第二章、 材料與方法
2.1.1 實驗物種
2.1.3 實驗菌種
1. Escherichia coli DH-5α 2. Escherichia coli XL-10 Gold 3. Escherichia coli BL-21(DE3)
4. Escherichia coli BL-21(DE3) pLysS 5. Pseudomonas putida mt-2
2.1.4 質體 DNA
1. pACYC-Duet-1 2. pEGFP-N1 3. pEGFP-C14. pDsRed monomer-C1 5. pcDNA3CF
2.1.5 實驗溶液
10× Genomic DNA Extraction Buffer（100 ml）
1 M Tris-HCl（pH=8.0） 10 ml
0.5 M EDTA（pH=8.0） 2 ml
5 M NaCl 20 ml
ddH2O 78 ml
1× Genomic DNA Extraction Buffer（20 ml）
10X Genomic DNA Extraction Buffer 2 ml
SDS 10％ 0.4 ml
Proteinase K 10 mg/ml 0.8 ml
ddH2O 16.8 ml
5X SDS sample buffer
0.5 M Tris, pH 6.8 5 ml
50% Glycerol 8 ml
10% SDS 8 ml
ddH2O 16 ml
使用前添加 2 ml 2-Mercaptoethanol
Coomassie Brilliant Blue Stain Buffer (CBR stain buffer)
Coomassie Brilliant Blue R-250 2 g
Methanol 90 ml
Acetic acid 14 ml
ddH2O 96 ml
Coomassie Brilliant Blue De-Stain Buffer (CBR de-stain buffer)
Methanol 500 ml
Acetic acid 100 ml
ddH2O 400 ml
0.1% TBST
Tris-base 2.42 g
Sodium chloride 8.77 g
ddH2O 加至 800 ml
以 HCl 調整 pH 值至 7.4，加入 1 ml Tween-20，並以 ddH2O 補至 1,000 ml
Blocking buffer (5% skim milk)
脫脂奶粉 2.5 g
0.1% TBST 加至 50 ml
Cell lysis buffer
1 M Tris-HCl pH 7.4 6.25 ml
Sodium Chloride 4.383 g
Glycerol 50 ml
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) 0.5 g
Sodium ascorbate 1 g
ddH2O 加至 500 ml
使用時添加 chicken egg Lysozyme 至終濃度為 300 ng/ml
NKM buffer
1 M Tris-HCl pH7.4 1 ml
Sodium Chloride 7.61 g 1 M Potassium chloride solution 5 ml 1 M Magnesium chloride solution 7.5 ml
ddH2O 加至 1,000 ml
Homogenization buffer
1 M Tris-HCl pH 6.7 10 ml
1 M Potassium chloride solution 10 ml 1 M Magnesium chloride solution 0.15 ml
DTT (1M) 1 ml
ddH2O 加至 1,000 ml
使用前添加 PMSF (終濃度為 1 mM/ml)、aprotinin (終濃度為 5 μg/ml)、
leupeptin ( 終 濃 度 為 30 μg/ml) 及 benzamidine hydrochloride ( 終 濃 度 為 10 μg/ml)。
Mitochondrial suspension buffer
1 M Tris-HCl pH 6.7 10 ml
Magnesium chloride solution (1 M) 0.15 ml
Sucrose 85.57 g
DTT (1M) 1 ml
ddH2O 加至 1,000 ml
