金屬膜蛋白對碳氫化合物之代謝作用

國立臺灣大學生命科學院漁業科學研究所 博士論文

Institute of Fisheries Science College of Life Science National Taiwan University

Doctoral dissertation

金屬膜蛋白對碳氫化合物之代謝作用

Metabolism of Hydrocarbon Compounds By Membrane- Bound Metalloenzymes

陳耀甥 Yao-Sheng Chen

指導教授：張繼堯 博士 俞聖法 博士

Advisor: Chi-Yao Chang, Ph.D.

Steve, Sheng-Fa Yu, Ph.D.

中華民國 103 年 6 月

June 2014

謝辭

因為興趣而走上了這條漫長的研究生涯，「靜海造就不出好的水手」這句話支 持著我渡過每道難關，翻開過去的年少歲月，青澀的研究理念在師長的指導下逐漸 蛻變成熟，從陌生到逐漸熟悉，慢慢開啟對研究的熱誠。在八年的博士班歲月，首 先感謝我的指導教授張繼堯博士及俞聖法博士，給予學術研究上的環境與指導，讓 我能從中摸索與學習到學術研究的精神與可貴之處，培養出對實驗的執著與毅力，

並在良師的諄諄教誨與督促下，使完成本論文。

特別感謝口試委員：中央研究院化學所鄒德里博士，國立臺灣大學漁業科學研 究所廖文亮博士及國立臺灣海洋大學生物科技研究所林富邦博士，對論文詳細的 審閱與訂正、並在百忙親臨指導，由於教授的的不吝指正與惠賜寶貴的意見，使本 論文內容更趨完整。

實驗的生活是單純卻又忙碌，過程的滋味點滴在心頭。感謝中央研究院細胞與 個體生物研究所及化學研究所實驗室的每一位同仁，在實驗上給予指導與協助，提 供許多實驗技巧與注意細節，在我碰到瓶頸時得以順利解決，讓我受益良多。

最後將這篇論文獻給親愛家人，感謝父親與母親在背後默默的支持，讓我能專 心的進行研究以完成本論文，感謝姐姐與妹妹在生活上的鼓勵與祝福，因為你們的 成全使我能全心全力投注在研究生活中，並順利完成博士學位，在此獻上衷心的祝 福與感謝。

摘要

金屬酵素為生物體細胞中重要的催化反應酵素，而其中又以帶有非血基質雙 鐵中心的蛋白最為重要。第三類型非血基質雙鐵中心金屬酵素包括膜結合型脂肪 酸去飽和酶超級家族之蛋白，對環狀、飽和烷烴類及不飽和烷烴類化合物進行去飽 和及單加氧催化反應。

斑馬魚 Δ-5/Δ-6 脂肪酸去飽和酶(Z-FADS)在長鏈不飽和脂肪酸( long-chain polyunsaturated fatty acids, LC-PUFAs)催化與生合成過程中扮演重要角色。以螢光 共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)證明斑馬魚 Z-FADS 蛋 白會與第二及第三型細胞色素 b5 還原酶(cytochrome b5 reductase, CYB5R2 及 CYB5R3)及四種延長酶(elongation of very long chain fatty acids, ELOVL, ELOVL2, 4, 5 及 7)產生交互作用。將斑馬魚 fads、elovl2、elovl4 及 elovl5 基因同時轉染至 HeLa 細胞，以α-次亞麻油酸(α-linolenic acid, ALA)為反應起始物，以氣相層析圖譜分析 法，證明斑馬魚ω3 系列長鏈不飽和脂肪酸生合成過程中，特別是 DHA 及 EPA 的 生合成需要 Z-FADS、ELOVL5、ELOVL2 及 ELOVL4 的協同作用。此外以西方墨 點法及免疫螢光染色分析，也證明斑馬魚 Z-FADS 除了在內質網表現外，亦會存在 於細胞的粒線體中。為了瞭解金屬酵素之催化反應機制，以同屬於膜結合型脂肪酸 去飽和酶超級家族之原核生物蛋白─二甲苯單加氧酶為模式進行研究。免疫共沉 澱法及免疫金標誌分析證明，在催化反應過程中，還原酶會與催化酵素本體結合而 形成複合體，而未形成複合體之電子傳遞本體會出現在細胞質中靠近細胞膜處，且 證明在催化過程中，催化酵素本體與電子傳遞本體比例不等量，催化酵素本體多於 電子傳遞本體。以二甲苯單加氧酶對反應物催化活性分析，證明二甲苯單加氧酶除 了會催化苯環類化合物，亦會對短鏈不飽和烷烴類化合物進行催化反應，而含氟化 合物更證明，含氟化合物更可改善催化反應效率。

本論文同時以真核及原核生物之膜結合型脂肪酸去飽和酶為研究主軸，分析 金屬酵素在催化反應過程中，反應口袋與反應物之間的交互作用。證明斑馬魚 Z-

FADS 在 DHA 及 EPA 生合成過程中所扮演之角色，同時透過二甲苯單加氧酶為模 式更證明，疏水性反應口袋可有效的對不同反應物進行特定部位的催化反應。

關鍵字：金屬酵素、膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族、長鏈多重不飽和脂肪酸、

脂肪酸去飽和酶、延長酶、二甲苯單加氧酶

Abstract

The membrane metallo-proteins (MMPs) are important catalytic enzyme in organism, particularly the non-heme diiron containing proteins. Membrane-bound fatty acids desaturase superfamily proteins (membrane-FADS superfamily proteins) are classified into type Ⅲ non-heme diiron center proteins that catalyze desaturation and/or monooxygenation in hydrocarbons including aromatics, saturated and unsaturated.

ZebrafishΔ-5/Δ-6 fatty acid desaturase (Z-FADS) catalyzes cascade synthesis of long- chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) and plays pivotal roles in many biological functions. In this study, we deployed the technique of fluorescence resonance energy transfer (FRET) to examine the protein-protein interactions between Z-FADS and cytochrome b5 reductases (CYB5R1-3), elongases 2, 4, 5, 7 (elongation of very long chain fatty acids, ELOVL), respectively and the results indicated that, in endoplasmic reticulum (ER), the Z-FADS can be in close proximity to CYB5R2, 3, and ELOVL protein family, including ELOVL2, 4, 5 and 7, respectively. Furthermore, in the gas chromatography analysis, we proved that the HeLa cells co-transfected with fads, elovl2, 4 and 5 catalyze α-linolenic acid to ω 3-series LC-PUFAs, especially the docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA). Additional data from immuno-fluorescence cytochemistry (IFC) and Western blotting studies demonstrated that Z-FADS also resides in the mitochondria of zebrafish fads transfected HeLa cells.

Our results implicated that Z-FADS, the sole fatty acid desaturase ever been identified in zebrafish, can serve as a universal fatty acid desaturase for the whole lipogenesis process.

Xylene monooxygenase (XylM), a non-heme diiron monooxygenase from the prokaryotic system, Pseudomonas putida mt-2, can catalyze toluene to benzyl alcohol and xylene to 4-methylbenzyl alcohol. An E. coli system heterogeneously transformed with part of an TOL operon including the overexpression of XylM and its partner protein

of oxidoreductase, XylA, is constructed for its application of whole-cell catalysis. The protein expressions of XylM and XylA in this system are verified by the studies of Western blotting analysis, co-immune-precipitation as well as transmission electron microscopy (TEM) with immune-gold staining experiments. Several substrates including fluorinated butane are designed to study their enzymatic activities. Our results indicated that the aromatic residue(s) within this metalloprotein play important roles for its controlled hydroxylation.

In overall, I exploited both the eukaryotic and prokaryotic membrane-bound non-heme iron proteins including FADS superfamily as my target proteins and pave my way towards understanding the role of Z-FADS on DHA and EPA biosynthesis in Zebrafish as well as showing the promiscuity of hydrophobic pocket in xylene monooxygenase can efficiently achieve selective oxidations in a variety of substrates.

Key Words：membrane-metalloprotein、membrane-bound fatty acid desaturase superfamily、long-chain polyunsaturated fatty acids、fatty acid desaturase、elongase、

xylene monooxygenase

目 錄

中文摘要………....i

英文摘要………..iii

目錄………...v

圖目錄………..ix

表目錄………..xi

第一章、 前言………...1

第二章、 材料與方法 2.1 實驗材料……….………..….13

2.1.1 實驗物種……….………..….13

2.1.2 實驗菌種……….………..….13

2.1.3 實驗細胞……….………...13

2.1.4 實驗質體……….………..….13

2.1.5 實驗溶液……….………...13

2.1.6 實驗生物培養…..……….……….16

2.2 實驗方法：真核生物……….……18

2.2.1 斑馬魚總體 RNA (Total RNA) 萃取與互補 DNA 合成…………..18

2.2.2 斑馬魚脂肪酸去飽和酶、延長酶及細胞色素 b5 還原酶 (CYB5R) 選殖、序列分析與載體構築………..18

2.2.3 細胞轉染(Transfection)與免疫螢光染色分析(Immunofluorescence cytochemistry, IFC)………...………..24 2.2.4 螢光共振能量轉移 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 及 ELOVLs 穿膜構造分析...………..25 2.2.5 Z-FADS 在 HeLa 細 胞 內 表 現 與 定 位 分 析 (Subcellular localization)………...27 2.2.6 DHA 及 EPA 生物合成與脂肪酸甲酯 (Fatty acid methyl ester)分 析……… 29 2.3 實驗方法：原核生物……….……….31 2.3.1 假單孢菌基因體 DNA (Genomic DNA)萃取………….….……….31 2.3.2 二甲苯單加氧酶(Xylene monooxygenase, xylM)及其電子傳遞蛋白 (Xylene monooxygenase electron transfer component, xylA)之選殖、基因 分析與共同表現載體構………...………..31 2.3.3 pACYC-Duet-1-XylA-XylM 共同表現載體誘導表現分………….32 2.3.4 二甲苯單加氧酶複合體(xylene monooxygenase complex)蛋白活性 分析………...………..33 2.3.5 定點突變 (Site-directed mutagenesis, SDM)………...……….34 2.3.6 xylM 及 xylA 蛋白之西方墨點分析 (Western blotting)與免疫共沉 澱試驗(Co-Immunerecipitation assay)………...………35

