國立交通大學
生物科技研究所
碩士論文
碳源與核酸內切酶對大腸桿菌延胡索酸酶
fumA、fumC 基因表現之研究
Effect of carbon source and endoribonuclease
on fumA and fumC genes expression
in Escherichia coli
研 究 生：林 靜 雪
指導教授：曾 慶 平 博 士
中文摘要
本實驗室先前研究結果發現，fumA 與 fumC 的 mRNA 穩定性會隨著細菌 生長速率上升而增加。本研究中，我們將大腸桿菌培養在不同碳源下，分別觀 察在轉錄、轉錄後與轉譯三個層次 fumA 基因表現情形。為探究影響 mRNA 穩 定性的因子為何，我們使用連續式培養來觀察核糖核酸內切酶 RNase E 與 poly(A) 聚合酶在不同生長速率下，對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性的影響。
結果顯示在轉錄層次，以醋酸為碳源時，fumA mRNA 表現量比以葡萄糖 為碳源時較多。在轉錄後層次，以葡萄糖為碳源時，fumA mRNA 較以醋酸為 碳源時穩定。在轉譯層次，以葡萄糖為碳源時，FumA 蛋白質比以醋酸為碳源 時表現量較多。在連續式培養下，fumA 與 fumC mRNA 穩定性會隨著細菌生 長速率上升而增加。當細胞內 RNase E 突變後，fumA 與 fumC mRNA 皆比 野生株明顯穩定，但仍受生長速率的調控。當 poly(A) 聚合酶缺失後，fumA 與
fumC mRNA 的穩定性與野生株比較後並沒有顯著改變。當 RNase E 與
poly(A) 聚合酶同時缺失，fumA 與 fumC mRNA 的穩定性則大幅提昇，比 RNase E 單獨缺失時更穩定。此研究結果顯示 fumA 與 fumC 基因在轉錄、轉 錄後與轉譯均受碳源及生長速率所調控。
Abstract
The previous studies showed that fumA and fumC mRNA stability increased with cell growth rate. In this study, we examined the effect of different carbon sources on fumA gene expression in transcription, post-transcription, and translation level, and used continuous culture to examine the effect of RNase E (rne) and poly (A) polymerase I (pcnB) on fumA and fumC mRNA degradation under different growth rates in E. coli.
The results of this study demonstrated that fumA mRNA amount was higher in acetate medium than in glucose medium at transcription level. In post-transcription level, fumA mRNA was more stable in glucose medium than in acetate medium. In translation level, FumA protein was higher in glucose medium than in acetate medium. In continuous culture, both fumA and fumC mRNA stability increased with cell growth rate. The stability of fumA and fumC mRNA in rne－ strain were higher than in wild type strain. There were no significant change of fumA and fumC mRNA stability in pcnB－ strain. In rne－pcnB－ double mutant, fumA and fumC mRNA stability were higher than in rne－ strain. These results indicated that fumA and fumC gene expression were regulated by carbon sources and growth rates at transcription, post-transcription, and translation levels.
