前言 - 金屬膜蛋白對碳氫化合物之代謝作用

生物體存在著許多蛋白各司其職，而這些蛋白中有 47%的蛋白是金屬蛋白 (metalloproteins)，而有 41%是由其組成活性反應中心(Waldron, Rutherford et al.

2009)，除了有常見的主元素族中的鈣、鈉、鉀及鎂，亦有不少過度金屬元素，而這些過度金屬元素具備多種氧化態，其主要功能作為基質催化及電子傳遞之功用。

而在基質催化反應中，具有催化反應能力的金屬多數為鎂離子(約佔了 16%左右)，

其次為鐵、鋅及錳(大約佔了 6-9%間)，銅離子最為稀少，約只佔了 1%。但其中 81%

的鐵與 93%的銅均肩負了氧化還原反應的重要角色(Waldron, Rutherford et al. 2009)，

這些金屬離子鰲合在蛋白之活性反應中心，形成催化反應部位而針對反應物進行紅蛋白(myohemerythrin)及第二類為具有氧氣活性功能(O2-activating enzyme)之核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase)，溶解型脂肪酸去飽和酶 (soluble form desaturase)及溶解型甲烷單加氧酶(soluble methane monooxygenase, sMMO)。第三類為膜結合型脂肪酸去飽和酶，其序列與第一類及第二類明顯不同，主要為 8 個組胺酸所組成的序列鰲合兩個鐵離子形成活性反應中心：Hx(3 or 4)Hx(20-50)Hx(2 or 3)HHx100-200)Hx(2 or 3)HH。這一類的蛋白除了已知的膜結合型脂肪酸去飽和酶外， xylene monooxygenase 及烷烴羥化酶 (alkane hydroxylase, AlkB)(Shanklin, Whittle et al. 1994; Broadwater, Haas et al. 1998)。

這三大類具有雙鐵反映中心的蛋白第一類為包括蚯蚓血紅蛋白(hemerythrin) 或蚯蚓肌紅蛋白(myohemerythrin)這類型的氧氣結合蛋白(O2-binding proteins)，透過 5 個組胺酸(Histidine, His, H)側鏈上的咪唑環(imidazole ring)及 1 個白胺酸 (Leucine, Leu, L)側鏈上的羧酸官能基(-COOH group)穩定雙鐵結構形成其活性反應中心，而穀胺酸(Glutamate, Glu, E)及天門冬胺酸(Aspatate, Asp, D)側鏈上帶負電的羧酸根離子(-COO^- )則與雙鐵中心上、下配位形成作用力；第二類為包括原核生物的甲烷單加氧酶(methane monooxygenase)及溶解型Δ9-脂肪醯基質體蛋白去飽和酶 (Δ9-acyl-ACP desaturase)這類型的氧氣活化酵素(O2-activating enzymes)，透過 2 個組胺酸側鏈上的咪唑環、4 個穀胺酸側鏈上帶負電的羧酸根離子及 2 個水分子共同穩定雙鐵結構形成其活性反應中心；而第三類則為具有數個穿膜構造的膜結合型脂肪酸去飽和酶家族 (membrane-bound fatty acids desaturase family) 之蛋白 (Broadwater, Haas et al. 1998)。此家族蛋白的活性反應中心目前尚未有明確的結構解析出(圖解一)，只知道透過此蛋白高保守區之組胺酸鰲合雙鐵形成反應中心，但有多少個組胺酸共同參與，是否有其他胺基酸協同，目前仍未有定論(Broadwater, Haas et al. 1998; Lange and Que 1998; Martin, Oh et al. 2007; Shanklin, Guy et al. 2009)。

圖解一、三類型非血基質雙鐵中心(non-heme diiron center)。第一類為包括蚯蚓血紅蛋白及蚯蚓肌紅蛋白這類型的氧氣結合蛋白；第二類為包括核苷酸還原酶 R2 次單