labelling) ………...…………..37

第三章、 結果

3.1 真核生物

3.1.1 斑馬魚脂肪酸去飽和酶 (Z-FADS)、延長酶(ELOVLs)及細胞色素

b5 還原酶(CYB5R)之序列分析與表現載體構築………..38

3.1.2 Z-FADS、CYB5R 和 ELOVL 在轉染後 HeLa 細胞中的表現觀 察………...41

3.1.3 螢光共振能量轉移分析………...49

3.1.4 ELOVL2、ELOVL4、ELOVL5 及 ELOVL7 膜蛋白之穿膜結構分 析……….…………..53

3.1.5 Z-FADS 在細胞內表現與胞器定位分析………56

3.1.6 DHA 及 EPA 生物合成與脂肪酸甲酯分析………58

3.2 原核生物

3.2.1 Xylene monooxygenase complex 序列分析………61 3.2.2 Xylene monooxygenase 蛋白質複合體共同表現載體構築與蛋白

質誘導表現分析…….………..64 3.2.3 Xylene monooxygenase 蛋白質複合體活性分析………65 3.2.4 Xylene monooxygenase 蛋白質複合體定點突變分析………70 3.2.5 Xylene monooxygenase complex 西方墨點分析與免疫共沉澱試

驗………..……….………73

3.2.6 Xylene monooxygenase complex 免疫金標誌分析……….…75

第四章、 討論 4.1 真核生物……….………...78

4.2 原核生物……….…………...88

第五章、 結論………...100

第六章、 參考文獻………...102

附圖………...116

圖目錄

圖一、Z-FADS 與小鼠及人類第一型(FADS1)、第二型(FADS2)及第三型(FADS3)去 飽和酶蛋白質序列比分析...38 圖二、斑馬魚細胞色素 b5 還原酶蛋白質序列相似性分析………..…..40 圖三、斑馬魚 ELOVL2、ELOVL4、ELOVL5 及 ELOVL7 蛋白質序列相似性分析…41 圖四、DsRed-CYB5R1 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….42 圖五、DsRed-CYB5R2 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….42 圖六、DsRed-CYB5R3 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….43 圖七、DsRed-ELOVL2 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….43 圖八、DsRed-ELOVL4 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….44 圖九、DsRed-ELOVL5 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….44 圖十、DsRed-ELOVL7 分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS-EGFP 螢光表現分析….45 圖十一、ELOVL2 蛋白表現、免疫螢光染色及分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS- EGFP 之螢光表現分析………...46 圖十二、ELOVL4 蛋白表現、免疫螢光染色及分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS- EGFP 之螢光表現分析………...………47 圖十三、ELOVL5 蛋白表現、免疫螢光染色及分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS- EGFP 之螢光表現分析………...………48 圖十四、ELOVL7 蛋白表現、免疫螢光染色及分別與 EGFP-Z-FADS 及 Z-FADS- EGFP 之螢光表現分析………...………49 圖十五、斑馬魚 Z-FADS 蛋白與 CYB5R 及 ELOVL 蛋白螢光共振能量轉移分析….52 圖十六、His-ELOVLs-FLAG 融合蛋白穿膜構造分析…..……….54 圖十七、His-ELOVLs-FLAG 融合蛋白 HeLa 細胞內的免疫螢光染色分………….55 圖十八、斑馬魚 Z-FADS 於 HeLa 細胞內表現與胞器定位分析……….58 圖十九、DHA 及 EPA 生物合成與脂肪酸甲酯分析………59

圖二十、Pseudomonas putida mt-2 XylM 與 XylA 蛋白序列保守區資料庫比對 (Conserved Domains Database, CDD)，及以 MEGA5 進行蛋白質序列相似性分析…63 圖二十一、 pACYC-Duet-1-XylA-XylM 共同表現質體於不同宿主細胞蛋白表現分 析……….………64 圖二十二、苯環類化合物以 xylene monooxygenase 作用產生相對應之羥基化產 物……….66 圖二十三、不飽和烷烴類化合物經 xylene monooxygenase 作用產生的相對應之羥 基化產物……….………69 圖二十四、Wild type 與突變型 xylene monooxygenase 與 Toluene 反應之 GC-MS 圖 譜……….71 圖二十五、XylM-His 與 XylA-FLAG 蛋白質西方墨點分析……….……73 圖二十六、Xylene monooxygenase complex 以 anti-His tag 抗體進行免疫共沉澱分 析……….74 圖二十七、XylA-FLAG 蛋白於 BL-21 (DE3)表現部位之免疫金標誌分析…………75 圖二十八、XylM-His 蛋白於 BL-21 (DE3)表現部位之免疫金標誌分析………77 圖二十九、斑馬魚ω3 及 ω6 系列脂肪酸生合成途徑圖…..………..………….87 圖三十、XylM 蛋白穿膜構造拓譜(topology)預測與定點突變相對位置圖…………96

表目錄

表一、斑馬魚 fads、elovl 及 cyb5r 基因之 PCR 引子對與 PCR 片段之相對應質體，

英 文 字 母 下 方 線 條 代 表 限 制 酶 切 位 ， 雙 重 下 方 線 條 表 示 為 額 外 增 加 之 序

列……….……21

表二、pACYC-Duet1-XylM-XylA 表現質體構築之引子對………..…….32

表三、Xylene monooxygenase 複合體活性分析之反應物總表………34

表四、XylM 定點突變之引子……….35

表五、斑馬魚 Z-FADS 蛋白與 CYB5R 及 ELOVL 蛋白螢光共振能量轉移及螢光基 團距離……….52

表六、二甲苯單加氧酶複合體對苯環類化合物、不飽和烷烴類化合物及飽和類氟化 物催化反應效率……….70

表七、二甲苯單加氧酶 W321A、W333A 及 W355A 定點突變針對甲苯之催化效率 分析………...………..73

第一章、 前言

生物體存在著許多蛋白各司其職，而這些蛋白中有 47%的蛋白是金屬蛋白 (metalloproteins)，而有 41%是由其組成活性反應中心(Waldron, Rutherford et al.

2009)，除了有常見的主元素族中的鈣、鈉、鉀及鎂，亦有不少過度金屬元素，而 這些過度金屬元素具備多種氧化態，其主要功能作為基質催化及電子傳遞之功用。

而在基質催化反應中，具有催化反應能力的金屬多數為鎂離子(約佔了 16%左右)，

其次為鐵、鋅及錳(大約佔了 6-9%間)，銅離子最為稀少，約只佔了 1%。但其中 81%

的鐵與 93%的銅均肩負了氧化還原反應的重要角色(Waldron, Rutherford et al. 2009)，

這些金屬離子鰲合在蛋白之活性反應中心，形成催化反應部位而針對反應物進行 催化，而這類型鰲合金屬的蛋白質依照表現位置又可區分為膜結合型與溶解型兩 種。

Shanklin 等人依據胺基酸序列比對而將雙鐵酵素區分為三大類群(Shanklin, Whittle et al. 1994)。其中第一類與第二類的區別在於活性反應中心的組胺酸鰲合兩 個鐵原子，而在鐵原子中間的軸線(diiron axis)與蛋白結構內的四個螺旋束(four- helix bundle)垂直與平行，互相垂直為第一類，平行則為第二類。代表性蛋白分別 為第一類為具有氧分子結合(O2-binding)功能之蛋白，包括血紅素(hemerythrin)及肌 紅蛋白(myohemerythrin)及第二類為具有氧氣活性功能(O2-activating enzyme)之核 糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase)，溶解型脂肪酸去飽和酶 (soluble form desaturase)及溶解型甲烷單加氧酶(soluble methane monooxygenase, sMMO)。第三類 為膜結合型脂肪酸去飽和酶，其序列與第一類及第二類明顯不同，主要為 8 個組 胺酸所組成的序列鰲合兩個鐵離子形成活性反應中心：Hx(3 or 4)Hx(20-50)Hx(2 or 3)HHx100-200)Hx(2 or 3)HH。這一類的蛋白除了已知的膜結合型脂肪酸去飽和酶 外 ， xylene monooxygenase 及 烷 烴 羥 化 酶 (alkane hydroxylase, AlkB)(Shanklin, Whittle et al. 1994; Broadwater, Haas et al. 1998)。

這三大類具有雙鐵反映中心的蛋白第一類為包括蚯蚓血紅蛋白(hemerythrin) 或蚯蚓肌紅蛋白(myohemerythrin)這類型的氧氣結合蛋白(O2-binding proteins)，透 過 5 個組胺酸(Histidine, His, H)側鏈上的咪唑環(imidazole ring)及 1 個白胺酸 (Leucine, Leu, L)側鏈上的羧酸官能基(-COOH group)穩定雙鐵結構形成其活性反應 中心，而穀胺酸(Glutamate, Glu, E)及天門冬胺酸(Aspatate, Asp, D)側鏈上帶負電的 羧酸根離子(-COO^- )則與雙鐵中心上、下配位形成作用力；第二類為包括原核生物 的甲烷單加氧酶(methane monooxygenase)及溶解型Δ9-脂肪醯基質體蛋白去飽和酶 (Δ9-acyl-ACP desaturase)這類型的氧氣活化酵素(O2-activating enzymes)，透過 2 個 組胺酸側鏈上的咪唑環、4 個穀胺酸側鏈上帶負電的羧酸根離子及 2 個水分子共同 穩定雙鐵結構形成其活性反應中心；而第三類則為具有數個穿膜構造的膜結合型 脂 肪 酸 去 飽 和 酶 家 族 (membrane-bound fatty acids desaturase family) 之 蛋 白 (Broadwater, Haas et al. 1998)。此家族蛋白的活性反應中心目前尚未有明確的結構 解析出(圖解一)，只知道透過此蛋白高保守區之組胺酸鰲合雙鐵形成反應中心，但 有多少個組胺酸共同參與，是否有其他胺基酸協同，目前仍未有定論(Broadwater, Haas et al. 1998; Lange and Que 1998; Martin, Oh et al. 2007; Shanklin, Guy et al. 2009)。