誌謝
感謝指導教授曾慶平老師在實驗及生活上的指導、支持及鼓勵，並感謝彭 慧玲老師及楊昀良老師在論文上的悉心指導及口試時給予許多的寶貴意見，在 此致上最誠摯的謝意。 過去這兩年有歡笑、有淚水，我要特別感謝校賢小弟和宗益爸爸對我實驗 上的指導及生活上的照顧，還要感謝實驗室的伙伴們支持我一起度過這難忘的 時光，育甄學姐、國領學長、煜沛學長、慧貞阿姐、岳賢、慧君、惠文、郁婷、 巧璇、繼元、愛雁、冀冬、智彬、翊維。此外還要感謝阿金總是聽我吐苦水， 雖然不常見面，但仍讓我感覺你就在我身邊關心我。 最後感謝所有指導過我的老師與朋友，謝謝大家陪伴我一同成長！目錄
頁次 中文摘要………...i 英文摘要…………..………..ii 誌謝...iii 目錄……….………..iv 表目錄……….….………...vi 圖目錄……….……….vii 附圖目錄……….viii 一、緒論與研究目的 ...1 二、文獻回顧 ...3 2.1 延胡索酸酶...3 2.1.1 延胡索酸酶之特性...3 2.1.2 延胡索酸酶在細胞內之調控...4 2.2 碳源對大腸桿菌生長之影響 ...5 2.3 生長速率對大腸桿菌基因表現之調控 ...5 2.4 大腸桿菌 mRNA 之降解機制 ...6 2.5 核糖核酸酶對 mRNA 穩定性之影響 ...6 2.5.1 核糖核酸內切酶...6 2.5.2 核糖核酸外切酶...8 2.6 mRNA 結構對其穩定性之影響 ...10 2.6.1 5’ 端結構對 mRNA 降解之影響 ...10 2.6.2 3’ 端結構對 mRNA 降解之影響 ...10 2.7 核糖體對 mRNA 穩定性之影響 ...11 2.8 其他修飾或輔助之蛋白質 ...11 2.9 Degradosome ...13 三、材料與原理方法 ...15 3.1 材料...15 3.1.1 菌種 ...15 3.1.2 藥品與試劑 ...153.2 原理...18
3.2.1 批次式培養（batch culture）之細胞生長模式 ...19
3.2.2 連續式培養之動力學模式...20
3.2.3 聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction，PCR）之原理...21
3.2.4 mRNA 半衰期計算原理 ...22
3.3 方法...22
3.3.1 大腸桿菌生長條件控制與培養方法...23
3.3.2 大腸桿菌總 RNA 製備方法...25
3.3.3 mRNA 穩定性測定方法 ...26
3.3.4 北方墨點法（Northern blotting analysis） ...26
3.3.5 蛋白質上清液之製備...30
3.3.6 蛋白質濃度測定...30
3.3.7 蛋白質凝膠電泳法...31
3.3.8 西方墨點法 (Western blotting analysis)...31
四、結果 ...33
4.1 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因表現之影響 ...33
4.1.1 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄層次之影響 ...33
4.1.2 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄後層次之影響 ...34
4.1.3 不同碳源對大腸桿菌 FumA 蛋白質在轉譯層次之影響...34
4.2 影響 fumA 與 fumC mRNA 穩定性的因素 ...35
4.2.1 生長速率對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性之影響 ...36
4.2.2 RNase E 對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性之影響 ...36
4.2.3 poly(A) 聚合酶對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性之影響...37
4.2.4 RNase E 與 poly(A) 聚合酶對 fumA 與 fumC mRNA 穩定性 之影響 ...37
五、討論 ...39
六、論文圖表 ...46
七、參考文獻 ...62
表目錄