使用前添加 PMSF (終濃度為 1 mM/ml)、aprotinin (終濃度為 5 μg/ml)、
leupeptin ( 終 濃 度 為 30 μg/ml) 及 benzamidine hydrochloride ( 終 濃 度 為 10 μg/ml)。
2.1.6 實驗生物與培養
假單孢菌 (pseudomonas putida mt-2, ATCC 33015)為購買自美國模式菌種保存 中心(American Type Culture Collection, ATCC)，培養溫度為 30℃，培養液為 ATCC 1271 benzonate/ sodium benzonate medium。斑馬魚 (Danio rerio, AB Strains)為台灣 斑馬魚中心─中央研究院分站 (Taiwan Zebrafish Core Facility at Academia Sinica, TZCAS)提供，培養環境為循環水流過濾，並培養於 28℃。魚卵採集為上午 10 點 20 分，魚卵發育環境為 28℃恆溫培養箱，發育期之培養液為 Hank’ s medium。
2.2 實驗方法：真核生物
2.2.1 斑馬魚總體 RNA (Total RNA) 萃取與互補 DNA (complementary DNA, cDNA)合成
將剛孵化之斑馬魚幼魚放置於 1.5 ml 微量離心管中，並加入 0.5 ml TRIzol®
Reagent (Life Technologies)，以小型研磨棒將魚體壓於微量離心管底部並旋轉至魚 體破碎為止。加入 0.1 ml 氯仿大力搖晃混合至液體呈現乳白色，靜置室溫下 3 分 鐘後，於 4℃下以 12,000 xg 離心 15 分鐘，取出上清液倒至新的微量離心管中，再 加入等體積的氯仿並大力搖晃混合均勻，再於 4℃下以 12,000 xg 離心 15 分鐘，
重複此步驟直到水層與有機層介面的雜質消失為止。取出上清液倒至新的微量離 心管，加入等體積的異丙醇並且緩慢的混合均勻再將微量離心管冰存於 -80℃ 2 小時，於 4℃下以 12,000 xg 離心 15 分鐘後，加入 1 ml 事先使用 DEPC-treated water 稀釋成 75%的酒精，緩慢將沉澱於微量離心管底部之 RNA 沖洗至懸浮，再以 12,000 xg 於 4℃離心 5 分鐘，將上清液去除乾淨後，倒置微量離心管風乾 3 分鐘，以 0.1 ml DEPC-treated water 回溶 RNA，以核酸微量定量儀 (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific)測定濃度與純度。cDNA 合成使用 SMART™ MMLV Reverse Transcriptase (Clonetech)，取 1 μg total RNA 與 1 μl Oligo(dT)12-18 Primer (18418-012, Life Technologies)混合後，加入 DEPC-treated water 至總體積 11.5 μl 並混合均勻，置於 70℃加熱 3 分鐘後立刻放置於冰上並依序加入 4 μl 5X First-Strand Buffer、2 μl dNTP Mix、2 μl 100 mM DTT 及 0.5 µl SMART MMLV RT enzyme，於 42℃作用 75 分鐘 以合成第一股 cDNA，反應完成後，將微量離心管放置於 70℃ 15 分鐘終止反應。
2.2.2 斑馬魚脂肪酸去飽和酶、延長酶及細胞色素 b5 還原酶 (CYB5R)
等基因選殖、序列分析與質體構築進行基因選殖時，以斑馬魚 cDNA 為模板，使用 amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix (GenDEPOT)以專一性引子對(表一) PCR 方式將斑馬魚的 fad, elovl 及 cyb5r 基因片段增幅出，將序列以分子演化遺傳分析軟體 (Molecular evolutionary genetics analysis, MEGA, ver 5.0)分析序列相似性，以保守區域資料庫(Conserved Domains Database, CDD, National Center for Biotechnology Information)分析蛋白功 能區域，以 TMHMM 分析蛋白質序列穿膜區域。