圖解一、三類型非血基質雙鐵中心(non-heme diiron center)。第一類為包括蚯蚓血紅 蛋白及蚯蚓肌紅蛋白這類型的氧氣結合蛋白；第二類為包括核苷酸還原酶 R2 次單

位、原核生物的甲烷單加氧酶及溶解型Δ9-脂肪醯質體蛋白去飽和酶等，這類型的

氧氣活化酵素；第三類為具有數個穿膜構造的膜結合型脂肪酸去飽和酶家族之蛋

白(Broadwater, Haas et al. 1998)。

膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族其活性反應中心被歸類為第三類型非血基 質雙鐵中心，此類型蛋白目前已知包括有：1. 去飽和酶類型：包括高等植物、哺 乳動物、昆蟲、真菌及藍綠藻的脂肪醯基去飽和酶(fatty acyl desaturase) (Shanklin, Whittle et al. 1994)； 2. 真核生物膜結合型羥化酶類型：此類型目前只有蓖麻 (Ricinus communis)所特有之油酸-12 羥化酶(oleate 12-hydroxylase) (Vandeloo, Broun et al. 1995)；3.原核生物膜結合型羥化酶類型：此類型蛋白包括兩種，(1)具有 OCT 質體(OCT plasmid)的菌種，此質體可轉譯出烷烴羥化酶(alkane hydroxylase, AlkB) (Kok, Oldenhuis et al. 1989)，(2)具有 TOL 質體(TOL plasmid)的菌種，此質體可轉 譯出二甲苯單加氧酶(xylene monooxygenase, XylM) (Suzuki, Hayakawa et al. 1991;

Harayama, Kok et al. 1992)。

而其他具有此反應中心卻不屬於膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族之蛋白，

則包括有：酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及根内球囊霉(Glomus intraradices)的 固醇甲基氧化酶(sterol methyl oxidase) (Bard, Bruner et al. 1996; Oger, Ghignone et al.

2009)，阿拉伯芥(Arabidopsis)的醛類脫羧酶(aldehyde decarboXylAse) (Aarts, Keijzer et al. 1995)。這些蛋白最大的特徵為都具有富含組胺酸之區域(Histidine-rich motifs)，

同時也皆為具有多重穿膜結構之膜蛋白(Broadwater, Haas et al. 1998)。

帶有非血基質雙鐵中心的蛋白在催化反應過程中，皆需要有外源電子提供至 蛋白質本體才可進行催化作用，這些外源電子來自於輔酶(co-enzyme)，輔酶依來源 不同分為煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)及煙醯 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH) (Shaw and Harayama 1992; Broadwater, Haas et al. 1998; Tshuva, Lee et al. 2002; Behan and Lippard 2010)，而這些輔酶在傳遞過程中，需要透過具有黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)之還原酶進行氧化還原作用，將輔酶之電子傳遞至具有

電子傳遞功能之中間蛋白，最後再傳遞至蛋白質本體。這些中間蛋白則有許多種形 式，包括：具有血基質結合位(heme-binding domain)的細胞色素 b5 蛋白(cytochrome b5 protein) (Schenkman and Jansson 2003)、具有 4 個胱氨酸(cysteine, Cys, C)鰲合單 鐵離子(Fe(S-cys)4)形成氧化還原中心(redox center)的紅素氧還原蛋白(rubredoxin) (Bau, Rees et al. 1998)、具有 4 個胱氨酸鰲合鐵離子，而鐵離子同時鰲合硫而形成 鐵硫簇之結構(iron-sulfer cluster)以形成氧化還原中心的鐵氧還原蛋白(ferredoxin) (Kurisu, Kusunoki et al. 2001) ， 其 鐵 硫 簇 配 位 方 式 又 可 分 為 二 鐵 二 硫 (2Fe-2S) (Armengaud, Sainz et al. 2001)、三鐵四硫(3Fe-4S) (Nielsen, Harris et al. 2004)及四鐵 四硫(4Fe-4S) (Fukuyama, Matsubara et al. 1989)三種。

這些蛋白質在進行催化過程中的反應物是皆由碳、氫及氧所形成不同類型之 化合物所組成。自然界與生物體中帶有大量的碳氫化合物，除了可分解以作為能量 的來源或儲存，亦可作為生物體組成之部分(Prenafeta-Boldu, Kuhn et al. 2001; van Beilen, Li et al. 2003; Wentzel, Ellingsen et al. 2007)。碳氫類化合物為有機化合物之 一種，可再細分為烷烴、烯烴、炔烴、環烴及芳香烴，而其中烷烴與芳香烴，與日 常生活息息相關，包括自石油中提煉的汽油、柴油、煤油及天然氣，以及化工方面 常使用之甲苯、乙苯及苯乙烯等等。而其中不飽和類之烯烴，則以末端帶有羧酸根 之長鏈不飽和脂肪酸被討論最多，其分類上以甲基端為 1 號碳開始計算，於第一 個雙鍵位置之碳數而區分為ω3、ω6 及ω9 系列脂肪酸。

在自然界之生物，特別是脊椎動物，其生長發育過程中需要大量不同來源之營 養物質，而長鏈不飽和脂肪酸則為發育過程中不可或缺的營養物，特別是腦部與眼 部的發育(Uauy, Hoffman et al. 2001; Uauy and Dangour 2006)。長鏈不飽和脂肪酸除 了提供發育過程中所需，對於在生物體的結構形成與能量貯存也扮演重要角色，生 物體內脂質分為兩大類，分別為磷脂類與甘油脂類。磷脂類為長鏈不飽和脂肪酸接 上鞘氨醇(sphingosine)及磷酸形成鞘磷脂類(sphingolipids)主要為形成細胞膜的脂 質雙層結構(Mashaghi, Jadidi et al. 2013)，而大量長鏈不飽和脂肪酸則可增加細胞

膜的流動性，以抵抗環境中溫度變化所造成之緊迫(stress) (Hsieh, Chen et al. 2003)。

而同樣的長鏈不飽和脂肪酸接上甘油而形成三酸甘油脂(triacyl-glycerol, TG)，作為 生物體脂肪貯存之方式(Yen, Stone et al. 2008)，可做為生物體內除了以肝醣之外的 另一種能量來源。

幾種非必須 (non-essential)但是卻非常重要 的長鏈多元不飽和脂肪酸 (long- chain polyunsaturated fatty acids, LC-PUFAs)，包括花生四烯酸(arachidonic acid, AA), 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)，而生物體可將 ω6 及 ω3 系列的亞麻油酸(linoleic acid, LA) 及 α-次亞麻油酸 (α-inolenic acid, ALA)藉由生物體內的去飽和酶及延長酶(elongation of long chain fatty acids, ELOVL)合成出，但因為人體內缺乏 Δ-12 及 Δ-15 去飽和酶(Hastings, Agaba et al. 2001)，因此沒有辦法直接合成出 LA 及 ALA，必須依靠攝取食物作為 來源。LC-PUFAs 生合成過程是一連串複雜的蛋白交互作用，需要依靠細胞色素 b5 還原酶(cytochrome b5 reductase, CYB5R) (Elahian, Sepehrizadeh et al. 2012)以進行氧 化還原反應將輔酶 NADH 的電子傳遞至具有 heme-binding domain 的細胞色素 b5 蛋白(cytochrome b5 protein)、而細胞色素 b5 蛋白則為細胞色素 b5 還原酶與去飽和 酶之中間蛋白，在接受電子後再傳遞給去飽和酶(Guillou, D'Andrea et al. 2004)。細 胞色素 b5 蛋白為為 100 個胺基酸組成之小型微粒體蛋白(microsomal protein)，在 其蛋白碳端具有 30 個胺基酸組成的穿膜區域(Ozols 1989; M.A. Smith 1998)，其分 布在細胞內的高基氏體、質膜(plasma membrane)、粒線體的外膜及微粒體的膜上 (D'Arrigo, Manera et al. 1993)。其功能為介於還原酶與去飽和酶之中間蛋白，將來 自於還原酶之電子傳遞至去飽和酶以進行催化反應，包括脂肪酸去飽和作用及羥 基化作用(hydroXylAtion) (Strittmatter, Spatz et al. 1974; M.A. Smith 1998)。而脂肪酸 去飽和酶(fatty acids desaturase, FADS)及 ELOVL 則是直接針對 LC-PUFAs 進行催 化反應的酵素(Qiu 2003; Chen, Luo et al. 2013)。

脂肪酸去飽和酶在細胞內並非只有單獨作用，除了會透過 CYB5R 傳遞電子進

行催化反應化，在細胞內還會與其他蛋白一起協同作用。例如：Man 等人於 2006 年以螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方式直接證 明小鼠在三酸甘油脂生合成過程中，第一型硬脂醯基輔酶 A (Stearoyl-CoA-1, SCD- 1)會與第二型雙醯基甘油醯基轉移酶(diglyceride acyltransferase-2, DGAT2)產生交 互作用，而將去飽和後之脂肪酸接到雙醯基甘油(diacyl-glycerol)上進而產生三酸甘 油脂(Man, Miyazaki et al. 2006)。