表一、本實驗所使用的大腸桿菌野生株與突變株。………..……….46 表二、大腸桿菌 K12、N3433 與 N3431 以批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖 或醋酸) 培養下，對 fumA mRNA 穩定性之影響。…...………...……47 表三、大腸桿菌 N3433、 N3431、 YHC3393 與 LK01 以 2.5mM 葡萄糖為 碳源，在連續式培養下，生長速率對 fumA mRNA 穩定性之影響。...…48 表四、大腸桿菌 N3433、 N3431、 YHC3393 與 LK01 以 2.5mM 葡萄糖為 碳源，在連續式培養下，生長速率對 fumC mRNA 穩定性之影響。…...49圖目錄
圖一、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖 或醋酸) 培養下，(A) fumA mRNA 表現量之北方墨點圖。(B)電泳圖。...50 圖二之一、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡
萄糖或醋酸) 培養下，fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。（A）K12， （B）N3433，（C）N3431。………...……….….…….……….51 圖二之二、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡
萄糖或醋酸) 培養下，fumA mRNA 穩定性之電泳圖。（A）K12，（B） N3433，（C）N3431。……….………....……….52 圖三、大腸桿菌 K12、 N3433 與 N3431，在批次式、不同碳源 (10mM 葡萄糖 或醋酸) 培養下，（A）FumA 蛋白質表現量之西方墨點圖。（B）菌體總蛋 白質之電泳圖。………..….…....53 圖四、大腸桿菌 N3433 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。………..………....….54 圖五、大腸桿菌 N3433 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。………..…..…...55 圖六、大腸桿菌 N3431 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。………...…….56 圖七、大腸桿菌 N3431 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。………...……....57 圖八、大腸桿菌 YHC3393 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。………..…...58 圖九、大腸桿菌 YHC3393 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B) 電泳圖。……….………....……59 圖十、大腸桿菌 LK01 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumA mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。………...…..……60 圖十一、大腸桿菌 LK01 以 2.25mM 葡萄糖為碳源，在不同生長速率下，(A) fumC mRNA 穩定性之北方墨點圖。(B)電泳圖。…..….…..…....……..61
附錄目錄
附圖一、RNase E 切割位置之核苷酸序列比較。……….………..72 附圖二、大腸桿菌 K12 在連續式培養下，以葡萄糖為碳源，(A) fumA mRNA，
(B) fumC mNRA 穩定性分析圖。……….………...73 附圖三、在批次式培養下，大腸桿菌野生株與核糖核酸酶突變株 fumA mRNA 穩 定性分析。（A）野生株 N3433，（B） RNase E（rne） 與 PNPase（pnp） 突變株，（C）RNase G（rng）、 RNaseIII（rnc）與 RNase I（rna）突 變株。………..…….……….74 附圖四、大腸桿菌中 RNA 降解的機制之一。……….………..75 附圖五、大腸桿菌以連續式培養，控制細胞比生長速率為 0.72/h，取定量總 RNA
一、緒論與研究目的