分別選擇各個基因所設計相對應 的限制酶進行切割，再將基因片段分別接入 pEGFP-N1、pEGFP-C1、pDsRed-monomer-C1 及 pcDNA3CF 等質體，分別命名為 pEGFP-N1-Z-FADS、pEGFP-C1-Z-FADS 、 pCDNA3CF-pEGFP-N1-Z-FADS、pEGFP-C1-Z-FADS 、 pDsRed-monomer-C1-ELOVL2 、 pcDNA3CF- ELOVL2、pDsRed-monomer-C1-ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL4、pDsRed-monomer- C1-ELOVL5、pcDNA3CF-ELOVL5、monomer-C1-ELOVL7、pcDNA3CF-ELOVL7、monomer-C1-CYB5R1、monomer-C1-CYB5R2 及 pDsRed-monomer-C1-CYB5R3 等共計 14 種重組真核生物表現質體，並將重組質體送定序 確認核苷酸序列正確性。14 種重組真核表現質體共區分為三大類，分別為: (1) 表 現綠色螢光的 pEGFP-N1-Z-FADS 及 pEGFP-C1-Z-FADS 質體，可分別表現出帶有 綠色螢光的 Z-FADS-EGFP 及 EGFP-Z-FADS 兩種融合蛋白；(2) 表現紅色螢光的 pDsRed-monomer-C1-ELOVL2、pDsRed-monomer-C1-ELOVL4、pDsRed-monomer-C1-ELOVL5 、 pDsRed-monomer-C1-ELOVL7 、 pDsRed-monomer-C1-CYB5R1 、 pDsRed-monomer-C1-CYB5R2 及 pDsRed-monomer-C1-CYB5R3 等質體，可分別表 現出在標的蛋白 N 端接上紅螢光蛋白的 DsRed-ELOVL2、DsRed-ELOVL4、DsRed-ELOVL5、DsRed-ELOVL7、DsRed-CYB5R1、DsRed-CYB5R2 及 DsRed-CYB5R3 等融合蛋白；(3) 表現 FLAG (DYKDDDDK)胜肽片段的 pCDNA3CF-Z-FADS、
ELOVL2、ELOVL4、ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 等質體，可分別表現出在標的蛋白 C 端具有 FLAG 的融合蛋白：Z-FADS-FLAG、ELOVL2-FLAG、ELOVL4-FLAG、ELOVL5-FLAG 及 ELOVL7-FLAG。
此外，分別設計出針對 elovl 基因的引子對，並在正向引子前端加上 5’- ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC-3’ 序 列 ， 使 其 在 蛋 白 表 現 時 會 於 N 端 接 上 MHHHHHH 胜肽片段，而反向引子則設計為四種 elovl 基因共用之引子(帶有 Not
Ⅰ切位與 stop codon) (表一)：5’-ATAAGAAT GCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’，可產生出在標的蛋白 C 端接上 DYKDDDDK 胜肽片段。分別以 pcDNA3CF-ELOVL2、pcDNA3CF-ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 為 模板，將 PCR 增幅出之片段以相對應之限制酶作用(elovl4、5 及 7 為 EcoRⅠ與 Not
Ⅰ； elovl2 為 HindⅢ與 NotⅠ)。將 pEGFP-N1 分別以 EcoRⅠ與 NotⅠ及 HindⅢ 與 NotⅠ作用完後，可將 EGFP 基因自質體上去除，並將 elovl2、4、5 及 7 接回 去，完成的表現質體命名為 pHis-ELOVL2-FLAG、pHis-ELOVL4-FLAG、pHis-ELOVL5-FLAG 及 pHis-ELOVL-FLAG，共計四種改造的表現質體。將這些質體送 入細胞中進行後續實驗分析。
表一、斑馬魚 fads、elovl 及 cyb5r 基因之 PCR 引子對與 PCR 片段之相對應質體，英文字母下方線條代表限制酶切位，雙重下方線條表 示為額外增加之序列。
Transcript (Accession No.)
