北方墨點法（Northern blotting analysis）

（1）RNA 電泳分析

（i）1.2 ％ 洋菜膠（agarose gel）配製

取洋菜膠 0.55 g 加入 29.4 ml DEPC 處理過後的水，加熱溶解並混合均 勻，待稍冷卻後即加入 5 倍濃度的 formaldehyde gel running buffer 9 ml 及甲醛

（formaldehyde） 7.4 ml，再次混和均勻並製成膠體。

（ii）樣品製備

取出下列試劑分別加入微量離心管內並充份混合均勻：8 μg RNA， 2 μl 之 5 倍濃度的 formaldehyde gel running buffer，3.5μl 的 formadehyde (37％)，

10 μl 的 formamid。

（iii） 樣品變性（denature）及電泳處理

將樣本置於 65 ℃ 水浴 10 分鐘後，取出插至冰上，加入 5 μl 染劑 (6X RNA loading dye)，充份混合均勻後於室溫下，60 伏特電壓進行 RNA 電泳 2.5 小時。

（iv）膠體染色

電泳完成後，將膠體浸泡於 150 ml EtBr（Ethidum bromide）染液（0.5 μ g/ml EtBr 溶於 0.1 M ammonium acetate）染色 8 分鐘，接著以 DEPC 處理過 於 nylon membrane 上方，在濾紙、膠體、 nylon membrane 與濾紙相互之間必 須把氣泡完全趕出，避免 RNA 轉漬不完全。最後放一疊 6 ~ 7 cm 高的厚濾紙 ( 長寬約為 8 × 7 cm )在 Whatman 3MM 濾紙上，厚濾紙最上層置一塑膠板並用 500 公克重的血清瓶壓住。

轉漬過程進行 12 ~ 16 小時後，取出 nylon membrane，置於核酸快速固定 儀中，利用 UV 光（254 nm）照射 2 分鐘使 RNA 固定於 nylon membrane 上

以進行雜交反應。

（3）核酸探針製備

本實驗我們利用聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction；PCR）來擴 增一段序列上含有 DIG-11-dUTP ( Roche PCR DIG Probe Synthesis Kit Cat. No.

1 636 090 ) 的 DNA，用此段 DNA 來做為核酸探針，其做法敘述如下：將 63 μl 滅菌二次逆滲透水，10 μl 10X PCR reaction buffer，10 μl DIG-labeling mixture， 8 μl(25 ng/μl) DNA 模版，4 μl(20 μM ) primer 1 與 primer 2，

5 units Taq DNA polymerase，依序放入 0.5 ml 的微量離心管內（eppendorff tube），最終体積為 100 μl。混合均勻後放入聚合酶溫度循環機進行反應。

PCR 設定溫度如下：

將上述微量離心管內混合液先於 95℃ 下反應 5 分鐘，分開所有 DNA 模 板，再進行以下之溫度循環步驟：

(i) 95℃，1 分鐘：使兩股 DNA 模板分開。

(ii) 60℃，1 分鐘： primer 與 DNA 模板結合。

(iii) 72℃，1 分鐘： DNA polymerase 合成新股 DNA。

重覆上列溫度循環 30 次，之後進行 72℃，反應 10 分鐘，使最後一次合 成未完全的 PCR 產物合成完全，最終保存溫度設定為 4℃。

本實驗 fumA 核酸探針的 primer A1 及 primer A2 的序列如下：

primer A1：5’– GTTACTGACGCCGGGGAAACTG – 3’ (22 mer) primer A2：5’– CCAAGATTTTGCGCTTCGATCA – 3’ (22 mer)

fumA 核酸探針的預期長度為 250 bp，但由於在 dUTP 上接有 DIG 的關 係，在電泳膠上的位置會略高於 250 bp，約在 300 bp ~ 400 bp 之間。

fumC 核酸探針的 primer C1 及 primer C2 的序列如下：

primer C1：5’– GATTATGCTCGAGCATCGCTACCCA –3’ (25 mer)

primer C2：5’– CGACGAATTCCCGCTGGCTATCTGGCA –3’ (27 mer)

（4）雜交反應（hybridization）

將 RNA 固定在上面的 nylon membrane 放入玻璃雜交管內，加入 15ml 的 hybridization buffer，於 42℃ 核酸雜交烘箱旋轉反應 30 分鐘，轉速設定為 30 rpm，此過程稱為 Pre-hybridization。之後加入 150 ng 的核酸探針 (核酸探針需 先以 100℃ 煮沸 10 分鐘後，置於冰上 10 分鐘)，繼續進行 42℃ 的核酸雜交 烘箱旋轉反應，反應時間為 14 ~ 18 小時。反應結束後將 nylon membrane 自玻 璃雜交管取出，平放於微免疫偵測反應盒內，加入含 2 X SSC， 0.1 ％ SDS 的 洗滌液 50 ml，在室溫下以平面震盪的方式清洗 5 分鐘，震盪速度為 25 rpm，

共洗二次；再用含 0.1 X SSC， 0.1 ％ SDS 的洗滌液 50 ml 清洗 15 分鐘，

共洗 三 次。

（5）免疫偵測（immunological detection）

本實驗所採用的是 Roche 公司所生產的 DIG Wash and Block Buffer Set (Cat. No. 1 585 762)，內含有 10 倍濃度的 buffer 1、2、3 和 4。將 nylon membrane 用洗滌液清洗完畢後，用 30 ml 的 1X buffer 1 清洗 5 分鐘，倒掉 1X buffer 1 後， 加入 30 ml 的 1X buffer 2 與 1X buffer 3 混和液，於室溫下，

以平面震盪的方式搖動 40 分鐘，震盪速率為 25 rpm 。目的在於使 buffer 3 中 的 Brovine Serium Albumin (BSA) 均勻佈滿整張 nylon membrane 表面，避免 anti-DIG-AP 直接與 nylon membran 結合，此舉可以減少大量非專一性之鍵結

（non-specific binding），這個步驟稱為 blocking 。反應結束後將 3 μl 的 anti-DIG-AP( Roche Cat. No. 1 093 274 ) 加入 30 ml 的 1X buffer 2 與 1X buffer 3 混和液，於室溫下搖動 40 分鐘，使 anti-DIG-AP 與核酸探針上的 DIG 形成專一性之鍵結。之後於室溫下，用 30 ml 的 1X buffer 1 清洗兩次，每次 15 分鐘。倒掉 1X buffer 1 後，加入 15 ml 的 1X buffer 4 清洗 5 分鐘，之後把 nylon membrane 平放於投影片夾層內，將 10 μl 的 CSPD^® 溶於 1 ml 的 1X

buffer 4 內，均勻灑佈於 membrane 上，蓋上投影片，立刻置於底片夾內，於室 溫下避光進行反應 15 分鐘。反應後於暗房內以 X 光底片（Kodak XAR-5）進 行壓片，感光適當時間後沖洗底片。

（6）訊號分析

利用掃描器（Microteck）將底片掃成 .tif 圖檔，存進電腦中，再利用 Zero-Dscan Quantitative Gel and Blot Analysis (Scannalytics) 軟體偵測每一個雜交 訊號（hybridization signal）的強度，並將所測得的數值與不同的採樣時間點做 一關係圖，利用線性回歸分析在不同時間點所得的雜交訊號強度，可算得 mRNA 的半衰期。