4.2 影響 fumA 與 fumC mRNA 穩定性的因素
4.2.4 RNase E 與 poly(A) 聚合酶對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性
4.2.3 poly(A) 聚合酶對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性之影響
poly(A) 聚合酶可以在 mRNA 3’ 端加上一段 poly(A) tail，增加核糖核酸外 切酶的活性，是目前研究 mRNA 降解中頗受重視的基因。本實驗為利用醱酵槽 進行連續式培養 poly(A) 聚合酶單基因突變株 YHC3393，觀察不同生長速率 下， poly(A) 聚合酶對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性的影響。
以連續式培養 YHC3393，控制細胞的生長速率，當細胞達穩定狀態，加入 rifampicin 停止 mRNA 的新合成，並在加入 rifampicin 後的不同時間點抽取菌體 總 RNA，取定量總 RNA 進行北方墨點法，所得結果利用 Zero-Dscan 軟體測 定各訊號的強度，並計算 mRNA 半衰期，即可測定大腸桿菌 fumA 與 fumC mRNA 的穩定性。
poly(A) 聚合 酶 突變 後，隨著生長速率 由 0.24/h 上升到 0.72/h ， fumA mRNA 半衰期由 1.5 分鐘上升到 3.7 分鐘（表三）。當生長速率由 0.24/h 上升 到 0.96/h，fumC mRNA 半衰期由 2.2 分鐘上升到 4.8 分鐘（表四）。可知當 poly(A) 聚合酶突變後，不論是 fumA 或 fumC mRNA 的穩定性皆隨著生長速 率上升而上升（見圖八、圖九）。
4.2.4 RNase E 與 poly(A) 聚合酶對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性之影響 本 實 驗 為 以 連 續 式 培 養 ， 觀 察 RNase E 與 poly(A) 聚 合 酶 同 時 缺 失
（LK01）時，不同生長速率下，fumA 與 fumC mRNA 穩定性的變化。
將 LK01 培養於 33℃，並且控制細胞的生長速率，當細菌生長至穩定狀 態，再將溫度升至 44。C 、30 分鐘使 rne 基因突變，而且原本 poly(A) 聚合酶 也突變的情況下，加入 rifampicin 停止 mRNA 的新合成，並在加入 rifampicin
後的不同時間點抽取菌體總 RNA，取定量總 RNA 進行北方墨點法，利用 Zero-Dscan 軟體測定實驗結果各訊號的強度，並以 mRNA 半衰期計算公式加 以計算，即可測定大腸桿菌 fumA 與 fumC mRNA 的穩定性。
結果發現，當 RNase E 與 poly(A) 聚合酶都缺失的情況下，隨著生長速率 由 0.24/h 上升到 0.48/h，fumA mRNA 的半衰期由 22 分鐘上升到 55 分鐘
（表三），fumC mRNA 半衰期由 50 分鐘上升到 58 分鐘 （表四）。可知當 RNase E 與 poly(A) 聚合酶雙重突變後，不論是 fumA 或 fumC mRNA 的穩定 性皆隨著生長速率上升而上升（見圖十、圖十一）。
五、討論
5.1 不同碳源對大腸桿菌 fum A 基因表現之影響
本實驗以批次式培養，碳源為 10 mM 葡萄糖或 10 mM 醋酸，利用大腸桿 菌野生株 （K12-W3110）、 N3431 的 isogenic strain（N3433）及 RNase E 單 基因突變株（N3431）探討 fumA 基因在轉錄、轉錄後與轉譯層次的表現。
5.1.1 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄層次之影響
在大腸桿菌內葡萄糖主要以主動運輸進入細胞，再經由醣解作用產生能 量。醋酸則以 acety-CoA 的形式進入細胞，進行檸檬酸循環。相同濃度的葡萄 糖與醋酸作為碳源時，葡萄糖可以提供較多的能量與碳原子，因此在批次式培 養時，大腸桿菌在上述兩種不同碳源會有不同的生長速率。
在轉錄層次方面，無論是 K12-W3110、 N3433 或 N3431，細胞以醋酸為 碳源時，fumA mRNA 表現量皆大於以葡萄糖為碳源時 (見圖一)。K12-W3110 以醋酸為碳源時，fumA mRNA 表現量較葡萄糖為碳源時上升 4 倍，在 N3433 中則上升 23 倍，在 N3431 中上升 21 倍。此現象與利用 microarray 的結果相 同 (Oh et al., 2002)。
上述變化可能與 glucose catabolite repression 有關，已知 fumA 基因前端有 CRP binding site，基因的表現會受到 cAMP 所調控。當碳源為葡萄糖時，細胞 內 cAMP 濃度下降，使 fumA 基因轉錄作用下降，故 fumA mRNA 表現量下 降。因此在 cAMP 突變株中，兩種碳源的差異會大幅降低 (Tseng et al., 2001)。
5.1.2 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄後層次之影響
在轉錄後層次方面，無論是 K12-W3110、N3433 或 N3431，細胞以葡萄 糖為碳源時，fumA mRNA 的半衰期皆大於以醋酸為碳源時 (見圖二)。當 K12-W3110 以葡萄糖為碳源，fumA mRNA 半衰期較以醋酸為碳源時上升 0.7 倍，在 N3433 中則上升 0.5 倍，在 N3431 中上升 1.6 倍（見表二）。
目前已知影響 mRNA 穩定性的因素有四類：（1）核糖核酸酶，（2）mRNA
綜合上述實驗結果，無論是 K12-W3110、 N3433 或 N3431，在轉錄層次，
以醋酸為碳源 fumA mRNA 表現量皆大於以葡萄糖為碳源。在轉錄後層次，以
