4 第四章 結果與討論
4.4 動態機械性質
於水膠上切下數片邊長二公分厚度二毫米以上之正方形，使用拭淨紙去除水 膠表面水分後，連接儀器，使用平行板之幾何測量體在壓縮模式下測量每片方形 水膠的剪力儲存模數(shear storage modulus, G’)，以測試水膠在不同頻率下之剛性 性質。動態頻率掃描試驗於固定的正向力(0.3 N)，並控制應變於 0.1%，頻率範圍 由 0.05 rad/s 至 500 rad/s，溫度為攝氏 25 度，條件如表 3.4.1 所示。
表 3.4.1 流變儀測定參數
Parameter Condition
Testing geometry 2 cm parallel-plate Mode compression Normal force 0.3 N Frequency sweep 0.05 － 500 rad/s Deformation (strain) 0.1 %
Temperature 25 ℃
3.4.5 加速氧化降解測試(Accelerated oxidative degradation test)
由於自由基是生物體中代謝的中間產物，又因角膜本身也在眼代謝中扮演重 要角色，因此利用鈷離子與過氧化氫所進行的 Haber-Weiss reaction[114]作加速氧 化降解測試。其方法是以水膠上打孔取下數片直徑一公分之圓形水膠後，裝入離 心管中並使外環境充滿液態氮 30 分鐘，冷凍乾燥 24 小時後，測量乾重並重新浸 入含 10 毫升之樣品瓶中取得澎潤平衡，秤量初始澎潤比。而後使用 35 wt% 之過 氧化氫水溶液與氯化亞鈷(CoCl2)配置三毫升 12.5 mM 氯化亞鈷之過氧化氫水溶液，
將水膠浸入其中如圖 3.4.3 所示，並於固定時間間隔將圓形水膠取出秤重算出澎潤 比之改變[115]，流程圖如 3.4.4 所示，藉由因結構被自由基破壞而使澎潤重量改變 [116]至水膠無法測量(圖 3.4.5 所示)為止，比較不同比例之水膠耐自由基(·OH)攻擊 程度之性質測試。
圖 3.4.3 加速氧化降解測試
圖 3.4.4 加速氧化降解流程圖
圖 3.4.5 水膠氧化降解蜷曲狀態
3.4.6 水銀測孔儀(Mercury Porosimetry)
為測試孔隙率、孔徑分布孔洞型態，使用水銀測孔儀於樣品孔洞內注入水銀 測量獲取數據。樣品製備係將已澎潤平衡之水膠裝入離心管中，外環境使用液態 氮冷凍，後至於冷凍乾燥機中 24 小時乾燥取出(如圖 3.4.6 所示)，乾燥後樣品需在 0.1 克左右得以進一步分析。孔隙率(φ)藉由顆粒密度(ρparticle)與總密度(ρbulk)並以公 式 3.4.2 計算得出，孔徑分布則可利用使水銀進入孔洞之施予壓力(P)、施予壓力後 被水銀填入之孔洞直徑(D)、水銀表面張力(σ)、水銀與水膠之接觸角(θ)的公式 3.4.3 得出。
φ = 1 - ρbulk⁄ρparticle (3.4.2)
P = 4σ cos θ D⁄ (3.4.3)
圖 3.4.6 冷凍乾燥後水膠
3.4.7 皮下植入實驗(Subcutaneous implantation studies)
樣品製備方式：置備五組水膠樣品，每組樣品切下三片邊長一公分且厚度為 一毫米之方形水膠，使用低溫之環氧乙烷滅菌法(ethylene oxide sterilization)滅菌後，
進入無菌水(sterilized water)中三小時確保澎潤平衡。
水膠澎潤後，使用 0.05 毫升之 Ropum (2%)與 0.1 毫升之 Zoiel 50 的混合液將 大白鼠麻醉後在背部剃毛，剃毛完成後在皮膚表面已手術剪刀劃開一切口，將滅 菌後的水膠經由切口袋中塞入皮下植入大白鼠體內後使用手術線縫合，分別於第 四週、第八週與第十二週使用密閉空間高濃度二氧化碳將大白鼠安樂死，使用手 術剪刀切下含水膠之皮下組織，浸泡於福馬林中保存以作石蠟切片及染色組織的 觀察。。
4 第四章 結果與討論
4.1 PEG 與 P407 經氫核磁共振光譜測定之烯化率
