原核生物

將 XylM 及 XylA 基因序列轉譯為蛋白質序列，透過 CDD 分析，發現 XylM 蛋 白具有特定的胺基酸序列，且功能性被歸類為膜結合型類脂肪酸去飽和酶超級家 族 (Membrane-FADS-like super family)(圖二十 A)。在序列分析上可以發現 XylM 蛋 白序列與膜結合型脂肪酸去飽和酶相同，均具有三個組胺酸盒子 (Histidine box)，

分別為 HxxxH、HxxxHH 及 HxxHH (圖二十 C)，在先前已發表的研究中均指出只 有膜結合型的脂肪酸去飽和酶具有三個 Histidine box，而溶解型脂肪酸去飽和酶則 不具有這些盒子 (Thiede, Ozols et al. 1986; Stukey, McDonough et al. 1989; Yadav, Wierzbicki et al. 1993)。以定點突變的方式確認這三個 box 的組胺酸與催化反應有 直接相關性，在這 8 個組胺酸陸續被突變後，蛋白質立刻失去活性(Shanklin, Whittle et al. 1994)。

Xylene monooxygenase 與其他物種之蛋白質序列分析，發現與新鞘氨醇菌 (novosphingobium sp. PP1Y)的脂肪酸去飽和酶在胺基酸序列 (YP_004534277.1)上 有 56% 相似性，顯示 xylene monooxygenase 可能具有類似功能區域或可能接受同 樣 反 應 物 ( 圖 二 十 C) 。 與 同 樣 被 歸 類 於 脂 肪 酸 去 飽 和 酶 超 級 家 族 之 alkane monooxygenase 本身並不含有攜帶電子之區域，因此需要具有 FAD 及 NAD 結合位 的 XylA 將輔酶之電子(NADH)轉移給 xylene monooxygenase 本體(Buhler, Schmid et al. 2000)，當 XylM 與 XylA 蛋白結合在一起形成複合體，此時蛋白才具有活性反

應。在蛋白表現中，發現具有 T7 溶菌酶(T7 lysozyme)活性的表現宿主，其蛋白表 現量較低，因此實驗上選擇以表現量較多的 BL-21 (DE3)為實驗用菌株(圖二十一)。

在溶解型 xylene monooxygenase (Toluene-o-xylene monooxygenase, ToMo)的研究報 告已有指出，透過是否與吲哚發生反應，且產生藍色的顯色與否，作為蛋白質是否 有活性的初步鑑定與篩選(Rui, Reardon et al. 2005; Vardar, Ryu et al. 2005)。在 xylene monooxygenase 複合體以 IPTG 誘導表現過程中，發現菌液呈現藍色顯色反應，以 GC-MS 分析確認與吲哚發生反應。將細菌離心後可以發現菌塊為深藍色，顯示反 應物在經過 xylene monooxygenase 複合體反應後，其產物並不會離開菌體，而會留 存於細菌體中。

在活性分析部分，分別以苯環類、飽和烷烴類及不飽和烷烴類等化合物作為反 應起始物，其中苯環類化合物可被 xylene monooxygenase 複合體催化，且會在 1 號 碳位置發生反應(圖二十二)，但是若改以碳氫長鏈作為反應物，則出現飽和烷烴類 化合物完全不反應，而 2 號碳不飽合烷烴類化合物則會發生催化反應。以重組的 xylene monooxygenase 蛋白複合體催化苯環類化合物，在許多研究報告皆已證實 (Buhler, Schmid et al. 2000; Buhler, Witholt et al. 2002)。Buhler 等人在 2000 年，以 限制酶切割方式將假單孢菌之 TOL 質體中之 operon 啟動子(promoter)、XylM、