脂肪酸去飽和酶在去飽和化的反應過程中需要外源電子參與催化反應，而傳 遞過程則需要 CYB5R 的協同作用。CYB5R 廣泛分布於細胞中，是一種 NADH 依 賴型黃素還原酶(NADH-dependent flavin reductase)，所以 CYB5R 的電子來源需要 仰賴輔酶 NADH 提供電子給 CYB5R (Iyanagi 1977)。CYB5R 除了參與脂肪酸去飽 和 作 用 ， 亦 常 見 於 粒 線 體 電 子 傳 遞 鏈 及 肝 臟 微 粒 體 細 胞 色 素 P450 系 統 中 (Henderson, McLaughlin et al. 2013; Rodriguez-Bies, Navas et al. 2014)。CYB5R 分為 膜結合型(membrane-bound form)與溶解型(soluble form)兩種形式，而其中膜結合型 的 CYB5R 分子量較溶解型大，在蛋白序列上具有一小段約 3 kDa 的細胞膜附著區 (membrane anchor region)及約 30 kDa 的親水性催化反應區(hydrophilic catalytic region)，而溶解型 CYB5R 則只具有親水性催化反應區(Passon and Hultquis.De 1972;

Spatz and Strittmatter 1973)。

脂肪酸去飽和酶除了與這些蛋白協同作用外，在 LC-PUFAs 生合成途徑中也 會與 ELOVL 共同作用。脂肪酸延長酶基因廣泛分布於各物種中，截至目前為止，

生物體至少發現 7 種 ELOVL 蛋白，而這 7 種 ELOVL 蛋白皆具有多重穿膜結構 (Szafer-Glusman, Giansanti et al. 2008)，在生物體內亦具有反應物專一性及組織專 一性表現之特異性(Ohno, Suto et al. 2010)。在 ELOVL 的蛋白序列上，除了有高疏 水性胺基酸所組成的穿膜區域，亦具有 1 個 Histidine-rich motifs，而在蛋白質序列 C 端則具有內質網訊息胜肽(ER signal peptide) (Leonard, Pereira et al. 2004)。ELOVL 在脂肪酸生合成代謝途徑中扮演將脂肪酸延長的功能，每次添加兩個碳至羧酸根

上(Leonard, Pereira et al. 2004)。脂肪酸生合成過程中，先會在粒線體內透過脂肪酸 合成酶(fatty acid syhtase)作用而生合成至 16 個碳的長鏈脂肪酸(Stephens, Lee et al.

2007)，如果是在植物，則會生合成至 18 個碳的長鏈脂肪酸(Shintani and Ohlrogge 1994; Gueguen, Macherel et al. 2000)。再透過去飽和酶的協同作用，將脂肪酸不飽 和化，再透過脂肪酸延長酶將長鏈不飽和脂肪酸延伸並合成出必需脂肪酸(Leonard, Pereira et al. 2004)。在近期的研究中指出，ω6 及 ω3 系列長鏈不飽和脂肪酸的延伸，

分別是透過 ELOVL2、ELOVL4、ELOVL5 及 ELOVL7 來完成，而長鏈飽和脂肪 酸及ω9 系列長鏈不飽和脂肪酸，則分別是透過 ELOVL1、ELOVL3 及 ELOVL6 來 完成，而 ELOVL7 則可以接受飽和類、ω9 及ω6 系列不飽和脂肪酸(Ohno, Suto et al. 2010)。

在 FADS 與 ELOVL 對脂肪酸進行催化反應步驟中，首先 LA 和 ALA 要透過 輔酶 A 接合酶(CoA-ligase)轉化為亞麻油醯基輔酶 A (linoleic acyl-CoA)及 α-次亞麻 油醯基輔酶 A (α-linoleic acyl-CoA)，第二步則透過具有Δ-6 催化活性的第二型脂肪 酸去飽和酶(fatty acids desaturase-2, FADS2)催化 linoleic acyl-CoA 及 α-linoleic acyl- CoA ， 分 別 轉 變 成 γ- 亞 麻 油 酸 （ γ-linolenic acid, GLA ） 和 十 八 碳 四 烯 酸 (octadecatetraenoic acid, OTA）。而在經過延長酶的作用後，可在脂肪酸的羧酸根上 延長兩個碳而形成二十個碳的ω6 及 ω3 系列的 LC-PUFAs，而這些二十個碳的 LC- PUFAs 則 可 以 藉 由 具 有 Δ-5 催 化 活 性 的 第 一 型 脂 肪 酸 去 飽 和 酶 (fatty acids desaturase-1, FADS1)催化而分別產生 AA 及 EPA(Leonard, Pereira et al. 2004; Castro, Monroig et al. 2012)。DHA 生合成則需要以 EPA 為反應物，延長兩個碳形成二十 二個碳五烯酸(Docosapentaenoic Acid, DPA)的脂肪酸，而 DPA 合成 DHA 過程則會 因物種不同而有所差異：在海洋藻類中具有Δ-4 催化活性的去飽和酶會直接以 DPA 為反應物，將 DPA 去飽和化而產生 DHA (Tonon, Harvey et al. 2003; Shi, Yu et al.

2012)。絕大多數脊椎動物皆不具有 Δ-4 催化活性的去飽和酶，因此在 DHA 合成 過程中會將 DPA 連續延長兩次，產成二十四個碳五烯酸(Tetracosapentaenoic acid,

THA)的脂肪酸，再透過 1 個具有Δ-6 催化活性的去飽和酶進行作用後，再進行β 氧 化 作 用 ( β -oxidation) 產 生 DHA (Ferdinandusse, Denis et al. 2001; Qiu 2003;

Bradbury 2011)。

斑馬魚的脂肪酸去飽和酶(zebrafish fatty acids desaturase, Z-FADS)為具有第三 類型非血基質雙鐵中心的膜結合型脂肪酸去飽和酶。多數生物的脂肪酸去飽和酶 皆為 2-3 個基因所組成之基因組，分別轉譯出 FADS1、FADS2 及 FADS3 蛋白(Castro, Monroig et al. 2012)。而在已經定序完成之斑馬魚基因組 DNA 中，則只有發現一個 脂肪酸去飽和酶基因；同樣的，在另外一種淡水魚─吳郭魚(Oreochromis niloticus) 同樣也發現只具有一個脂肪酸去飽和酶基因，顯示這兩種魚類的脂肪酸去飽和酶 為多功能性(Tanomman, Ketudat-Cairns et al. 2013)。

除了長碳鏈烯烴，膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族蛋白亦可接受其他不同 類型之反應物，其中具有苯環類之化合物便是其中一例。較常見的苯環類化合物包 括苯、甲苯、二甲苯、乙苯及苯乙烯等等，這些苯環類化合物主要來自於石油化學 工業、農藥工業、電子工業、紡織工業、造紙工業、化妝品與製藥工業等等(Norbert 1995)。苯環類化合物之所以很難被分解，主要原因為具有穩定的環狀結構，所以 會長期存在我們的環境中，除非有開環酵素或其他外力參與作用，才能將其變成直 鏈狀結構。目前對於能分解苯環類之微生物的相關研究中發現，假單孢菌屬有不少 菌種可以利用自己身體內的酵素，代謝具有苯環結構之化合物作為碳源(Yen and Gunsalus 1985; Suen and Gibson 1993; Buhler, Schmid et al. 2000)。這些參與苯環化 合物代謝的酵素可區分為兩類：一類為 aromatic ring-hydroXylAting dioxygenase；

另一類為 aromatic ring-cleavage dioxygenase (Harayama and Rekik 1989; Harayama, Kok et al. 1992)。

而以酵素進行加氧化作用則是屬於 aromatic ring-hydroXylAting dioxygenase 系 統。這類型蛋白最早是由 Pseudomonas putida F1 中所分離出來，所有的 aromatic ring-hydroXylAting dioxygenase 都 是 屬 於 多 重 單 體 酵 素 系 統 (multicomponent

enzyme system)，表示是由至少兩至三個蛋白質單體(protein component)所組成的，

但是在各個單體的組成上有相當大的差異(Butler and Mason 1997)。Butler 與 Mason 將其分成三大類：第一類為同時具有還原酶與 ferrodoxin 功能區之蛋白，蛋白本體 攜帶有 FAD 或是黃素單核苷酸(Flavin mononucleotide, FMN)及鐵硫簇區域，亦即 同時具有兩個氧化還原反應中心，此類型蛋白系統在在進行催化反應時，只會有兩 個蛋白形成複合體，電子傳遞直接自輔酶 NADH 傳遞至還原酶的 FAD 區域，再傳 遞至 ferrodoxin 功能區，而再傳遞至酵素本體，代表蛋白包括進行雙加氧化的鹵代 苯 1, 2-雙加氧酶(2-halobenzoate 1, 2-dioxygenase)催化系統(Fetzner, Muller et al. 1992;

Butler and Mason 1997)。第二類為還原酶與 ferrodoxin 分開，此類型系統之還原酶 皆具有 FAD 氧化還原中心，此類蛋白在進行催化反應時，需要三個蛋白質形成複 合體，需要還原酶將輔酶 NADH 的電子傳遞給具有 ferrodoxin 功能之蛋白，再傳 遞給酵素本體進行催化反應，代表蛋白包括進行雙加氧作用的甲苯 2,3-雙加氧酶 (Toluene 2, 3-dioxygenase) (Butler and Mason 1997; Lee, Friemann et al. 2005)。第三 類則較為特殊，這類型蛋白的還原酶與第一型相同，同時具有 FAD 及 ferrodoxin 功能區兩個氧化還原中心，但是在傳遞電子給酵素本體時，還會再需要一個具有 ferrodoxin 功能之蛋白介於酵素本體與還原酶中間，亦即電子在傳遞過程中，還原 酶會先將電子由輔酶 NADH 傳遞至 FAD 再傳遞至 ferrodoxin 功能區─還原酶自己 攜帶有的第二的氧化還原中心，而後電子會再傳遞給具有 ferrodoxin 功能之蛋白，

再傳遞給酵素本體，此類系統具有三個氧化還原中心，此催化系統之蛋白目前只有 萘雙加氧酶(naphthalene dioxygenase)被發現(Butler and Mason 1997; Malik, Allen et al. 2002)。

二甲苯單加氧酶(xylene monooxygenase)為假單孢菌(Pseudomonas putida mt-2) 代謝甲苯或二甲苯而進行開環步驟的第一個酵素(Buhler, Schmid et al. 2000)。xylene monooxygenase 為 3 種 直 接 以 甲 苯 及 二 甲 苯 為 反 應 物 之 相 關 酵 素 (Toluene-4- monooxygenase, Toluene 2, -dioxygenase 及 xylene monooxygenase) 的其中 1 種