Construct Primer name Primer sequence
Z-FADS
(NM_131645.2)
pEGFP-N1-FADS, pEGFP-C1-FADS
Z-FADS-F-EcoRI 5’-CCGGAATTCG atg ggt ggc gga gga cag ca-3’
Z-FADS-R-KpnI 5’-CGGGGTACCAA ttt gtt gag ata cgc atc cag cca gag-3’
pcDNA3CF-FADS Z-FADS-F-EcoRI 5’-CCGGAATTCG atg ggt ggc gga gga cag ca-3’
Z-FADS-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG ttt gtt gag ata cgc atc cag cca gag-3’
ELOVL 2
(NM_001040362.1)
pDsRed monomer C1-ELOVL2
Z-ELOVL2-F-HindIII 5’-CCCAAGCTTCG atg gaa tca tat gaa aaa att gat aag c-3’
Z-ELOVL2-R-BamHI 5’-CGGGATCC ctg tag ctt ctg ttt gga gtt gg-3’
pcDNA3CF-ELOVL2 Z-ELOVL2-F-BamHI 5’-CGGGATCC atg gaa tca tat gaa aaa att gat aag c-3’
Z-ELOVL2-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG ctg tag ctt ctg ttt gga gtt gg-3’
pHis-ELOVL2-FLAG ELOVL2-F-His-HindIII
5’-CCCAAGCTT ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gaa tca tat gaa aaa att gat aag-3’
FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’
ELOVL 4 (BC060897.1)
pDsRed monomer C1-ELOVL4
Z-ELOVL4-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gag acg gtc gtt cac-3’
Z-ELOVL4-R-BamHI 5’-CGGGATCC atc gtg ctt tcc ttt tcc ttt c-3’
pcDNA3CF-ELOVL4 Z-ELOVL4-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gag acg gtc gtt cac-3’
Z-ELOVL4-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG atc gtg ctt tcc ttt tcc ttt c-3’
pHis-ELOVL4-FLAG Z-ELOVL4-F-EcoRI 5’-GGAATTC ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gag acg gtc gtt cac-3’
FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’
ELOVL 5 (NM_200453.1)
pDsRed monomer C1-ELOVL5
Z-ELOVL5-F-EcoRI 5'-GGAATTCG atg gag acg ttt agt cac aga gtc-3' Z-ELOVL5-R-KpnI 5’-GGGGTACC atc tgc tcg tgc ttt tct gtg-3’
pcDNA3CF-ELOVL5 Z-ELOVL5-F-EcoRI 5'-GGAATTCG atg gag acg ttt agt cac aga gtc-3' Z-ELOVL5-R-XhoI 5'-CCGCTCGAG atc tgc tcg tgc ttt tct gtg-3'
pHis-ELOVL5-FLAG Z-ELOVL5-F-EcoRI 5’-GGAATTC ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gag acg ttt agt cac-3’
FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’
ELOVL 7 (BC155281.1)
pDsRed monomer C1-ELOVL7
Z-ELOVL7-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gct ttc caa gag ttt aca tc-3’
Z-ELOVL7-R-BamHI 5’- CGGGATCC ctc ttt ctt atg gtg tat gtc att g-3’
pcDNA3CF-ELOVL7 Z-ELOVL7-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gct ttc caa gag ttt aca tc-3’
Z-ELOVL7-R-XhoI 5’-CCGCTCGAG ctc ttt ctt atg gtg tat gtc att g-3’