分別將 PEGDA 與 P407DA 溶入 CDCl3，於 400MHz 外磁場環境下所測定之結 果可分別由圖 4.1.1 與 4.1.2 所示，因已知化學位移(chemical shift, δ)的位移峰強度 與氫之數量呈正比， 又知 PEG 與 P407DA 末端乙烯基(terminal vinyl group, -CH=CH-Ha)之氫原子化學位移於 5.8 - 6.4 ppm 範圍區間，而骨幹之乙醚基(ether back bone, -CHb-CHb-O)中氫原子化學位移則於 3.2 - 4.3 ppm 範圍區間[112, 117]，
因而使用軟體 topspin 積分求兩圖中峰值強度，並利用公式 4.1.1 計算，得出結果 如表 4.1.1 中之烯化率。
烯化率(%) = ∫ 末端乙烯基峰(Ha)
∫ 骨幹之乙醚基峰(Hb)
×(134×2 for PEGDA)
×(200×2 for P407DA) (4.1.1)
表 4.1.1 PEGDA 與 P407DA 烯化率
化合物 分子量
(g/mol) Ha 化學位移 (ppm) Hb 化學位移 (ppm) 平均烯化率(%) PEGDA 6000 5.8 - 6.4 3.2 - 4.3 93.55±1.29 P407DA 12500 5.8 - 6.4 3.2 - 4.3 96.82±1.86
圖 4.1.1 PEGDA 之氫核磁共振光譜
圖 4.1.2 P407DA 之氫核磁共振光譜
400MHz 1H
400MHz 1H
4.2 水膠澎潤平衡
水膠的澎潤比結果如圖 4.2.1 所示。於本研究中所使用之配方材料性質包含親 水之雙邊末端烯基的 PEGDA 長鏈、雙邊末端烯基的親水 P407DA 長鏈，以及單邊 末端烯基的含矽疏水 mPDMS 長鏈。以 PEGDA 作成之水膠網絡為控制組比較，可 以明顯發現 PEGDA 加入含矽之 mPDMS 後作成之水膠澎潤比有明顯下降的趨勢 (配方比 9:0:1 樣品)，此結果除了因矽材料本身的疏水性質使水膠浸泡在水中時減 少吸水外，也可能因 mPDMS 分子量小鏈長相較 PEGDA 與 P407DA 較小，使整體 結構的交聯密度升高、孔隙率降低而澎潤比下調。而後加入的 P407DA，雖本身有 含疏水的烷基鏈(即 poly(propylene oxide))在其中，使含有少量的 P407DA 之 8:1:1 與 7:2:1 這兩組的水膠澎潤比回升的情況並不劇烈，但因 P407DA 相較 PEGDA 有 較長的鏈段，使交聯密度下降、孔隙率上升，增加 P407DA 用量至配方比 6:3:1 之 水膠所測出澎潤比回升接近至只有使用 PEGDA 所作成之水膠(10:0:0)的程度，此 時與 10:0:0 之樣品 p value 值為 0.09 左右，顯示兩者結果並無顯著差異。
圖 4.2.1 不同配方比例之澎潤比
4.3 水膠孔洞型態
4.3.1 SEM 觀察結果
為了確認水膠中的孔洞型態，吾人使用掃描式電子顯微鏡將乾燥後水膠鍍膜 拍攝結果如圖 4.3.1 至圖 4.3.5 所示，由圖中可觀察到所有配方的孔洞皆為開放性 而相互連接的孔洞，且尺寸皆為數微米等級大小。當水膠材料的單體中僅含有 PEGDA 與 mPDMS 時，分子量較小而鏈長較短的 mPDMS 提高了交聯密度，而使 孔洞的尺寸相較於配方比 10:0:0 樣品較低，然加入了較大分子量的 P407DA 時，
因其鏈長較長，隨其量增多而使孔洞尺寸有逐漸增加的趨勢。巨分子單體列表與 其分子量如表 4.3.1 所示，SEM 圖中之樣品孔洞大小則如表 4.3.2 所示。
表 4.3.1 巨分子單體分子量
巨分子單體 分子量 (g/mol)
PEGDA ~6000
P407DA ~12500
mPDMS 600-800
由過去文獻中實驗證實孔洞尺寸與細胞、組織等長入有所關聯：於 5 微米左 右大小能夠誘使新生血管進入，纖維母細胞的長入需求則約為 5 至 15 微米大小，