(Zylstra 1994; Nolan and O'Connor 2008)，同時也是這 3 種之中唯一的膜蛋白，根據 序列比對具有膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族所特有的組胺酸盒子(histidine box)，而這三個盒子具有之 8 個高保守組胺酸會鰲合鐵形成第三類非血基質雙鐵中 心(Shanklin, Whittle et al. 1994; Broadwater, Haas et al. 1998)。

Xylene monooxygenase 為 TOL 質體所轉譯出之甲苯或二甲苯代謝相關蛋白，

同時也是甲苯或二甲苯開環步驟的第一個酵素，整個 xylene monooxygenase 在進 行催化反應過程中，與其他膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族相同，需要電子共同 參與其中。在催化過程中是以複合體形式存在，需要透過 xylene monooxygenase 的 還原酶(xylene monooxygenase electron transfer component, XylA)。

Shaw 與 Harayama 在 1992 年首次針對 XylA 進行純化與分析發現，純化後的 XylA 直接進行紫外－可見分光光度法(Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-Vis)，

發現具有在 458 nm 與 372 nm 有明顯吸收波峰，顯示具 FAD 結合位。再以汞撒利 酸(mersalyl acid)處理 XylA 後，發現在 336, 400 and 480 nm 具有三個吸收波峰，與 甲烷菌(Methylococcus cupsulutus Bath)具有 2Fe-2S 氧化還原中心之吸收波峰 340, 420 and 480 nm 相近(Colby and Dalton 1978)，顯示 XylA 為具有 2Fe-2S 之氧化還 原中心。純化後的 XylA 在添加 NADH 進行反應時，在 390 nm 及 460 nm 處有明 顯的吸收光譜變化，表示 XylA 在反應時會消耗府酶 NADH，顯示此蛋白為輔酶 NADH 依賴型(Shaw and Harayama 1992)。而依照此結果顯示，xylene monooxygenase 在進行催化反應時，在 Butler 與 Mason 的分類系統中為第一類型催化反應系統其 還原酶同時具有 FAD 與 ferrodoxin 兩個氧化還原反應中心。

XylA 與斑馬魚 CYB5R 相同，均為輔酶 NADH 依賴型黃素還原酶，在蛋白質 序列分析上，XylA 蛋白在 N 端具有 ferrodoxin 區域，而於蛋白質 C 端區域為具有 FAD 還原酶活性之區域(Suzuki, Hayakawa et al. 1991)。XylA 與斑馬魚 CYB5R 不 同的是，XylA 為溶解型氧化還原酶，且專一對 xylene monooxygenase 提供電子；

而斑馬魚 CYB5R 則具有四型，根據序列分析有溶解型與為膜結合型(Chen, Luo et

al. 2013)。此外 XylA 同時具有兩個氧化還原中心，分別為 ferrodoxin 及 FAD，也 與斑馬魚 CYB5R 只具有 FAD 單一氧化還原反應部位明顯不同。

Xylene monooxygenase 對反應物進行催化反應之部位(xylene monooxygenase catalytics component, XylM)與斑馬魚 Z-FADS 相同，皆為具有第三類非血基質雙鐵 中心的膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族蛋白(Austin, Buzzi et al. 2003)，但與斑馬 魚 Z-FADS 不同的是，XylM 接受之反應物為甲苯或二甲苯，且催化反應作用為針 對 C-H 鍵進行單加氧作用(Buhler, Schmid et al. 2000)，而並非對 C-C 進行去飽和作 用。而屬於同類型且常被一起提出討論的為烷烴羥化酶(alkane hydroxylase, AlkB)，

AlkB 同樣為具有組胺酸盒子鰲合鐵形成之第三類非血基質雙鐵中心(Shanklin, Whittle et al. 1994)，但其催化反應物為飽和烷烴類化合物與 XylM 及斑馬魚 Z-FADS 不同。

這類具備碳氫化合物催化活性的金屬單加氧蛋白，是藉由還原性金屬活化中 心經過空氣中的氧分子鍵結後，產生具備活性的氧化中間複體，可以促使烷烴化合 物之碳氫鍵活化以生成醇類，或將芳香族類或烯烴類化合物內之不飽和鍵進行環 氧 醚 類 加 成 或 加 氧 活 化 的 氧 化 過 程 (Gerdemann, Eicken et al. 2002; Kovaleva, Neibergall et al. 2007; Sakurai and Kataoka 2007; Bugg and Ramaswamy 2008)。烷烴 化合物通常具備高的鍵能，尤其是不具支鏈 (branched chain) 的烷類化合物(98- 104 kcal/mol)，目前以傳統的化學方法，仍難實際有效率地從事具普遍性且高選 擇性的碳氫鍵活化或官能基化的轉化過程(Maji, Lee et al. 2012)。

本實驗著重於金屬酵素的催化反應模式，特別是具有非血基質雙鐵反應中心 的膜結合型去飽和酶超級家族蛋白，以真核生物的斑馬魚去飽和酶為主，探討斑馬 魚去飽和酶在催化反應過程中，如何利用長鏈不飽和脂肪酸為反應物，而同時並以 螢光共振能量轉移之方式探討其電子傳遞過程需要那些還原酶參與其中？而同時 亦使用同樣方式分析斑馬魚內另一種會使用長鏈不飽和脂肪酸為反應物之蛋白─

脂肪酸延長酶，證明斑馬魚在進行催化反應時，需要還原酶與脂肪酸延長酶一起協

同作用。以氣相層析圖譜分析長鏈不飽和脂肪酸生合成量，同時證明斑馬魚去飽和 酶對長鏈不飽和脂肪酸的催化反應及其生合成反應的作用途徑。

由於膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族蛋白如何對反應物進行催化的相關研 究非常少，再加上至今世界上仍未有任何此家族蛋白的立體結構被解析出，因此在 現階段之研究只能夠透過 X 光吸收光譜或電化學分析其反應中心的金屬配位，透 過定點突變方式了解催化反應中，反應口袋與反應物之交互作用。目前本實驗室利 用等同性官能基(Bioisostere)的概念發展以氟取代氫形成之氟化物作為酵素催化之 反 應 物 ， 並 以 此 分 析 具 有 雙 鐵 反 應 中 心 之 蛋 白 ( 包 括 甲 烷 單 加 氧 酶 (methane monooxygenase)、細胞色素 P450 BM3(cytochrome P450 BM3, CYP102A1)及 AlkB) 的反應口袋，可證明反應物與反應口袋的交互作用及如何影響反應口袋的催化反 應效率，同時透過氟化物提高反應後之產物專一性(Ramu, Chang et al. 2011; Chiang, Ramu et al. 2013; Chen, Luo et al. 2014)。

本實驗利用具有多功能性之斑馬魚 Z-FADS 蛋白進一步了解酵素催化反應過 程，以脂肪酸去飽和酶對脂肪酸之催化反應為模式，分析與探討具有第三類型非血 基質雙鐵中心的膜結合型脂肪酸去飽和酶超級家族蛋白，如何對長碳鏈之烯烴進 行催化反應。但由於真核生物膜蛋白在表現與純化上有其難度，因此選用同類型之 原核生物蛋白為模式，以免疫共沉澱及免疫金標誌分析證明在催化反應過程中，還 原酶如何與酵素形成複合體並提供電子以催化反應，同時以定點突變的方式探討 膜結合型去飽和酶的反應口袋與反應物如何進行交互作用，模擬並推測此類型蛋 白的催化反應方式。

第二章、 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗物種：斑馬魚 (Zebrafish, Danio rerio) 2.1.2 實驗細胞：海拉細胞 (HeLa cells)

2.1.3 實驗菌種

1. Escherichia coli DH-5α 2. Escherichia coli XL-10 Gold 3. Escherichia coli BL-21(DE3)

4. Escherichia coli BL-21(DE3) pLysS 5. Pseudomonas putida mt-2

2.1.4 質體 DNA

4. pDsRed monomer-C1 5. pcDNA3CF

2.1.5 實驗溶液

10× Genomic DNA Extraction Buffer（100 ml）

1 M Tris-HCl（pH=8.0） 10 ml

0.5 M EDTA（pH=8.0） 2 ml

5 M NaCl 20 ml

ddH2O 78 ml

1× Genomic DNA Extraction Buffer（20 ml）

10X Genomic DNA Extraction Buffer 2 ml

SDS 10％ 0.4 ml

Proteinase K 10 mg/ml 0.8 ml

ddH2O 16.8 ml

5X SDS sample buffer

0.5 M Tris, pH 6.8 5 ml

50% Glycerol 8 ml

10% SDS 8 ml

ddH2O 16 ml

使用前添加 2 ml 2-Mercaptoethanol

Coomassie Brilliant Blue Stain Buffer (CBR stain buffer)

Coomassie Brilliant Blue R-250 2 g

Methanol 90 ml

Acetic acid 14 ml

ddH2O 96 ml

Coomassie Brilliant Blue De-Stain Buffer (CBR de-stain buffer)

Methanol 500 ml

Acetic acid 100 ml

ddH2O 400 ml

0.1% TBST

Tris-base 2.42 g

Sodium chloride 8.77 g

ddH2O 加至 800 ml

以 HCl 調整 pH 值至 7.4，加入 1 ml Tween-20，並以 ddH2O 補至 1,000 ml

Blocking buffer (5% skim milk)