XylA 、 苯 甲 醇 去 氫 酶 (benzyl alcohol dehydrogenase, XylB) 、 苯 甲 醛 去 氫 酶 (benaldehyde dehydrogenase, XylC)及兩種尚未知悉功能之基因(XylN 及 XylW)接至 基因選質載體並於 E. coli JM101 中進行表現，並於活性分析中發現，以偏三甲苯 (pseudocumene)為反應物，可偵測到 3,4-雙甲基苯甲醇(3,4-dimethylbenzyl alcohol)、

3,4- 雙 甲 基 苯 甲 醛 dimethylbenzaldehyde) 及 3,4- 雙 甲 基 苯 甲 酸 (3,4-Dimethylbenzoic acid)，而推論 XylB 及 XylC 之功能(Buhler, Schmid et al. 2000)。

但在本研究中，BL-21 (DE3)表現的 xylene monooxygenase 蛋白複合體(XylM 與 XylA)即可在活性分析的實驗中以 GC-MS 偵測到醛類產生，而同時比較以苯環 類或不飽和烷烴類化合物皆可以 GC-MS 偵測到醇類與醛類產生，顯示醛類產生並

可能有其他功能，而並非早期研究所指出其具有苯甲醇去氫酶之功能。

此外，在以 toluene 與 p-xylene 為反應物之實驗組中，以 GC-MS 偵測到醛類 有發生更進一步催化反應，toluene 會產生 acetic acid phenylmethyl ester；而 p-xylene 則會產生 4-methylbenzyl acetate，顯示在反應過程發生乙醯化反應，接上一個乙醯 官能基形成酯化反應之產物。在 2014 年，Rodriguez 等人發表以 Escherichia coli 為 模式探討酯化反應相關報告，在 Escherichia coli 中產生酯化反應統稱為醋酸酯合 成途徑(acetate ester synthesis pathway)，但目前仍未有指出何種酵素參與其中。

Escherichia coli 的酯化反應是由醇類直接形成酯類，其反應物目前已知只有七種鏈 狀化合物及一種環狀化合物─苯乙醇(2-phenyl ethanol)，酯化反應之來源物則為乙 醯輔酶 A (acetyl CoA)、異丁醯輔酶 A (isobutyryl coA)及丁醯輔酶 A (butyryl CoA)，

而苯乙醇透過乙醯輔酶 A 進行酯化反應後即會產生乙酸苯乙酯(Phenethyl acetate) 供細菌使用(Rodriguez, Tashiro et al. 2014)。此結果顯示 Escherichia coli 的確有將帶 苯環之醇類進行催化反應分解之能力，而本實驗所呈現之結果顯示 toluene 與 p-xylene 經過 p-xylene monooxygenase 催化產生之 benzyl alcohol 及 4-methylbenzyl alcohol 可以被催化為 acetic acid phenylmethyl ester 及 4-methylbenzyl acetate (圖二 十二 A 及 D)。

苯環類化合物催化反應效率以 4-ethyl-toluene 的催化反應效率最高，可達到 95.4%；其次為 p-xylene，其催化反應效率為 91%，而 toluene 的催化反應效率為 87.5%，居四種苯環類化合物第三，styrene 的催化反應效率則最低，約為 45%左右 (表六)。在結構上可以區分為兩大類，一類為 1 號碳與 4 號碳位置均有接上官能基 (4-ethyl-toluene 及 p-xylene)，而另一類則是只有 1 號碳位置接上官能基(toluene 及 styrene)。在進行催化反應後之結果顯示，1 號碳與 4 號碳位置均有接上官能基之 化合物催化反應效率高於只有 1 號碳接上官能基之化合物(表六)，而 4 號碳位置接 上之官能基以乙基的 95.4%催化反應效率高於接上甲基的 91%催化反應效率(表六)。

此結果顯示在 xylene monooxygenase 的反應口袋(pocket)，只會針對苯環進行抓取 及穩定之動作，而苯環 4 號碳位置所攜帶之官能基大小並沒有直接顯著影響到催