許多研究報告指出細胞生長環境中的養分、溫度、供氧量、酸鹼度、滲透 壓等因子的改變會造成細胞生理與細胞生長的變化。西元 1958 年，Schaechter 等人研究 Salmonella typhimurium 時首先發現細胞內巨分子的組成會受到生長 速率的增加而改變 (Schaechter et al., 1958)。之後的研究也陸續證實 DNA、 RNA、核糖體（ribosome）等巨分子會隨生長速率不同而改變。
大腸桿菌內蛋白質表現量多寡取決於轉錄的 mRNA 表現量、轉錄後的 mRNA 穩定性及轉譯效率。mRNA 表現量之調控機制在先前的科學研究中已有 明確概念，但在 mRNA 穩定性的調控機制方面，因原核生物 mRNA 半衰期比 真核生物短許多 (Rauhut and Klug, 1999)，不易進行相關研究，一直到近十年來 才有較多的研究報告 (Xu and Cohen, 1995)。其中以 RNase E 為主體架構的 degradosome 是探討大腸桿菌 mRNA 穩定性中最重要的發現之一 (Miczak et
al., 1996)。
大腸桿菌屬於兼性厭氧菌（facultative anaerobes），在有氧環境下進行有氧 呼吸的代謝路徑；而在無氧環境下，可藉醱酵（fermentation）的代謝途徑而獲 得能量。延胡索酸酶（fumarase）為檸檬酸循環（TCA cycle）中重要的一員， 在大腸桿菌內有三種延胡索酸酶，分別為 FumA、 FumB 及 FumC。在有氧呼 吸時，FumA 與 FumC 負責催化檸檬酸循環中延胡索酸（fumarate）轉變為蘋 果酸（L-malate）的步驟，當無氧發酵時，則由 FumB 將蘋果酸催化為延胡索 酸。有氧環境下，FumA 蛋白質會被大量表現，FumB 在無氧環境下才表現， FumC 則是當細胞受到高氧應力時才會被誘導。
先前本實驗室研究曾發現，細菌生長會受到培養基碳源的影響，因此本論 文即探討不同碳源下 fumA 基因的表現情形，我們分別從轉錄、轉錄後及轉譯 三個層次進行觀察。此外本實驗室也發現，fumA 與 fumC mRNA 的穩定性會隨
生長速率上升而上升，因此在本論文中也探討了影響 fumA 及 fumC mRNA 穩 定性的因子為何，希望能建立模式以了解檸檬酸循環中其他酵素調控的相關機 制，並可進一步了解細菌生理與基因調控的關係。
二、文獻回顧
2.1 延胡索酸酶 延胡索酸酶（fumarate hydratase；fumarase；EC4.2.1.2）是大腸桿菌體內負 責將延胡索酸與蘋果酸相互轉換的酵素。當細胞進行有氧呼吸時，檸檬酸循環 為主要的代謝途徑，可作為醣類、脂質和蛋白質氧化過程中的共同途徑，也能 提供細胞內生合成所需之碳源。因此細胞內延胡索酸酶若有任何缺失，檸檬酸 循環將會中斷並造成細胞無法利用延胡索酸，此時細胞無法進行有氧呼吸而產 生較少能量。 大腸桿菌為兼性厭氧菌，延胡索酸酶在有氧時參與檸檬酸循環，在無氧時 進行草醯乙酸（oxaloacetate）到琥珀酸（succinate）的還原途徑，以延胡索酸做 為細胞處於無氧環境下的電子接受者 (Guest, 1992)，因此不論在有氧無氧的環 境下，延胡索酸酶都是大腸桿菌代謝上重要的基因。 2.1.1 延胡索酸酶之特性 已知大腸桿菌體內有三種不同的延胡索酸酶基因：fumA、fumB 及 fumC ， 各有不同的特性 (Guest and Roberts, 1983)。fumA 基因位於大腸桿菌基因圖譜 （linkage map）35.5 分鐘的位置，可轉錄出 1760 bp 的 mRNA。fumB 基因位 於大腸桿菌基因圖譜 93.5 分鐘的位置，相鄰 mel operon，整個構造基因有 1641 bp (Bell et al., 1989)。而 fumC 基因也是位於大腸桿菌基因圖譜 35.5 分鐘位 置，即位於 fumA 基因的下游，其轉錄方向與相鄰的 fumA 基因相同 (Guest etal., 1985)，整個 fumC 構造基因有 1398 bp。
比較 fumA 、 fumB 與 fumC 三種基因及其產物，可將它們分為兩類：
fumA 和 fumB 的基因序列很相似，其基因產物都是由兩個 60 kDa 的單體組合
FumA 和 FumB 的結構相似，但彼此的酵素動力學性質則不同。FumA 對延胡 索酸的親和性比對蘋果酸高，FumB 則相反 (Woods et al., 1988)。每一個 FumA 蛋白質單體含有一個 4Fe-4S cluster，被氧化後會變成 3Fe-4S cluster 而失去活 性。但可藉由加入鐵 （ferrous ammonium sulfate） 及 thiol （2-mercaptoethanol） 後，將 FumA 重新活化 (Flint et al., 1992)。至於 FumC 則被劃分為 class II enzyme，同一類酵素包括 aspartase（Escherichia coli）、fumarase（Bacillus subtilis、