脫脂奶粉 2.5 g

0.1% TBST 加至 50 ml

Cell lysis buffer

1 M Tris-HCl pH 7.4 6.25 ml

Sodium Chloride 4.383 g

Glycerol 50 ml

n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) 0.5 g

Sodium ascorbate 1 g

ddH2O 加至 500 ml

使用時添加 chicken egg Lysozyme 至終濃度為 300 ng/ml

NKM buffer

1 M Tris-HCl pH7.4 1 ml

Sodium Chloride 7.61 g 1 M Potassium chloride solution 5 ml 1 M Magnesium chloride solution 7.5 ml

ddH2O 加至 1,000 ml

Homogenization buffer

1 M Tris-HCl pH 6.7 10 ml

1 M Potassium chloride solution 10 ml 1 M Magnesium chloride solution 0.15 ml

DTT (1M) 1 ml

ddH2O 加至 1,000 ml

使用前添加 PMSF (終濃度為 1 mM/ml)、aprotinin (終濃度為 5 μg/ml)、

leupeptin ( 終 濃 度 為 30 μg/ml) 及 benzamidine hydrochloride ( 終 濃 度 為 10 μg/ml)。

Mitochondrial suspension buffer

1 M Tris-HCl pH 6.7 10 ml

Magnesium chloride solution (1 M) 0.15 ml

Sucrose 85.57 g

DTT (1M) 1 ml

ddH2O 加至 1,000 ml

使用前添加 PMSF (終濃度為 1 mM/ml)、aprotinin (終濃度為 5 μg/ml)、

leupeptin ( 終 濃 度 為 30 μg/ml) 及 benzamidine hydrochloride ( 終 濃 度 為 10 μg/ml)。

2.1.6 實驗生物與培養

假單孢菌 (pseudomonas putida mt-2, ATCC 33015)為購買自美國模式菌種保存 中心(American Type Culture Collection, ATCC)，培養溫度為 30℃，培養液為 ATCC 1271 benzonate/ sodium benzonate medium。斑馬魚 (Danio rerio, AB Strains)為台灣 斑馬魚中心─中央研究院分站 (Taiwan Zebrafish Core Facility at Academia Sinica, TZCAS)提供，培養環境為循環水流過濾，並培養於 28℃。魚卵採集為上午 10 點 20 分，魚卵發育環境為 28℃恆溫培養箱，發育期之培養液為 Hank’ s medium。

2.2 實驗方法：真核生物

2.2.1 斑馬魚總體 RNA (Total RNA) 萃取與互補 DNA (complementary DNA, cDNA)合成

將剛孵化之斑馬魚幼魚放置於 1.5 ml 微量離心管中，並加入 0.5 ml TRIzol®

Reagent (Life Technologies)，以小型研磨棒將魚體壓於微量離心管底部並旋轉至魚 體破碎為止。加入 0.1 ml 氯仿大力搖晃混合至液體呈現乳白色，靜置室溫下 3 分 鐘後，於 4℃下以 12,000 xg 離心 15 分鐘，取出上清液倒至新的微量離心管中，再 加入等體積的氯仿並大力搖晃混合均勻，再於 4℃下以 12,000 xg 離心 15 分鐘，

重複此步驟直到水層與有機層介面的雜質消失為止。取出上清液倒至新的微量離 心管，加入等體積的異丙醇並且緩慢的混合均勻再將微量離心管冰存於 -80℃ 2 小時，於 4℃下以 12,000 xg 離心 15 分鐘後，加入 1 ml 事先使用 DEPC-treated water 稀釋成 75%的酒精，緩慢將沉澱於微量離心管底部之 RNA 沖洗至懸浮，再以 12,000 xg 於 4℃離心 5 分鐘，將上清液去除乾淨後，倒置微量離心管風乾 3 分鐘，以 0.1 ml DEPC-treated water 回溶 RNA，以核酸微量定量儀 (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific)測定濃度與純度。cDNA 合成使用 SMART™ MMLV Reverse Transcriptase (Clonetech)，取 1 μg total RNA 與 1 μl Oligo(dT)12-18 Primer (18418-012, Life Technologies)混合後，加入 DEPC-treated water 至總體積 11.5 μl 並混合均勻，置於 70℃加熱 3 分鐘後立刻放置於冰上並依序加入 4 μl 5X First-Strand Buffer、2 μl dNTP Mix、2 μl 100 mM DTT 及 0.5 µl SMART MMLV RT enzyme，於 42℃作用 75 分鐘 以合成第一股 cDNA，反應完成後，將微量離心管放置於 70℃ 15 分鐘終止反應。

2.2.2 斑馬魚脂肪酸去飽和酶、延長酶及細胞色素 b5 還原酶 (CYB5R)

進行基因選殖時，以斑馬魚 cDNA 為模板，使用 amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix (GenDEPOT)以專一性引子對(表一) PCR 方式將斑馬魚的 fad, elovl 及 cyb5r 基因片段增幅出，將序列以分子演化遺傳分析軟體 (Molecular evolutionary genetics analysis, MEGA, ver 5.0)分析序列相似性，以保守區域資料庫(Conserved Domains Database, CDD, National Center for Biotechnology Information)分析蛋白功 能區域，以 TMHMM 分析蛋白質序列穿膜區域。分別選擇各個基因所設計相對應 的限制酶進行切割，再將基因片段分別接入 pEGFP-N1、pEGFP-C1、pDsRed- monomer-C1 及 pcDNA3CF 等質體，分別命名為 pEGFP-N1-Z-FADS、pEGFP-C1- Z-FADS 、 pCDNA3CF-Z-FADS 、 pDsRed-monomer-C1-ELOVL2 、 pcDNA3CF- ELOVL2、pDsRed-monomer-C1-ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL4、pDsRed-monomer- C1-ELOVL5、pcDNA3CF-ELOVL5、pDsRed-monomer-C1-ELOVL7、pcDNA3CF- ELOVL7、pDsRed-monomer-C1-CYB5R1、pDsRed-monomer-C1-CYB5R2 及 pDsRed- monomer-C1-CYB5R3 等共計 14 種重組真核生物表現質體，並將重組質體送定序 確認核苷酸序列正確性。14 種重組真核表現質體共區分為三大類，分別為: (1) 表 現綠色螢光的 pEGFP-N1-Z-FADS 及 pEGFP-C1-Z-FADS 質體，可分別表現出帶有 綠色螢光的 Z-FADS-EGFP 及 EGFP-Z-FADS 兩種融合蛋白；(2) 表現紅色螢光的 pDsRed-monomer-C1-ELOVL2、pDsRed-monomer-C1-ELOVL4、pDsRed-monomer- C1-ELOVL5 、 pDsRed-monomer-C1-ELOVL7 、 pDsRed-monomer-C1-CYB5R1 、 pDsRed-monomer-C1-CYB5R2 及 pDsRed-monomer-C1-CYB5R3 等質體，可分別表 現出在標的蛋白 N 端接上紅螢光蛋白的 DsRed-ELOVL2、DsRed-ELOVL4、DsRed- ELOVL5、DsRed-ELOVL7、DsRed-CYB5R1、DsRed-CYB5R2 及 DsRed-CYB5R3 等融合蛋白；(3) 表現 FLAG (DYKDDDDK)胜肽片段的 pCDNA3CF-Z-FADS、

pcDNA3CF-ELOVL2、pcDNA3CF-ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF- ELOVL7 等質體，可分別表現出在標的蛋白 C 端具有 FLAG 的融合蛋白：Z-FADS- FLAG、ELOVL2-FLAG、ELOVL4-FLAG、ELOVL5-FLAG 及 ELOVL7-FLAG。

此外，分別設計出針對 elovl 基因的引子對，並在正向引子前端加上 5’- ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC-3’ 序 列 ， 使 其 在 蛋 白 表 現 時 會 於 N 端 接 上 MHHHHHH 胜肽片段，而反向引子則設計為四種 elovl 基因共用之引子(帶有 Not

Ⅰ切位與 stop codon) (表一)：5’-ATAAGAAT GCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’，可產生出在標的蛋白 C 端接上 DYKDDDDK 胜肽片段。分別以 pcDNA3CF- ELOVL2、pcDNA3CF-ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 為 模板，將 PCR 增幅出之片段以相對應之限制酶作用(elovl4、5 及 7 為 EcoRⅠ與 Not

Ⅰ； elovl2 為 HindⅢ與 NotⅠ)。將 pEGFP-N1 分別以 EcoRⅠ與 NotⅠ及 HindⅢ 與 NotⅠ作用完後，可將 EGFP 基因自質體上去除，並將 elovl2、4、5 及 7 接回 去，完成的表現質體命名為 pHis-ELOVL2-FLAG、pHis-ELOVL4-FLAG、pHis- ELOVL5-FLAG 及 pHis-ELOVL-FLAG，共計四種改造的表現質體。將這些質體送 入細胞中進行後續實驗分析。

表一、斑馬魚 fads、elovl 及 cyb5r 基因之 PCR 引子對與 PCR 片段之相對應質體，英文字母下方線條代表限制酶切位，雙重下方線條表 示為額外增加之序列。

Transcript (Accession No.)