位、原核生物的甲烷單加氧酶及溶解型Δ9-脂肪醯質體蛋白去飽和酶等，這類型的

氧氣活化酵素；第三類為具有數個穿膜構造的膜結合型脂肪酸去飽和酶家族之蛋

白(Broadwater, Haas et al. 1998)。

膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族其活性反應中心被歸類為第三類型非血基質雙鐵中心，此類型蛋白目前已知包括有：1. 去飽和酶類型：包括高等植物、哺乳動物、昆蟲、真菌及藍綠藻的脂肪醯基去飽和酶(fatty acyl desaturase) (Shanklin, Whittle et al. 1994)； 2. 真核生物膜結合型羥化酶類型：此類型目前只有蓖麻 (Ricinus communis)所特有之油酸-12 羥化酶(oleate 12-hydroxylase) (Vandeloo, Broun et al. 1995)；3.原核生物膜結合型羥化酶類型：此類型蛋白包括兩種，(1)具有 OCT 質體(OCT plasmid)的菌種，此質體可轉譯出烷烴羥化酶(alkane hydroxylase, AlkB) (Kok, Oldenhuis et al. 1989)，(2)具有 TOL 質體(TOL plasmid)的菌種，此質體可轉譯出二甲苯單加氧酶(xylene monooxygenase, XylM) (Suzuki, Hayakawa et al. 1991;

Harayama, Kok et al. 1992)。

而其他具有此反應中心卻不屬於膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族之蛋白，

則包括有：酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及根内球囊霉(Glomus intraradices)的 固醇甲基氧化酶(sterol methyl oxidase) (Bard, Bruner et al. 1996; Oger, Ghignone et al.

2009)，阿拉伯芥(Arabidopsis)的醛類脫羧酶(aldehyde decarboXylAse) (Aarts, Keijzer et al. 1995)。這些蛋白最大的特徵為都具有富含組胺酸之區域(Histidine-rich motifs)，

同時也皆為具有多重穿膜結構之膜蛋白(Broadwater, Haas et al. 1998)。

帶有非血基質雙鐵中心的蛋白在催化反應過程中，皆需要有外源電子提供至蛋白質本體才可進行催化作用，這些外源電子來自於輔酶(co-enzyme)，輔酶依來源不同分為煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH) (Shaw and Harayama 1992; Broadwater, Haas et al. 1998; Tshuva, Lee et al. 2002; Behan and Lippard 2010)，而這些輔酶在傳遞過程中，需要透過具有黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)之還原酶進行氧化還原作用，將輔酶之電子傳遞至具有

電子傳遞功能之中間蛋白，最後再傳遞至蛋白質本體。這些中間蛋白則有許多種形 式，包括：具有血基質結合位(heme-binding domain)的細胞色素 b5 蛋白(cytochrome b5 protein) (Schenkman and Jansson 2003)、具有 4 個胱氨酸(cysteine, Cys, C)鰲合單 鐵離子(Fe(S-cys)4)形成氧化還原中心(redox center)的紅素氧還原蛋白(rubredoxin) (Bau, Rees et al. 1998)、具有 4 個胱氨酸鰲合鐵離子，而鐵離子同時鰲合硫而形成鐵硫簇之結構(iron-sulfer cluster)以形成氧化還原中心的鐵氧還原蛋白(ferredoxin) (Kurisu, Kusunoki et al. 2001) ，其鐵硫簇配位方式又可分為二鐵二硫 (2Fe-2S) (Armengaud, Sainz et al. 2001)、三鐵四硫(3Fe-4S) (Nielsen, Harris et al. 2004)及四鐵四硫(4Fe-4S) (Fukuyama, Matsubara et al. 1989)三種。

這些蛋白質在進行催化過程中的反應物是皆由碳、氫及氧所形成不同類型之化合物所組成。自然界與生物體中帶有大量的碳氫化合物，除了可分解以作為能量的來源或儲存，亦可作為生物體組成之部分(Prenafeta-Boldu, Kuhn et al. 2001; van Beilen, Li et al. 2003; Wentzel, Ellingsen et al. 2007)。碳氫類化合物為有機化合物之一種，可再細分為烷烴、烯烴、炔烴、環烴及芳香烴，而其中烷烴與芳香烴，與日部的發育(Uauy, Hoffman et al. 2001; Uauy and Dangour 2006)。長鏈不飽和脂肪酸除了提供發育過程中所需，對於在生物體的結構形成與能量貯存也扮演重要角色，生物體內脂質分為兩大類，分別為磷脂類與甘油脂類。磷脂類為長鏈不飽和脂肪酸接上鞘氨醇(sphingosine)及磷酸形成鞘磷脂類(sphingolipids)主要為形成細胞膜的脂質雙層結構(Mashaghi, Jadidi et al. 2013)，而大量長鏈不飽和脂肪酸則可增加細胞