Saccharomyces cerevisiae、mammalian），這些酵素在序列上有很高的相似性，不
同於 class I enzyme 的 FumA 及 FumB (Wu and Tzagoloff, 1987)。FumC 是由 四個 50 kDa 的單體所組成的四分體蛋白（tetramer）(Cassio et al., 1975)，為熱 安定性且其活性中心不需要鐵離子，FumC 對延胡索酸的親和性比對蘋果酸 高，此點則與 FumA 相似 (Ueda et al., 1991)。
2.1.2 延胡索酸酶在細胞內之調控
FumA 蛋白質在有氧條件下會大量合成，其產量比 FumB 或 FumC 高很 多，但在厭氧下 fumA 基因表現則會受到抑制。研究指出在無氧條件下培養
arcA 和 fnr 缺 失 的 突變株時 ， fumA 基 因表現則 不受抑 制 (Iuchi and Lin,
1988)，此結果表示 fumA 基因在無氧條件下的表現可能是受 ArcA 及 Fnr 所 調控。另外，最近研究發現 FumA 會受葡萄糖抑制 (Park and Gunsalus, 1995)， 其原因可能是 fumA 啟動子上的一個 CRP（cAMP receptor protein）結合位置所 造成。
FumB 被認為是在無氧環境中表現的延胡索酸酶，在無氧環境下酵素活性 較有氧環境下表現量高，但 FumB 在無氧時的表現量仍不及 FumA 在無氧下 的表現量，研究報告指出 fumB 基因表現受厭氧下的轉錄調節子 Fnr 所調控 (Guest and Roberts, 1983; Tseng, 1997)。
FumC 在細胞內會持續被少量製造出來，且 FumC 的表現可藉著加入氧化 劑而增加，這是因為 fumC 基因受控於 soxRS 調節組（regulon）(Liochev and
Fridovich, 1992; Weaver et al., 1993)，大腸桿菌在遭受高氧應力 (oxygen stress) 或受到可產生過氧化物的氧化試劑破壞時，細胞內會被誘導出將近四十種的蛋 白質，而其中的 SoxR（superoxide response）會在轉錄上正向調節許多蛋白質的 產生，FumC 即為其中的一種蛋白質。這些誘導出的蛋白質可以用來修復 superoxide radical（O2－）、 hydrogen peroxide（H2O2）及 hydroxyl free radical (• OH) 對細胞所造成的傷害。另外，研究也發現鐵離子缺乏時會增加 fumC 基因 的表現，fumA 基因仍持續表現但無法產生具有功能的 FumA 蛋白質，至於 FumB 是否受鐵離子的調控，目前仍不清楚 (Park et al., 1995a)。
綜合以上結果，可知 FumA 在微氧環境下會被大量表現，為檸檬酸循環中 主要的延胡索酸酶。FumB 則在無氧環境下才表現，但其表現仍不如 FumA 在 無氧環境的表現。而 FumC 是當細胞受到高氧應力或鐵離子濃度很低時取代 FumA 的功能 (Tseng et al., 1994)。
2.2 碳源對大腸桿菌生長之影響 大腸桿菌可以利用不同碳源來進行細胞的合成與代謝，不同碳源經過不同 代謝途徑以產生不同能量及不同的生長速率。當以葡萄糖為碳源時，細胞利用 phosphotransferase system 將細胞外的葡萄糖磷酸化後帶入細胞內進行糖解作用 （glycolysis），代謝產物以 acetyl-CoA 為主，並進入檸檬酸循環，氧化後成為 二氧化碳與水並產生能量。若是以醋酸為碳源，醋酸會藉由主動運輸進入細胞， 經由 acetate kinase 與 phosphotransacetylase，或 acetyl-CoA synthetase 將醋酸 轉換成 acetyl-CoA，之後進入檸檬酸循環。同時大腸桿菌亦可經由 glyoxylate bypass 來代謝 acetyl-CoA，當環境中有葡萄糖時，醋酸代謝基因通常會被抑制。
2.3 生長速率對大腸桿菌基因表現之調控
1958 年，Schaechter 等人研究 Salmonella typhimurium 時首先發現細胞內 巨 分 子 的 組 成 ， 如 DNA 、 RNA 、 蛋 白 質 ， 會 隨 生 長 速 率 的 增 加 而 增 加