pHis-ELOVL7-FLAG Z-ELOVL7-F-EcoRI 5’-GGAATTC ATG CAC CAC CAC CAC CAC CAC atg gct ttc caa gag ttt ac-3’
FLAG-Stop NotI 5’-ATAAGAATGCGGCCGC cta ttt gtc atc gtc atc ctt gta gtc-3’
CYB5R1 (NM_200189.2)
pDsRed monomer C1-CYB5R1
Z-CYB5R1-F-EcoRI 5’- GGAATTCG atg agc tac gcg atg tcc-3’
Z-CYB5R1-R-BamHI 5’-CGGGATCC ata ggc gaa gcg ctg gc-3’
CYB5R2 pDsRed monomer C1- Z-CYB5R2-F-EcoRI 5’-GGAATTCG atg gac att cta aca gca cct g-3’
(NM_001045360.1) CYB5R2
Z-CYB5R2-R-BamHI 5’-CGGGATCC gta tgc gaa aat gtt ttc ttt ttt g-3’
CYB5R3 (NM_212685.1)
pDsRed monomer C1-CYB5R3
Z-CYB5R3-F-EcoRI 5’-GCGGAATTCG atg tct ttc atc ttt aac ctc atc ac-3’
Z-CYB5R3-R-KpnI 5’-CGGGGTACC gaa cat gaa gcg cct gtc-3’
2.2.3 細 胞 轉 染 (Transfection) 與 免 疫 螢 光 染 色 分 析 (Immunofluorescence cytochemistry, IFC)
將帶有 CYB5R、ELOVL 及 Z-FADS 基因的質體以 Lipofectamine® 2000 (Life Technologies)將質體送入 HeLa 細胞中。將實驗組區分為兩組，分別為 pEGFP-N1-Z-FADS 與 pEGFP-C1-pEGFP-N1-Z-FADS，每組均與 ELOVL2、ELOVL4 、 ELOVL5 、 pDsRed-monomer-C1- ELOVL7、pDsRed-monomer-C1-CYB5R1、pDsRed-monomer-C1-CYB5R2、pDsRed- monomer-C1-CYB5R3、pCDNA3CF-Z-FADS、pcDNA3CF-ELOVL2、pcDNA3CF-ELOVL4、pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 等質體以兩兩為一個實驗 組進行 co-transfection。兩個質體分別取 0.4 μg plasmid DNA 與 50 μl 不含胎牛血 清 (FBS)之 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)，而 Lipofectamine® 2000 取 2 μl 稀釋至 50 μl 不含 FBS 之 DMEM，於室溫下靜置 20 分鐘後，再混合均勻置
而 pEGFP-N1、pEGFP-C1 及 pcDNA3CF 的實驗組則進行 IFC。在每個 well 加入 0.5 ml 帶有 0.25% Triton X-100 的 PBS 靜置室溫 15 分鐘進行穿透作用後，加入 0.5 ml PBS 靜置 5 分鐘並重複 3 次將 well 洗乾淨。以事先配製好帶有 10% 牛血清白 蛋白(bovine serum albumin, BSA)的 PBS，在每個 well 加入 0.5 ml 與 37℃作用 30 分鐘以進行封阻作用(blocking)，blocking 完成後以 PBS 清洗乾淨，將 Monoclonal ANTI-FLAG® M2 antibody (F3165, Sigma)以 1:500 比例稀釋於 3% BSA/PBS 溶液 中，並在每個 well 加入 0.2 ml 於 37℃作用 2 小時。以 PBS 清洗乾淨後，加入 0.2 ml 事先配 製好以 1:1,000 稀釋倍率 Rhodamine-conjugated goat anti-mouse IgG
antibody (Millipore, AP124R)於 3% BSA/PBS 中，於 37℃作用 1 小時。以 PBS 清洗 乾淨後，加入 0.5 ml 以 PBS 稀釋一萬倍的 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen)，進行細胞核染色。將染色完成的細胞玻片，以指甲油封片。
將 pcDNA3CF-ELOVL2 、 pcDNA3CF-ELOVL4 、 pcDNA3CF-ELOVL5 及 pcDNA3CF-ELOVL7 等重組質體以 lipofectamine 2000 分別轉染培養好細胞之 10 cm 培養皿中，轉染後 18 小時將細胞以冰冷的 PBS 沖洗三次，再以細胞刮棒將細 胞刮離培養皿。以 2,300 xg 於 4℃離心 5 分鐘後，再以 1 ml 冰冷的 PBS 重新懸浮 細胞，並重複此步驟三次。將細胞以50 μl sample buffer 重新懸浮，以 4%~20% SDS-PAGE 分析，以 15 mA 電流進行電泳。電泳完成之膠片以 300 mA 兩小時轉漬至 PVDF 膜上，再以抗體Monoclonal ANTI-FLAG® M2-Alkaline Phosphatase antibody (A9469, Sigma)進行西方墨點分析，確認 ELOVLs 表現情形。