膜的流動性，以抵抗環境中溫度變化所造成之緊迫(stress) (Hsieh, Chen et al. 2003)。

而同樣的長鏈不飽和脂肪酸接上甘油而形成三酸甘油脂(triacyl-glycerol, TG)，作為生物體脂肪貯存之方式(Yen, Stone et al. 2008)，可做為生物體內除了以肝醣之外的另一種能量來源。

幾種非必須 (non-essential)但是卻非常重要的長鏈多元不飽和脂肪酸 (long-chain polyunsaturated fatty acids, LC-PUFAs)，包括花生四烯酸(arachidonic acid, AA), 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)，而生物體可將 ω6 及 ω3 系列的亞麻油酸(linoleic acid, LA) 及 α-次亞麻油酸 (α-inolenic acid, ALA)藉由生物體內的去飽和酶及延長酶(elongation of long chain fatty acids, ELOVL)合成出，但因為人體內缺乏 Δ-12 及 Δ-15 去飽和酶(Hastings, Agaba et al. 2001)，因此沒有辦法直接合成出 LA 及 ALA，必須依靠攝取食物作為 來源。LC-PUFAs 生合成過程是一連串複雜的蛋白交互作用，需要依靠細胞色素 b5 還原酶(cytochrome b5 reductase, CYB5R) (Elahian, Sepehrizadeh et al. 2012)以進行氧 化還原反應將輔酶 NADH 的電子傳遞至具有 heme-binding domain 的細胞色素 b5 蛋白(cytochrome b5 protein)、而細胞色素 b5 蛋白則為細胞色素 b5 還原酶與去飽和 酶之中間蛋白，在接受電子後再傳遞給去飽和酶(Guillou, D'Andrea et al. 2004)。細 胞色素 b5 蛋白為為 100 個胺基酸組成之小型微粒體蛋白(microsomal protein)，在 其蛋白碳端具有 30 個胺基酸組成的穿膜區域(Ozols 1989; M.A. Smith 1998)，其分布在細胞內的高基氏體、質膜(plasma membrane)、粒線體的外膜及微粒體的膜上 (D'Arrigo, Manera et al. 1993)。其功能為介於還原酶與去飽和酶之中間蛋白，將來自於還原酶之電子傳遞至去飽和酶以進行催化反應，包括脂肪酸去飽和作用及羥基化作用(hydroXylAtion) (Strittmatter, Spatz et al. 1974; M.A. Smith 1998)。而脂肪酸去飽和酶(fatty acids desaturase, FADS)及 ELOVL 則是直接針對 LC-PUFAs 進行催化反應的酵素(Qiu 2003; Chen, Luo et al. 2013)。

脂肪酸去飽和酶在細胞內並非只有單獨作用，除了會透過 CYB5R 傳遞電子進

行催化反應化，在細胞內還會與其他蛋白一起協同作用。例如：Man 等人於 2006 年以螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方式直接證明小鼠在三酸甘油脂生合成過程中，第一型硬脂醯基輔酶 A (Stearoyl-CoA-1, SCD-1)會與第二型雙醯基甘油醯基轉移酶(diglyceride acyltransferase-2, DGAT2)產生交互作用，而將去飽和後之脂肪酸接到雙醯基甘油(diacyl-glycerol)上進而產生三酸甘油脂(Man, Miyazaki et al. 2006)。