表現影響則需以 N3431 的 isogenic strain N3433 作為實驗菌株，故在本實驗中 率 調控 的 基 因有 ribosomal proteins (Dennis and Bremer, 1974)、 glucose 6 phosphate、6-phosphogluconate dehydrogenase (Wolf et al., 1979)、chloramphenicol acetyltransferase、 OmpA (Nilsson et al., 1984)、 succinate dehydrogenase (Park et al., 1995b)、malate dehydrogenase (Park et al., 1995a; Park et al., 1995b) 等。
由 5.1.3 結果可知影響 FumA 蛋白質表現量主要是轉錄後層次的調控，即 mRNA 的穩定性對於蛋白質表現量具有重大的影響。從 5.1.2 中可知影響 mRNA 穩定性有四大因素，所以接下來的實驗將探討影響 fumA 與 fumC mRNA 穩定性因素中的 RNase E 與 poly(A) 聚合酶。
5.3 RNase E 對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性之影響
mRNA 的 3’ 端會接上一段 poly(A) tail，使核糖核酸外切酶易於作用。本實驗
mRNA 穩定性大幅提昇，比 RNase E 單基因突變後更穩定，但 poly(A) 聚合
大腸桿菌有 7 個 rRNA gene clusters，其組成方式皆為：promoter - 16S rRNA - tRNA - 23S rRNA - 5S rRNA - terminator。它們進行 processing 的方式也 都相似，先由 RNase III 進行雙股 RNA 的切割，產生 16S rRNA 與 23S rRNA
最終形成成熟的 23S rRNA (Li et al., 1999)。我們所推測參與 rRNA processing 且受 poly(A) 聚合酶調控的酵素為何，須經更進一步的探討。
綜合以上實驗結果可知，將細胞培養在不同碳源下，fumA 基因在轉錄、轉 錄後和轉譯層次方面的表現會有所不同，顯示此三個層次基因表現均受到碳源
的調控，而決定 FumA 蛋白質表現量是轉錄後層次的調控為主。 (Mohanty and Kushner, 1999, 2000)。
除了核糖核酸酶外，核糖體及 mRNA 二級結構對 mRNA 降解也有影響
六、論文圖表
Source or refer enc e
E. coli genetic stock center of Yale. university Dr. Sue Lin-Chao (Kaberdin et al., 1996) Dr. Sue Lin-Chao (Kaberdin et al., 1996) Dr. Sue Lin-Chao (Kaberdin et al., 1996) Dr. Sue Lin-Chao (Kaberdin et al., 1996)Ge no type a n d re lev ant m ark ers
derived from K-12, F¯IN(rrnD-rrnE)1 lacZ43, relA, spoT1, thi1 lacZ43, relA, spoT1, thi1, rne-3071ts Tcr , lacZ43, relA, spoT1, thi1, pcnB Tcr , lacZ43, relA, spoT1, thi1, rne-3071ts , pcnB表一、本 實驗所 使 用的大腸 桿菌野 生 株與突變 株 E . coli st rai n K1 2-W 3 1 1 0 N3 4 33 N3 4 31 YH C3 3 93 LK 01
ts：Temperature sensitive mutant Tcr ：Tetracyclin resistance
表二、大腸桿菌 K12 、 N3433 與 N3431 以批次式、不同碳源
（10mM 葡萄糖或醋酸）培養下，對 fumA mRNA 穩定性之 影響。
Unit：min
Chemical half-lives of fumA mRNA
E. coli strain Glc Ace
K12 N3433 N3431
2.5 1.5
3.2 2.1
9.8 3.8
表三、大腸桿菌 N3433、 N3431、 YHC3393 與 LK01 以 2.5mM 葡 萄糖為碳源，在連續式培養下，生長速率對 fumA mRNA 穩定 性之影響。
Unit：min
--：Not determined
2.2 7.4 1.5 22 2.8 16 2.9 55 3.5 21 3.7
-- 5.4 -- --
-- Cell growth
rate k (1/h)
N3433 (wild type)
YHC3393 (pcnB¯ ) N3431
(rne¯ )
LK01 (rne¯pcnB¯ )
0.24 0.48 0.72 0.96
Chemical half-lives of fumA mRNA
表四、大腸桿菌 N3433、 N3431、 YHC3393 與 LK01 以 2.5mM 葡 萄糖為碳源，在連續式培養下，生長速率對 fumC mRNA 穩定 性之影響。
Unit：min
--：Not determined
2.5 17 2.2 50 3.8 21 3.8 58 4.4
--
4.5
-- -- 28
4.8 -- Cell growth
rate k (1/h)
N3433 (wild type)
YHC3393 (pcnB¯ ) N3431
(rne¯ )
LK01 (rne¯pcnB¯ )
0.24 0.48 0.72 0.96
Chemical half-lives of fumC mRNA
（A）
（B）
圖一、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖或醋酸) 培養下，(A) fumA mRNA 表現量 之北方墨點圖。(B)電泳圖。
K12 N3433 N3431 Glc Ace Glc Ace Glc Ace
fumA
23S rRNA 16S rRNA
（A）
K12
（B）
N3433
（C）
N3431
圖二之一、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖或醋酸) 培養下，fumA mRNA 穩定性之北 方墨點圖。（A）K12，（B）N3433，（C）N3431。
