第三章 材料與方法
3.4 動物實驗
以聚乳酸酯纖維編織而成的多孔性神經導管，充填銀杏葉酯後，評 估對截斷大鼠坐骨神經再生的影響。包含觀察實驗大鼠外表之變化、神
經再生情形、神經導管降解情形、再生神經之電生理功能評估、再生神 經之組織學定性及定量分析等五大項。
3.4.1 動物分組、麻醉與坐骨神經的神經導管接合術
選取滅菌前重量在 0.0255 g ± 3%範圍內的人造神經導管 30 管備 用。實驗動物則選用雌性 Sprague-Dawley (SD)大白鼠 30 隻，重量為 223~323 g，週齡為十二週。依神經導管中加入的溶液不同，隨機將大鼠 分為三組：A 組加入 Saline 作為對照組；B 組加入 Collagen；C 組加入 Collagen + Bilobalide 100 µM。每組各十隻 SD 大白鼠。
手術前先將大鼠麻醉，再將大鼠自透明麻醉箱中取出。把麻醉劑量 改為 3 litter/kg．min，再利用蛇形塑膠管輸送麻醉劑，並將此塑膠管套 於大鼠口鼻上，以保持其麻醉狀態。讓大鼠左側躺(頭朝前、面朝右側躺) 及右膝蓋彎曲，並以股骨頭的位置為中心，上下各約3 cm 的範圍，將大 鼠臀部及大腿的毛剃掉。剃毛區以優碘藥水(普威隆碘)自中心開始由內 向外消毒三次。最後再覆以無菌洞巾，只露出欲手術的部位。
大鼠消毒完成後，先以拇指及食指找到大鼠右側股骨頭上的大轉子 (greater trochanter of femur)及外側豆狀骨(lateral fabella)予以定位，並用 刀片沿此兩點之連線劃開皮膚，鈍性分離股二頭肌(biceps femoris muscle) 與筋膜，游離出長約2.5 cm 的坐骨神經。在距梨狀肌(piriformis)下緣約 8 mm 處，用剪刀整齊剪斷坐骨神經幹，再取已滅菌之神經導管，以 9-0 Nylon 縫合線將神經近側斷端固定在神經導管其中一端距導管邊緣 1 mm 處，並使斷端伸入管中。然後用 Pipet 與 Tip 依組別將藥物注入管中，
再以 9-0 Nylon 縫合線將神經遠側斷端固定在神經導管另一端距導管邊 緣1 mm 處(如圖 3.10)，並使斷端伸入管中而製造出 10 mm 的間距。
神經與神經導管縫合完畢後，以4-0 Catgut chrom 縫合肌肉及皮膚。
手術完畢後，測量大鼠體重，並將大鼠置回籠子，照光維持體溫，等待 動 物 甦 醒 。 以 抗 生 素 Pamoxicillin®( 內 含 Amoxicillin Trihydrate 1.5 gm/60ml，聯邦化學製藥股份有限公司，Taiwan) 1 g 溶解於 100 ml 逆滲 透水中，當作二天份之水給予自由飲水，預防傷口感染。
圖3.10 神經導管接合術縫合模型
實驗動物之飼養環境同皮下包埋實驗。並在飼養期間定期觀察大鼠 的飲食、大小便、傷口、毛色、活動情形與是否自殘等。
3.4.2 電生理檢測與導管降解情形的觀察
先將大鼠麻醉、剃毛與優碘消毒後，定位出大鼠右側之股骨頭上大 轉子，再以此點為中心用刀片沿股骨方向縱向劃開皮膚約2.5 cm。鈍性 分離股二頭肌與筋膜，將坐骨神經近側斷端與神經導管接合處完全暴露 出來，並以肉眼觀察神經導管降解情形。
本實驗以誘發電位儀(Neuropack Four Mini, Nihon Kohden Co., Japan) 作為神經肌肉複合動作電位之誘發，其步驟如下：以正負紀錄電極 (recording electrode)分別插入神經導管遠端之腓腸肌肌腱及肌腹處，另將 刺激電極(stimulating electrode)置於剛剛游離出來的神經導管近端。在刺 激電極釋放出相同電流刺激(2.0 mA)後，經過再生神經組織的傳導，於 誘發電位儀上可顯示神經肌肉複合動作電位波形；紀錄並計算出其產生 肌肉複合動作電位之波下面積、傳導速度、振幅、波期之值。
利用 SPSS 10.0 版統計套裝軟體，採單因子變異數分析(One-Way ANOVA)，探討各組資料數據在統計上有無差異。本實驗統計上檢定的 第一誤差設在 0.05，若 P＜0.05 則認定有統計上的明顯差異。當三組的 顯著差異存在時，再以Tukey 法做事後比較，檢定顯著差異存在哪二組 之間。
3.4.3 神經再生情形與術側腓腸肌萎縮程度的評估
電生理檢測完成後，將大鼠犧牲，再將植入的神經導管完全鈍性分 離出來並拍照。將導管兩側的神經幹盡量游離出來並截斷，取下的導管 含兩端的坐骨神經幹一併置入2.5% Glutaraldehyde 中保存。將大鼠術側 小腿皮膚劃開後，盡量將腓腸肌游離出來，從附著於股骨內外上髁之腓 腸肌內外側肌腱到附著於跟骨結節上之肌腱完整截斷取下，置入 3.7%
Formalin solution 中保存。固定兩天後，將大鼠術側腓腸肌標本置於乾淨 吸水紙上 1 min，以微量天平秤重並記錄之。再將標本置回乾淨吸水紙 上，1 min 後以微量天平秤重並記錄之。重複此步驟至所秤得的重量四 捨五入後，至小數點後第三位不變為止，事後並對重量進行統計分析。
最後取樣本中間部份做切片，以Paraffin wax 包埋，切片厚度為 12 µm，
並以Hematoxylin and eosin 染色。
再 生 神 經 組 織 連 同 神 經 導 管 與 兩 側 神 經 幹 ， 浸 泡 於 2.5%
Glutardialdehyde 三天後取出，利用刀片將導管均分為三等分。將中間三 分之一以刀片輕輕劃開，再把中央的再生神經組織剝下，過程中需注意 保 持 其 完 整 ； 將 再 生 神 經 組 織 置 入 含 2.5% Glutardialdehyde 、 4%
Paraformaldehyde 及 0.1 M Cacodehyde 混合液中。兩天後，將神經取出，
以1% OsO4固定約二小時，再以50~100%酒精脫水。用樹脂包埋後，將 含再生神經組織之樹脂置入60~70 ℃烤箱中約 16 hr，待樹脂硬化。隨後 將包埋之再生神經組織作橫向1 µm 切片後，以 Toluidine blue 染色，當 組織切片染色後，髓鞘與Schwann cell 會明顯呈色。
對再生神經組織切片先以接於顯微鏡的數位相機(Nikon Coolpix 950, Japan)拍下數位影像，再利用彩色影像分析軟體(Image-Pro Lite Version 3.0, Media Cybemestics, USA)做計算，並以試算軟體 Microsoft Excel XP 作分析。計算並分析切片的再生神經的全部面積、單一軸突的 平均面積、再生軸突的數目、神經內膜面積、再生軸突密度、軸突面積 佔神經內膜面積的百分比等。