脂肪酸去飽和酶在去飽和化的反應過程中需要外源電子參與催化反應，而傳遞過程則需要 CYB5R 的協同作用。CYB5R 廣泛分布於細胞中，是一種 NADH 依賴型黃素還原酶(NADH-dependent flavin reductase)，所以 CYB5R 的電子來源需要仰賴輔酶 NADH 提供電子給 CYB5R (Iyanagi 1977)。CYB5R 除了參與脂肪酸去飽和作用，亦常見於粒線體電子傳遞鏈及肝臟微粒體細胞色素 P450 系統中 (Henderson, McLaughlin et al. 2013; Rodriguez-Bies, Navas et al. 2014)。CYB5R 分為膜結合型(membrane-bound form)與溶解型(soluble form)兩種形式，而其中膜結合型的 CYB5R 分子量較溶解型大，在蛋白序列上具有一小段約 3 kDa 的細胞膜附著區 (membrane anchor region)及約 30 kDa 的親水性催化反應區(hydrophilic catalytic region)，而溶解型 CYB5R 則只具有親水性催化反應區(Passon and Hultquis.De 1972;

Spatz and Strittmatter 1973)。

脂肪酸去飽和酶除了與這些蛋白協同作用外，在 LC-PUFAs 生合成途徑中也會與 ELOVL 共同作用。脂肪酸延長酶基因廣泛分布於各物種中，截至目前為止，

生物體至少發現 7 種 ELOVL 蛋白，而這 7 種 ELOVL 蛋白皆具有多重穿膜結構 (Szafer-Glusman, Giansanti et al. 2008)，在生物體內亦具有反應物專一性及組織專一性表現之特異性(Ohno, Suto et al. 2010)。在 ELOVL 的蛋白序列上，除了有高疏水性胺基酸所組成的穿膜區域，亦具有 1 個 Histidine-rich motifs，而在蛋白質序列 C 端則具有內質網訊息胜肽(ER signal peptide) (Leonard, Pereira et al. 2004)。ELOVL 在脂肪酸生合成代謝途徑中扮演將脂肪酸延長的功能，每次添加兩個碳至羧酸根

上(Leonard, Pereira et al. 2004)。脂肪酸生合成過程中，先會在粒線體內透過脂肪酸合成酶(fatty acid syhtase)作用而生合成至 16 個碳的長鏈脂肪酸(Stephens, Lee et al.

2007)，如果是在植物，則會生合成至 18 個碳的長鏈脂肪酸(Shintani and Ohlrogge 1994; Gueguen, Macherel et al. 2000)。再透過去飽和酶的協同作用，將脂肪酸不飽和化，再透過脂肪酸延長酶將長鏈不飽和脂肪酸延伸並合成出必需脂肪酸(Leonard, Pereira et al. 2004)。在近期的研究中指出，ω6 及 ω3 系列長鏈不飽和脂肪酸的延伸，

分別是透過 ELOVL2、ELOVL4、ELOVL5 及 ELOVL7 來完成，而長鏈飽和脂肪酸及ω9 系列長鏈不飽和脂肪酸，則分別是透過 ELOVL1、ELOVL3 及 ELOVL6 來完成，而 ELOVL7 則可以接受飽和類、ω9 及ω6 系列不飽和脂肪酸(Ohno, Suto et al. 2010)。

在 FADS 與 ELOVL 對脂肪酸進行催化反應步驟中，首先 LA 和 ALA 要透過輔酶 A 接合酶(CoA-ligase)轉化為亞麻油醯基輔酶 A (linoleic acyl-CoA)及 α-次亞麻油醯基輔酶 A (α-linoleic acyl-CoA)，第二步則透過具有Δ-6 催化活性的第二型脂肪酸去飽和酶(fatty acids desaturase-2, FADS2)催化 linoleic CoA 及 α-linoleic acyl-CoA ，分別轉變成 γ- 亞麻油酸（ γ-linolenic acid, GLA ）和十八碳四烯酸 (octadecatetraenoic acid, OTA）。而在經過延長酶的作用後，可在脂肪酸的羧酸根上延長兩個碳而形成二十個碳的ω6 及 ω3 系列的 PUFAs，而這些二十個碳的 LC-PUFAs 則可以藉由具有 Δ-5 催化活性的第一型脂肪酸去飽和酶 (fatty acids desaturase-1, FADS1)催化而分別產生 AA 及 EPA(Leonard, Pereira et al. 2004; Castro, Monroig et al. 2012)。DHA 生合成則需要以 EPA 為反應物，延長兩個碳形成二十

在文檔中金屬膜蛋白對碳氫化合物之代謝作用 (頁 14-26)