Construct Primer name Primer sequence

Z-FADS

(NM_131645.2)

pEGFP-N1-FADS, pEGFP-C1-FADS

Z-FADS-F-EcoRI 5’-CCGGAATTCG atg ggt ggc gga gga cag ca-3’

Z-FADS-R-KpnI 5’-CGGGGTACCAA ttt gtt gag ata cgc atc cag cca gag-3’

pcDNA3CF-FADS Z-FADS-F-EcoRI 5’-CCGGAATTCG atg ggt ggc gga gga cag ca-3’

Z-FADS-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG ttt gtt gag ata cgc atc cag cca gag-3’

ELOVL 2

(NM_001040362.1)

pDsRed monomer C1-ELOVL2

Z-ELOVL2-F-HindIII 5’-CCCAAGCTTCG atg gaa tca tat gaa aaa att gat aag c-3’

Z-ELOVL2-R-BamHI 5’-CGGGATCC ctg tag ctt ctg ttt gga gtt gg-3’

pcDNA3CF-ELOVL2 Z-ELOVL2-F-BamHI 5’-CGGGATCC atg gaa tca tat gaa aaa att gat aag c-3’

Z-ELOVL2-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG ctg tag ctt ctg ttt gga gtt gg-3’

pHis-ELOVL2-FLAG ELOVL2-F-His- HindIII

5’-CCCAAGCTT ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gaa tca tat gaa aaa att gat aag-3’

FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’

ELOVL 4 (BC060897.1)

pDsRed monomer C1- ELOVL4

Z-ELOVL4-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gag acg gtc gtt cac-3’

Z-ELOVL4-R-BamHI 5’-CGGGATCC atc gtg ctt tcc ttt tcc ttt c-3’

pcDNA3CF-ELOVL4 Z-ELOVL4-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gag acg gtc gtt cac-3’

Z-ELOVL4-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG atc gtg ctt tcc ttt tcc ttt c-3’

pHis-ELOVL4-FLAG Z-ELOVL4-F-EcoRI 5’-GGAATTC ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gag acg gtc gtt cac-3’

FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’

ELOVL 5 (NM_200453.1)

pDsRed monomer C1- ELOVL5

Z-ELOVL5-F-EcoRI 5'-GGAATTCG atg gag acg ttt agt cac aga gtc-3' Z-ELOVL5-R-KpnI 5’-GGGGTACC atc tgc tcg tgc ttt tct gtg-3’

pcDNA3CF-ELOVL5 Z-ELOVL5-F-EcoRI 5'-GGAATTCG atg gag acg ttt agt cac aga gtc-3' Z-ELOVL5-R-XhoI 5'-CCGCTCGAG atc tgc tcg tgc ttt tct gtg-3'

pHis-ELOVL5-FLAG Z-ELOVL5-F-EcoRI 5’-GGAATTC ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gag acg ttt agt cac-3’

FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’

ELOVL 7 (BC155281.1)

pDsRed monomer C1- ELOVL7

Z-ELOVL7-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gct ttc caa gag ttt aca tc-3’

Z-ELOVL7-R-BamHI 5’- CGGGATCC ctc ttt ctt atg gtg tat gtc att g-3’

pcDNA3CF-ELOVL7 Z-ELOVL7-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gct ttc caa gag ttt aca tc-3’

Z-ELOVL7-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG ctc ttt ctt atg gtg tat gtc att g-3’

pHis-ELOVL7-FLAG Z-ELOVL7-F-EcoRI 5’-GGAATTC ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gct ttc caa gag ttt ac-3’

FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’

CYB5R1 (NM_200189.2)

pDsRed monomer C1- CYB5R1

Z-CYB5R1-F-EcoRI 5’- GGAATTCG atg agc tac gcg atg tcc-3’

Z-CYB5R1-R-BamHI 5’-CGGGATCC ata ggc gaa gcg ctg gc-3’

CYB5R2 pDsRed monomer C1- Z-CYB5R2-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gac att cta aca gca cct g-3’

(NM_001045360.1) CYB5R2

Z-CYB5R2-R-BamHI 5’-CGGGATCC gta tgc gaa aat gtt ttc ttt ttt g-3’

CYB5R3 (NM_212685.1)

pDsRed monomer C1- CYB5R3

Z-CYB5R3-F-EcoRI 5’-GCGGAATTCG atg tct ttc atc ttt aac ctc atc ac-3’

Z-CYB5R3-R-KpnI 5’-CGGGGTACC gaa cat gaa gcg cct gtc-3’

2.2.3 細 胞 轉 染 (Transfection) 與 免 疫 螢 光 染 色 分 析 (Immunofluorescence cytochemistry, IFC)

將帶有 CYB5R、ELOVL 及 Z-FADS 基因的質體以 Lipofectamine® 2000 (Life Technologies)將質體送入 HeLa 細胞中。將實驗組區分為兩組，分別為 pEGFP-N1- Z-FADS 與 pEGFP-C1-Z-FADS，每組均與 pDsRed-monomer-C1-ELOVL2、pDsRed- monomer-C1-ELOVL4 、 pDsRed-monomer-C1-ELOVL5 、 pDsRed-monomer-C1- ELOVL7、pDsRed-monomer-C1-CYB5R1、pDsRed-monomer-C1-CYB5R2、pDsRed- monomer-C1-CYB5R3、pCDNA3CF-Z-FADS、pcDNA3CF-ELOVL2、pcDNA3CF- ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 等質體以兩兩為一個實驗 組進行 co-transfection。兩個質體分別取 0.4 μg plasmid DNA 與 50 μl 不含胎牛血 清 (FBS)之 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)，而 Lipofectamine® 2000 取 2 μl 稀釋至 50 μl 不含 FBS 之 DMEM，於室溫下靜置 20 分鐘後，再混合均勻置 於室溫 5 分鐘後，加入事先已培養 HeLa 細胞之 4-well 玻片(Millipore, 每孔面積為 2cm²)，於 18 小時後將 DMEM 吸乾，每個 well 加入 0.5 ml PBS 沖洗乾淨，並重複 此步驟 3 次將 DMEM 完全清洗乾淨，準備進行 IFC 及封片。在每個 well 加入 0.5 ml 帶有 4% paraformadehyde 的 PBS 固定 30 分鐘後，以 PBS 沖洗乾淨，再將 pEGFP-N1、pEGFP-C1 及 pDsRed-monomer-C1 的實驗組直接以指甲油進行封片；

而 pEGFP-N1、pEGFP-C1 及 pcDNA3CF 的實驗組則進行 IFC。在每個 well 加入 0.5 ml 帶有 0.25% Triton X-100 的 PBS 靜置室溫 15 分鐘進行穿透作用後，加入 0.5 ml PBS 靜置 5 分鐘並重複 3 次將 well 洗乾淨。以事先配製好帶有 10% 牛血清白 蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBS，在每個 well 加入 0.5 ml 與 37℃作用 30 分鐘以進行封阻作用(blocking)，blocking 完成後以 PBS 清洗乾淨，將 Monoclonal ANTI-FLAG® M2 antibody (F3165, Sigma)以 1:500 比例稀釋於 3% BSA/PBS 溶液 中，並在每個 well 加入 0.2 ml 於 37℃作用 2 小時。以 PBS 清洗乾淨後，加入 0.2 ml 事先配 製好以 1:1,000 稀釋倍率 Rhodamine-conjugated goat anti-mouse IgG

antibody (Millipore, AP124R)於 3% BSA/PBS 中，於 37℃作用 1 小時。以 PBS 清洗 乾淨後，加入 0.5 ml 以 PBS 稀釋一萬倍的 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen)，進行細胞核染色。將染色完成的細胞玻片，以指甲油封片。

將 pcDNA3CF-ELOVL2 、 pcDNA3CF-ELOVL4 、 pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 等重組質體以 lipofectamine 2000 分別轉染培養好細胞之 10 cm 培養皿中，轉染後 18 小時將細胞以冰冷的 PBS 沖洗三次，再以細胞刮棒將細 胞刮離培養皿。以 2,300 xg 於 4℃離心 5 分鐘後，再以 1 ml 冰冷的 PBS 重新懸浮 細胞，並重複此步驟三次。將細胞以50 μl sample buffer 重新懸浮，以 4%~20% SDS- PAGE 分析，以 15 mA 電流進行電泳。電泳完成之膠片以 300 mA 兩小時轉漬至 PVDF 膜上，再以抗體Monoclonal ANTI-FLAG® M2-Alkaline Phosphatase antibody (A9469, Sigma)進行西方墨點分析，確認 ELOVLs 表現情形。

將 pHis-ELOVLs-FLAG 質體以 Lipofectamine® 2000 (Life Technologies) 轉染 至 HeLa 細胞中，於 18 小時後以 PBS 將 DMEM 清洗乾淨後，依序以 4%

paraformaldehyde/PBS 固定細胞，以 0.25% Triton-X-100 進行 permeation 處理，再 以 10% BSA/PBS 於 37℃進行 blocking 30 分鐘。分別將 rabbit anti-6xHis Tag (LTK BioLaboratories) 及 Monoclonal ANTI-FLAG® M2 antibody (F3165, Sigma)同時以 1:500 比例稀釋於 3% BSA/PBS 溶液中，並在每個 well 加入 0.2 ml 於 37℃作用 2 小時。以 PBS 清洗乾淨後，在每個 well 中加入 0.2 ml 以 3% BSA/PBS 稀釋 1,000 倍的 goat F(ab')2 anti-rabbit IgG tetramethyl rhodamine isothiocyanate (Rhodamine TRITC) (Leinco technologies Inc., R124) 及 FITC AffiniPure goat anti-Mouse IgG (Jackson ImmunoResearch, 115-095-003)抗體，於 37℃作用 1 小時。以 PBS 清洗乾 淨後，加入 0.5 ml 以 PBS 稀釋一萬倍的 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen)，進行細胞核染色。將染色完成的細胞玻片，以指甲油封片。

2.2.4 螢 光 共 振 能 量 轉 移 (Fluorescence resonance energy transfer,

FRET)及 ELOVLs 穿膜構造分析

將已封片完成的玻片，以螢光顯微鏡觀測螢光表現並拍照紀錄。將玻片轉移至 共軛焦螢光顯微鏡 (Confocal Fluorescence Microscope, Leica, TCS-SP5-AOBS)。共 軛焦螢光顯微鏡螢光接收器採用兩個獨立式的 HyD3 接受器，分別獨立接收綠色 螢光與紅色螢光，避免干擾偵測，而 FRET 偵測採用受體漂白的方式(acceptor bleaching)進行操作。綠色螢光(Donor) 激發(excitation) 波長及接收(emission) 波長 分別為 488 nm 及 507 nm (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) ；495 nm 及 519 nm (Fluorescein isothiocyanate, FITC)，紅色螢光激發(excitation) 波長及接收 (emission) 波長分別為 547 nm 及 572 nm (Rhodamine TRITC) ；557 nm 及 592 nm (DsRed-monomer 蛋白)。受體漂白方式主要為用 100%雷射能量將受體螢光基團 (acceptor fluorophore)完全破壞後，再去偵測提供者螢光基團(donor fluorophore)在 受體漂白後的變化量。

