻並將 Tyrosine 試液放置冰桶上避光 儲存。

4.2 對照組與實驗組樣品溶液配製：

取 HQ 0.06 g 加入 10% DMSO 溶液配置成 6 mg/ml，置入超音波震

盪器中震盪 60 秒，取出搖晃均勻後，再配製成不同濃度樣品，將 HQ 試液靜置儲存。

實驗組待測樣品溶液配製：牡丹皮粗萃膠 Extract Paeonol。丹皮酚 Paeonol pure compound。粗萃奈米包覆藥物 β-CD-1。β-CD-2。β-CD-3。

HP-β-CD-1。HP-β-CD-2 樣品溶液配製方法同上。

因包覆藥物重量包括環糊精與藥物兩著的重量 因此在藥物劑量上 利用下式去估算真正藥物重量：

藥物重量=秤取的包覆藥物重量 x[製備時藥物重量/(製備時環糊精 重量+製備時藥物重量)]

4.3 體外抑制酪胺酸酶活性試驗之實驗方法

分別以 pipet 取配製好的各樣品溶液不同濃度 50 μl 加入到 20 μl 0.1 M PBS ( pH 6.8 )中，注入 96-well plate，自冰桶中取出 Tyrosine 試液 以 pipet 取 79 μl 加入所有待測試液的 well 中，最後加入 1 μl Tyrosinase 試液且進行三重複驗證。充分混合均勻，放置到 37℃incubator 中 30 分 鐘，以 ELISA 分光光度計測定 475 nm 吸光值，並且以公式計算抑制率。

抑制率 ( % ) = ﹝( Ac – AS ) / Ac﹞ X 100%

As：含有待測物之樣品在 475 nm 吸光值。

Ac：不含待測物之對照組在 475 nm 吸光值。

第四章、結果

一、牡丹皮粗萃物之製備與分析 1.1 牡丹皮粗萃膠

牡丹皮粉 150 g 經 1000 ml 95% 酒精溶劑提取，置於室溫下 24 小

時後，以濾紙濾除雜質及其他不溶的部分，濾液再以減壓濃縮機除去乙 醇後，將濃縮液放置冷凍乾燥機以 -50℃ 進行凍乾，得到丹皮酚萃取膠 (圖 4.1)。

圖 4.1 牡丹皮粗萃膠。實驗結果得牡丹皮粗萃膠。

1.2 牡丹皮粗萃膠之分析

標準品丹皮酚適量加入 95% 乙醇至定量瓶中，溶解並稀釋至刻 度，搖勻得丹皮酚溶液。以95% 乙醇作空白，在 200 nm ~ 400 nm 波長 範圍掃描，實驗得到最大吸收波長為 274 nm(圖 4.2)，並訂定為測定波 長。

圖 4.2 牡丹皮粗萃膠之分析。標準丹皮酚溶液 1 mg/ml，實驗結果顯示，

標準丹皮酚溶液於274 nm 時，丹皮酚具有最大吸光值。

1.3 丹皮酚乙醇溶液標準曲線

取 2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml 丹皮酚

取 2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml 丹皮酚