將 pHis-ELOVLs-FLAG 質體以 Lipofectamine® 2000 (Life Technologies) 轉染 至 HeLa 細胞中，於 18 小時後以 PBS 將 DMEM 清洗乾淨後，依序以 4%
paraformaldehyde/PBS 固定細胞，以 0.25% Triton-X-100 進行 permeation 處理，再 以 10% BSA/PBS 於 37℃進行 blocking 30 分鐘。分別將 rabbit anti-6xHis Tag (LTK BioLaboratories) 及 Monoclonal ANTI-FLAG® M2 antibody (F3165, Sigma)同時以 1:500 比例稀釋於 3% BSA/PBS 溶液中，並在每個 well 加入 0.2 ml 於 37℃作用 2 小時。以 PBS 清洗乾淨後，在每個 well 中加入 0.2 ml 以 3% BSA/PBS 稀釋 1,000 倍的 goat F(ab')2 anti-rabbit IgG tetramethyl rhodamine isothiocyanate (Rhodamine TRITC) (Leinco technologies Inc., R124) 及 FITC AffiniPure goat anti-Mouse IgG (Jackson ImmunoResearch, 115-095-003)抗體，於 37℃作用 1 小時。以 PBS 清洗乾 淨後，加入 0.5 ml 以 PBS 稀釋一萬倍的 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen)，進行細胞核染色。將染色完成的細胞玻片，以指甲油封片。
2.2.4 螢 光 共 振 能 量 轉 移 (Fluorescence resonance energy transfer,
FRET)及 ELOVLs 穿膜構造分析
將已封片完成的玻片，以螢光顯微鏡觀測螢光表現並拍照紀錄。將玻片轉移至 共軛焦螢光顯微鏡 (Confocal Fluorescence Microscope, Leica, TCS-SP5-AOBS)。共 軛焦螢光顯微鏡螢光接收器採用兩個獨立式的 HyD3 接受器，分別獨立接收綠色 螢光與紅色螢光，避免干擾偵測，而 FRET 偵測採用受體漂白的方式(acceptor bleaching)進行操作。綠色螢光(Donor) 激發(excitation) 波長及接收(emission) 波長 分別為 488 nm 及 507 nm (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) ；495 nm 及 519 nm (Fluorescein isothiocyanate, FITC)，紅色螢光激發(excitation) 波長及接收 (emission) 波長分別為 547 nm 及 572 nm (Rhodamine TRITC) ；557 nm 及 592 nm (DsRed-monomer 蛋白)。受體漂白方式主要為用 100%雷射能量將受體螢光基團 (acceptor fluorophore)完全破壞後，再去偵測提供者螢光基團(donor fluorophore)在 受體漂白後的變化量。 EGFP-Z-FADFS、Z-FADS-EGFP 及 ELOVLs-Rhodamine 的實驗組中，則以 100%
雷射能量的 547 nm 波長將 Rhodamine 的螢光基團完全破壞，以 HyD3 接收器偵測
(Donorpre)及受體漂白後的綠色螢光數值(Donorpost)：在標線框出的範圍內，由 HyD3 接收器所接收到 Donorpre及 Donorpost數據依照公式可計算出 FRET 的效率，由已 知兩個螢光基團配對的 R0數值，再利用公式計算出兩螢光基團的真實距離：
E = (Donorpost – Donorpre)/ Donorpost
E = R06/ (R06+ r6)
E 為 FRET 效率，R0為兩螢光基團發生 50% 能量轉移的距離，r 為兩螢光基團彼 此的真實距離。
2.2.5 Z-FADS 在 HeLa 細 胞 內 的 表 現 與 定 位 分 析 (Subcellular localization)
將質體 pEGFP-N1-Z-FADS 及 pEGFP-C1-Z-FADS 以 lipofectamine 2000 分別 轉染至 HeLa 細胞中，藉此觀察 Z-FADS 在細胞內不同胞器內的分佈與表現。在轉 染 後 18 小 時 ， 選 擇 可 辨 認 內 質 網 (endoplasmic reticulum, ER) 與 粒 線 體 (mitochondria)的特定抗體，進行 IFC 的步驟。依序以 4% paraformaldehyde/PBS 固
將質體 pEGFP-N1-Z-FADS 及 pEGFP-C1-Z-FADS 以 lipofectamine 2000 分別 轉染至 HeLa 細胞中，藉此觀察 Z-FADS 在細胞內不同胞器內的分佈與表現。在轉 染 後 18 小 時 ， 選 擇 可 辨 認 內 質 網 (endoplasmic reticulum, ER) 與 粒 線 體 (mitochondria)的特定抗體，進行 IFC 的步驟。依序以 4% paraformaldehyde/PBS 固