化反應活性，顯示其反應口袋可能為圓筒狀，因此可容納在 4 號碳接上官能基之 了順式(cis-form)之外，xylene monooxygenase 複合體也會對 trans-form 不飽合烷烴 類化合物進行催化反應，但催化效果以 trans-form 優於 cis-form 不飽合烷烴類化合 物。 interactions) (Kawahara, Tsuzuki et al. 2004)。在 xylene monooxygenase 催化反應中，

Sazinsky 等人以溶解型 Toluene-o-xylene monooxygenase 為模式，透過蛋白結晶與 X-光繞射分析，以蛋白質立體結構探討 Toluene-o-xylene monooxygenase 與受質交 互作用為透過π-π stacking 交互作用的方式(Sazinsky, Bard et al. 2004)。

方式將氟取代氫合成出飽和 4 個碳之氟化物─ trifluoro butane，再以苯環類化合 物、飽和類化合物與不飽和類化合物之結果為模式，推論 xylene monooxygenase 催

化反應可能為 π 交互作用，反應物需要具有苯環或是雙鍵之構造才可與反應口袋

產生交互作用，但以合成出之 trifluoro butane 卻可以被 xylene monooxygenase 催化 成 trifluoro butanol (圖二十三 D)，顯示此化合物可被 xylene monooxygenase 反應口 袋抓取並穩定住，此結果證明 C-F 鍵結在反應口袋內確實可以取代苯環或是雙鍵 結構，與側鏈具有苯環之胺基酸進行 C-F/π 交互作用，此結果證明膜結合型 xylene monooxygenase 催化反應需要透過反應口袋內的胺基酸與反應物進行 π 交互作用。

以氟化物為反應物進行催化反應的相關實驗顯示，氟化物可以提高催化反應之專 一性(Ramu, Chang et al. 2011; Chiang, Ramu et al. 2013; Chen, Luo et al. 2014)。而於 本實驗亦可看到相同結果，同樣為飽和 4 碳化合物，butane 無法進行催化反應，而 trifluoro butane 則出現 18.8%的催化反應效率(表六)，且在催化反應後只有單獨產 生 trifluoro butanol，並沒有產生相對應之醛類，證明 trifluoro butane 可提高 xylene monooxygenase 的催化反應效率，亦可提高催化專一性。

而同屬於膜結合型脂肪酸去飽和酶家族之烷烴羥化酶也是屬於 ω-羥化反應 (ω-hydroXylAtion) (Ramu, Chang et al. 2011)。但烷烴羥化酶是接受飽和烷烴類化合 物，在結構上並沒有如同 xylene monooxygenase 可以抓住雙鍵的反應口袋，而是具 有抓取飽和烷烴類化合物的反應口袋，並在飽和烷烴類化合物末端碳進行羥基化 反應(Fish, Harbron et al. 1983; Belhaj, Desnoues et al. 2002; Shanklin and Whittle 2003)。

膜結合型脂肪酸去飽和酶的反應口袋可以抓取並穩定飽和、單一不飽和或多 重不飽和之烷烴類化合物。其中硬脂醯基輔酶 A 去飽和酶(Stearoyl-CoA Desaturase, SCD, Δ-9 Desaturase)可以 16 個碳(棕梠酸, 16:0)或是 18 個碳(硬脂酸, 18:0)飽和烷 烴類化合物為反應物，於 9 號碳位置形成雙鍵。但目前已有研究報告指出，在生成 共軛亞麻油酸(conjugated linoleic acids, CLA)的過程，是以反式-11 號碳或-12 號碳 之 18 碳單元不飽和脂肪酸(C18-trans-11 或 C18-trans-12 fatty acids)作為反應物 (Kraft, Hanske et al. 2006; Shanklin, Guy et al. 2009)，與早期研究認為 SCD 是以 16