Glucose Acetate
0 0.5 1.5 3 5 7 9 12 min 0 0.5 1.5 3 5 7 9 12 min
0 1.5 3 6 9 12 18 24 min 0 1.5 3 6 9 12 18 24 min
（A）
K12
（B）
N3433
（C）
N3431
Glucose Acetate
圖二之二、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖或醋酸) 培養下，fumA mRNA 穩定性之電 泳圖。 （A）K12，（B）N3433，（C）N3431。
23S rRNA 16S rRNA
（A）
（B）
圖三、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖或醋酸) 培養下， （A）FumA 蛋白質表現量之 西方墨點圖。 （B）菌體總蛋白質之電泳圖。
N3431 N3433 K12 Ace Glc Ace Glc Ace Glc
K12 N3433 N3431 Glc Ace Glc Ace Glc Ace
60 kDa
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
k = 0.96/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
k = 0.96/h
圖四、大腸桿菌 N3433 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速 率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。
23S rRNA 16S rRNA
0 0.5 1 1.5 2 3 5 8 min
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
圖五、大腸桿菌 N3433 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速 率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。
23S rRNA 16S rRNA
0 0.5 1 1.5 2 3 5 8 min 0 0.5 1.5 3 5 7 9 12 min
0 0.5 1 1.5 2 3 5 8 min
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
圖六、大腸桿菌 N3431 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速 率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。
0 1.5 3 6 9 12 18 24 min
23S rRNA 16S rRNA
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.96/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.96/h
圖七、大腸桿菌 N3431 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速 率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。
0 1 3 5 8 12 20 30 min 1 3 5 8 12 20 30 min
23S rRNA 16S rRNA
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
圖八、大腸桿菌 YHC3393 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長 速率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。
0 1.5 3 6 9 12 18 24 min
23S rRNA 16S rRNA
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
k = 0.96/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
k = 0.72/h
k = 0.96/h
0 1.5 3 6 9 12 18 24 min
圖九、大腸桿菌 YHC3393 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長 速率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。
23S rRNA 16S rRNA
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
圖十、大腸桿菌 LK01 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率 下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。
23S rRNA 16S rRNA
0 5 10 20 30 40 50 60 min
（A）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
（B）
k = 0.24/h
k = 0.48/h
圖十一、大腸桿菌 LK01 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速 率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。
0 5 10 20 30 40 50 60 min
23S rRNA 16S rRNA
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