成年哺乳動物的皮膚再生須為 20 至 125 微米大小，而骨骼再生則須為 100 至 350 微米大小的孔洞尺寸[118]。於本研究中所製成之水膠孔洞尺寸落在數十微米大小 的範圍且相互連接，能夠使鞏膜中的新生血管及合成膠原蛋白的纖維母細胞[119]
長入，進而能達到固定角膜襯裙的結果。
表 4.3.2 不同配方比之孔洞尺寸
配方比(PEGDA:P407DA:mPDMS) 尺寸(μm)
10:0:0 ~10
9:0:1 ~5
8:1:1 ~20
7:2:1 ~25
6:3:1 ~30
圖 4.3.1 配方比 PEGDA:P407DA:mPDMS = 10:0:0 水膠 SEM 圖 (左)500 倍放大 (右)1000 倍放大
圖 4.3.2 配方比 PEGDA:P407DA:mPDMS = 9:0:1 水膠 SEM 圖 (左)500 倍放大 (右)1000 倍放大
圖 4.3.3 配方比 PEGDA:P407DA:mPDMS = 8:1:1 水膠 SEM 圖 (左)500 倍放大 (右)1000 倍放大
圖 4.3.4 配方比 PEGDA:P407DA:mPDMS = 7:2:1 水膠 SEM 圖 (左)500 倍放大 (右)1000 倍放大
圖 4.3.5 配方比 PEGDA:P407DA:mPDMS = 6:3:1 水膠 SEM 圖 (左)500 倍放大 (右)1000 倍放大
4.3.2 水銀測孔儀結果
水銀測孔儀所得之結果如表 4.3.3 與圖 4.3.6 所示。表 4.3.3 中所呈現之孔徑大 小以中位數作為評估，以避免少數極端變數值的影響，由趨勢中可以發現其孔徑 大小結果與 SEM 相互呼應，皆是在加入 mPDMS 後孔徑變小，而 P407DA 的加入 則讓孔徑尺寸逐漸增大。而在孔徑分布的方面，由圖 4.3.6 可以發現，當水膠含有 mPDMS 成分時，數十奈米大小之孔洞始出現，然而隨著 P407DA 的加入因交聯度 變低，孔徑明顯有朝向大孔徑的趨勢。
另一方面在水銀測孔儀結果中，孔隙率與孔徑大小及澎潤比得出之孔隙率趨 勢則出現相反的結果，推測可能是由於水銀測孔儀施測方式是施以壓力迫使水銀 灌入孔隙，而交聯度較低而本身較為脆弱的水膠(樣品配方比 10:0:0 與 6:3:1)在測 量過程中，被壓力推擠產生變形，使最終測得之孔隙率反而最低，而交聯度較高 之水膠(樣品配方比 9:0:1、8:1:1 與 7:2:1)所測得之孔隙率因而得到較高的結果。
表 4.3.3 不同配方比之孔隙率與孔徑大小
配方比(PEGDA:P407DA:mPDMS) 孔隙率(%) 中位數孔徑大小(nm) 10:0:0 46.1161 2700.3
9:0:1 71.1572 1458.7 8:1:1 62.7307 2803.9 7:2:1 62.1029 11307.7 6:3:1 37.7329 17236.8
圖 4.3.6 不同配方比之水膠孔徑分布
4.4 動態機械性質
流變儀測得知剪力儲存模數(G’)結果如圖 4.4.1 所示，不同配方比之剪力儲存 模數並不隨剪力的頻率而改變，也就是說，當施以剪力的頻率不同時，水膠彈性 仍舊維持在同個數量級而未有顯著變化。不同的配方比測試之實驗結果顯示，當 水膠由單一的 PEGDA 構成至加入 mPDMS 時，因 mPDMS 之鏈長較短，所製成之 水膠孔洞交聯度高，而使剪力儲存模數明顯上升，然而隨著 P407DA 的加入，剪 力儲存模數交聯度變低而逐漸下降，所有樣品的剪力儲存模數落在 2000-20000 Pa 之間。
過去雖多數研究者因知角膜承受眼壓，而在角膜機械性質的測量時假設角膜 為等向性物質並致力於測量正向力之彈性性質，然而實際上由過去少數文獻中，
以豬角膜或是人角膜作剪力彈性性質的測量之結果皆發現，其剪力儲存模數測出 之數量等級並不同於正向力之彈性性質，並在不同的實驗參數下(控制應變或應力 改變等)，剪力儲存模數落於 2000-9000 kPa 之範圍內[120, 121]。將其結果對應至 吾人之研究中，雖配方比 6:3:1 之樣品接近過去文獻中人或豬眼角膜所測出剪力儲 存模數的底線，但所有樣品皆落於區間範圍內。
圖 4.4.1 不同樣品配方比之剪力儲存模數