個碳或是 18 個碳飽和烷烴類化合物為反應物不同(Ntambi 1999; Attie, Krauss et al. (Tyrosine, Tyr, Y)、苯丙胺酸(Phenylalanine, Phe, F)及色胺酸(Tryptophan, Trp, W)為 標的，透過圖二十 C 之四種蛋白與烷烴羥化酶比對蛋白序列(附圖三)，挑選具有可 能影響蛋白活性之色胺酸進行突變，以破壞 xylene monooxygenas 與受質之間的 π-π stacking 交互作用。在 W333A 突變型活性測試中，其催化反應在突變後仍然維 持在 81.8%，與 WT xylene monooxygenas 相比較只有降低 18.2% (表七) ，是三型 突變型中催化反應效率最佳者。W333A 突變型能將部分 toluene 轉化為 benzyl alcohol，少部分可以轉化為 benzaldehyde (圖二十四 C)，顯示其蛋白與受質之間的 交互作用雖然受影響，但影響幅度較小，其反應口袋仍然可以抓取到 toluene，但 是產物專一性之催化反應效率與 WT xylene monooxygenas 相比較卻明顯提升許多。

W333A 突變型 xylene monooxygenas 針對 toluene 轉化為 benzyl alcohol 與 WT xylene monooxygenas 相比較，其效率由 37.3%提升至 91.0%，而 benaldehyde 則由原先之 62.7%下降至 8.99%，此突變點結果證明 xylene monooxygenas 有產物催化專一性。

在圖二十二與表六之結果證明，xylene monooxygenas 可將 toluene 催化而依序產生

並穩定 toluene，同時還會抓取及穩定 benzyl alcohol。而 W333A 之位置在 xylene monooxygenas 穿膜構造區外(圖三十 A)，但與推測由組胺酸盒子鰲合鐵所形成的 雙鐵反應中心接近(圖三十 B)，而整體催化反應只有降低 18.1%，但 benzaldehyde 產量卻只剩下 8.99%，顯示 W333A 其作用有兩種可能：一為直接影響 benzyl alcohol 在反應口袋的穩定度，而 benzyl alcohol 無法被反應口袋穩定，因此在 benzyl alcohol 生 成 後 便 離 開 反 應 口 袋 而 造 成 benzaldehyde 催 化 反 應 效 率 較 WT xylene monooxygenas 下降 87.5%。另一可能為 W333A 為醛類催化反應中心附近關鍵胺基 酸，由於色胺酸被突變為丙胺酸(Alanine, A)而造成胺基酸性質劇烈改變進而影響 結構穩定性，造成醛類催化反應效率大量降低。

在 W321A 突變型 xylene monooxygenas 的活性測試中，對 toluene 的催化反應 效率只剩下 26.5%，顯示 W321 之色胺酸與 xylene monooxygenas 催化反應活性明 顯有直接相關性，在催化反應之產物則發現能將極少部分 toluene 轉化為 benzyl alcohol，完全沒有 benzaldehyde 的產生(圖二十四 B)。而 W321 的位置在 xylene monooxygenas 第四個穿膜序列(胺基酸 304 到 326, 圖三十 A)中，其二級結構構型 為α-螺旋(α-helix)，座落位置靠近推測由組胺酸盒子鰲合鐵形成之雙鐵反應中心。

由此結果可證明 W321 為 xylene monooxygenas 催化反應過程中，W321 側鏈上的 苯環結構在反應口袋內與 toluene 的苯環產生 π-π 交互作用(圖三十 B)，進而達到 穩定 toluene 使催化反應能進行而產生 benzyl alcohol。Xylene monooxygenas 的 4 個穿膜構造在結構與功能上可能類似於烷烴羥化酶 6 個穿膜區域形成之疏水性口 袋(hydrophobic pocket)可以抓取並穩定反應物(Rojo 2005; Chen 2013)。而在穿膜區 域內，且為具有π-π stacking 交互作用的 W321，作用相類似於烷烴羥化酶之 W55，

極可能提供重要的非共價性π交互作用，調整反應物之位向，以達成高專一性的催

極可能提供重要的非共價性π交互作用，調整反應物之位向，以達成高專一性的催