在 EGFP-Z-FADFS、Z-FADS-EGFP 及 DsRed monomer-ELOVLs 或-CYB5Rs 的 實驗組中，將欲偵測 FRET 的區域以標線畫出範圍，利用 557 nm 可激發紅色螢光 基團的波長，以 100% 雷射能量將範圍內的 DsRed 蛋白完全破壞，使其失去紅色 螢光，再以 HyD3 接收器偵測受體漂白後 EGFP emission 的變化量，藉由數值判斷 Z-FADS 的 N 端與 C 端是否有與 ELOVL 及 CYB5R 的 N 端發生能量轉移。在 EGFP-Z-FADFS、Z-FADS-EGFP 及 ELOVLs-Rhodamine 的實驗組中，則以 100%

雷射能量的 547 nm 波長將 Rhodamine 的螢光基團完全破壞，以 HyD3 接收器偵測 受體漂白後 EGFP emission 的變化量，藉由數值判斷 Z-FADS 的 N 端與 C 端是否 有與 ELOVL 的 C 端發生能量轉移。而在 His-ELOVLs-FLAG 蛋白的實驗組中，以 100% 雷射能量的 547 nm 波長將 Rhodamine 的螢光基團完全破壞，以 HyD3 接收 器偵測受體漂白後 FITC emission 的變化量，藉由數值判斷 ELOVL 的 N 端與 C 端 是否有彼此發生能量轉移，以此判斷其穿膜構造。

FRET 效 率 (efficiency, E) 計 算 需 要 先 測 量 受 體 漂 白 前 的 綠 色 螢 光 數 值

(Donorpre)及受體漂白後的綠色螢光數值(Donorpost)：在標線框出的範圍內，由 HyD3 接收器所接收到 Donorpre及 Donorpost數據依照公式可計算出 FRET 的效率，由已 知兩個螢光基團配對的 R0數值，再利用公式計算出兩螢光基團的真實距離：

E = (Donorpost – Donorpre)/ Donorpost

E = R06/ (R06+ r⁶)

E 為 FRET 效率，R0為兩螢光基團發生 50% 能量轉移的距離，r 為兩螢光基團彼 此的真實距離。

2.2.5 Z-FADS 在 HeLa 細 胞 內 的 表 現 與 定 位 分 析 (Subcellular localization)

將質體 pEGFP-N1-Z-FADS 及 pEGFP-C1-Z-FADS 以 lipofectamine 2000 分別 轉染至 HeLa 細胞中，藉此觀察 Z-FADS 在細胞內不同胞器內的分佈與表現。在轉 染 後 18 小 時 ， 選 擇 可 辨 認 內 質 網 (endoplasmic reticulum, ER) 與 粒 線 體 (mitochondria)的特定抗體，進行 IFC 的步驟。依序以 4% paraformaldehyde/PBS 固 定細胞，以 0.25% Triton-X-100 進行 permeation，再以 10% BSA/PBS 於 37℃進行 blocking 30 分鐘。初級抗體以 3% BSA/PBS 稀釋 (1:500)，抗體選擇 rabbit anti-COX IV antibody (GeneTex, GTX37731)，辨認細胞內粒線體上的膜蛋白─細胞色素-c 氧 化酶複合體 IV，可用於細胞內粒線體定位。而 rabbit anti-ERp57 antibody (GeneTex, GTX113719)，因 可辨 認細胞 內質 網中 的硫 基 - 雙硫 氧化還 原酶 (thiol-disulfide oxidoreductase)，可利用於細胞內質網的定位。二級抗體使用 Goat F(ab')2 anti-rabbit IgG Rhodamine TRITC (Leinco Technologies Inc., R124) 以 3% BSA/PBS 稀 釋 (1:1,000)進行反應，作用兩小時後以 PBS 清洗乾淨後加入 0.5 ml 以 PBS 稀釋一萬 倍的 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen)，進行細胞核染色。將作用完 成的細胞玻片，以指甲油封片。免疫螢光染色反應後的玻片以倒立式螢光顯微鏡

(Zeiss, Axiovert 200M)觀察並拍照紀錄。

取 24 μg 的 pcDNA3CF-Z-FADS 質體以 lipofectamine 2000 轉染至 HeLa 細胞，

粒線體萃取參考並修改 Hajek 等人及 Wieckowski 等人於 2007 年及 2009 年發表的 研究報告(Hajek, Chomyn et al. 2007, Wieckowski, Giorgi et al. 2009)。於轉染後 18 小 時，以冰冷的 NKM uffer 清洗三次，將 DMEM 完全清洗乾淨，加入 10 ml 冰冷的 NKM buffer，以細胞刮棒將細胞刮離培養皿並使細胞懸浮於冰冷的 NKM buffer，

在 4℃以 2,300 xg 離心 5 分鐘，去除上清液體後，再以 10 ml 冰冷的 NKM buffer 重新懸浮，重複此步驟兩次。第三次離心去除上清液體後，以 1 ml 冰冷的 homogenization buffer 重新懸浮細胞並轉移至 2 ml 離心管中，將離心管放置於冰 上，以 26½ G 針頭重複吸取與排出 20 次將細胞破碎。將離心管以 4℃ 600 xg 離 心 5 分鐘，收取上清液，將 pellets 去除，重複此步驟兩次。將上清液以 4℃ 7,000 xg 離心 10 分鐘，保留 pellets 去除上清液，並以 1 ml homogenization buffer 重新懸 浮 pellets，重複此步驟兩次。將懸浮後的液體以 4℃ 10,000 xg 離心 10 分鐘，去除 上清液，並將 pellets 以 0.05 ml mitochondrial suspension buffer 重新懸浮，保存於 - 80℃備用。

將粒線體萃取液及 HeLa 細胞萃取液分別以 12% SDS-PAGE 進行電泳後，再 轉漬於 PVDF 膜上並以 blocking buffer 於 37℃作用 30 分鐘，再分別將 rabbit anti- COX IV antibody、rabbit anti-Lamin A/C antibody (GeneTex, GTX101127) 及 mouse anti-FLAG M2 antibody 以 1:2,000 比例稀釋於 blocking buffer 中，於 37℃作用 1 小 時，然後以 TBST 清洗 10 分鐘，重複三次將未結合之抗體完全洗淨。mouse anti- FLAG M2 antibody 的實驗組以 goat anti-mouse IgG-conjugated alkaline phosphatase (Dako, D048602)為二級抗體，以 1:5,000 比例稀釋於 blocking buffer 中，並於 37℃

作用 1 小時。 Rabbit anti-COX IV antibody 及 rabbit anti-Lamin A/C antibody 的實驗 組以 goat anti-rabbit IgG-conjugated alkaline phosphatase (Sigma, A3687-1ML)為二級 抗體，同樣以 1:5,000 比例稀釋於 blocking buffer 中，並於 37℃作用 1 小時。將二 級抗體作用完成的 PVDF 膜，以 TBST 清洗 10 分鐘並重複三次，將未結合之二級

抗體去除乾淨後，加入 NBT/BCIP (ThermoScientific)呈色液，顯色後以大量二次水 沖洗將反應終止。

2.2.6 DHA 及 EPA 的生物合成與脂肪酸甲酯 (Fatty acid methyl ester)

將 HeLa 細胞培養於直徑 15 公分的培養皿。取 10 μg pcDNA3CF-Z-FADS、10 μg pcDNA3CF-ELOVL2、10 μg pcDNA3CF-ELOVL4 及 10 μg pcDNA3CF-ELOVL5 等質體以 lipofectamine 2000 轉染細胞。細胞脂肪酸的生物合成實驗參考 Williard 等人於 1998 年所發表的報告(Williard, Kaduce et al. 1998)。將轉染 18 小時候以 PBS 清洗三次將 DMEM 清洗乾淨，將 5 μg α-Linolenic acid 與 25 ml 已回溫的 DMEM 混合後，加入 15 公分培養皿中持續培養 3 小時。在以 α-Linolenic acid 培養 3 小時 候，以 PBS 清洗細胞三次將 DMEM 完全清洗乾淨，再以胰蛋白酶(Trypsin) 於 37

℃作用 3 分鐘，將細胞以 10 ml PBS 沖洗並懸浮，再於 4℃以 2,300 xg 離心 5 分 鐘，將上清液去除乾淨後，以 1 ml 冰冷的 PBS 重新懸浮細胞，重複此步驟三次，

最後將細胞重新懸浮於 0.2 ml 冰冷的 PBS 中。

將重新懸浮於 PBS 中的細胞立刻進行脂肪酸分析，細胞內總脂肪酸萃取及脂 肪酸甲酯化反應方式採用 Masood 等人於 2005 年所發表的研究報告(Masood, Stark et al. 2005)。取 1.7 ml 甲醇加入 4 ml 棕色反應瓶中，再加入 0.1 ml 乙醯氯 (Acetyl chloride)混合均勻後，加入 0.1 ml 重新懸浮於 PBS 的細胞溶液，以震盪器震盪 1 分 鐘，將反應瓶置於 100℃水浴盆中，以恆溫 100℃持續加熱 1 小時。將反應完成的 棕色反應瓶靜置待其溫度降至室溫，加入 0.75 ml n-hexane 以震盪器震盪 1 分鐘，

靜置於室溫下 10 分鐘使其自然分層。取上層液至新的棕色反應瓶中，以氣相層析 儀 (gas chromatography, GC)分析，脂肪酸甲酯化標準品使用 Supelco^® 37 Component FAME Mix standard (Sigma, 47885-U, 10 mg/mL methylene chloride)，GC 管柱為 HP- 5，氣相層析溫度流程為先維持於 120℃ 30 分鐘，再以每分鐘增加 3℃至 250℃維

持 20 分鐘，再以每分鐘增加 5℃至 300℃並維持 20 分鐘。共注射實驗(co-injection) 為將萃取後之樣品與脂肪酸甲酯化標準品以 10:1 的比例混合，再取 3 μl 以專用針 筒注入氣相層析儀中，以相同之氣相層析溫度流程進行分析。