(Schaechter et al., 1958)。不同營養源會影響細菌生長速率及大腸桿菌內基因表現 改變 (Pedersen et al., 1978)。在營養成分較高的環境中，細胞的生長速率較快， 並擁有較穩定的 rRNA 與 tRNA （Keener and Nomura, 1996; Grunberg-Manago, 1996）。此外，研究指出生長速率對於細胞的轉錄作用、轉譯作用、染色體複製 均有重要的影響，其中 RNA 聚合酶（RNA polymerase）活性、 DNA 合成速 率、RNA 合成速率及蛋白質合成速率等均受到生長速率所調控，因此細胞生長 速率與基因調控的關係相當密切 (Dennis and Bremer, 1974; Bremer and Dennis, 1987)。 2.4 大腸桿菌 mRNA 之降解機制 大腸桿菌中許多蛋白質表現量，取決於 mRNA 的表現量與穩定性。轉錄作 用是決定 mRNA 表現量的主要因素， mRNA 的穩定性則是和環境改變時細胞 快速做出反應或與細胞週期間的轉換有關。不同基因 mRNA 的半衰期有很大差 異，80％ 左右的 mRNA 半衰期介於 3 到 8 分鐘，生物功能相近的基因有相 似的半衰期 (Bernstein et al., 2002)。 目 前 已 知 影 響 mRNA 降 解 的 因 素 有 以 下 幾 類 ： (1) 核 糖 核 酸 酶 （rinonuclease） ; (2) mRNA 的結構 ; (3)核糖體與 mRNA 結合的數目 ; (4)其他修飾或輔助的蛋白質。
2.5 核糖核酸酶對 mRNA 穩定性之影響
大腸桿菌中的核糖核酸酶可分為兩類：核糖核酸內切酶（endoribonuclease ） 及核糖核酸外切酶（exoribonuclease）。
2.5.1 核糖核酸內切酶
大腸桿菌分解 mRNA 的核糖核酸內切酶，有 RNase I、RNase G、RNase III 和 RNase E 等。RNase E 與 RNase III 是目前研究最多，作用機制最清楚的
mRNA 內切酶，其功能與作用分述如下。 （1）RNase E（rne）
含有 1061 個氨基酸，分子量為 118 kDa，但在蛋白質膠體電泳上卻移動至 180 kDa 位置，可能是因為在 RNase E 的 C’ 端含有一段 proline-rich 的序列 (Casaregola et al., 1992)。RNase E 是一種多功能性的酵素，對很多 RNA 都有切 割活性 (Ono and Kuwano, 1979) ，包括可以啟始許多 mRNA 的降解，移去 mRNA 3’ 端的 poly(A) tail (Huang et al., 1998)，也參與了 rRNA 與 tRNA 成熟 過程 (Ghora and Apirion, 1978; Li and Deutscher, 2002)。
RNase E 作用位置為單股 RNA 且 AU-rich 的序列區，RNase E 會從 mRNA 的 5’ 端往 3’ 端搜尋適合的切割位置 (Cohen and McDowall, 1997)。此 外，RNase E 會切割自己的 mRNA，具有自我調節（autoregulation）能力 (Jain and Belasco, 1995)。其調節機制為：rne 之 5’-UTR（untranslated region）有髮夾 結構（hairpin）（hp2），當 RNase E 濃度升高，過多的 RNase E 蛋白質會結合 上 hp2，且由 5’ 端往 3’ 端搜尋適合的切割位置並進行切割，導致 rne mRNA 快速被降解，以防止 RNasec E 過度表現 (Diwa et al., 2000)。
當細胞缺乏 rne 基因會造成大部分的 mRNA 降解不完全進而導致菌體死 亡（Belasco and Brawerman, 1993），RNase E 在 mRNA 上的切割作用為 mRNA 降解過程的速率決定步驟 (Bouvet and Belasco, 1992)，研究顯示細胞要生存至少 需要正常 RNase E 濃度的 10-20% (Jain et al., 2002)，由此證明 RNase E 在維 持 mRNA 的穩定性以及菌體生存上，有著極重要的角色。但因為 RNase E 也 參與了 rRNA 與 tRNA 的成熟過程，所以也有科學家推測 rne 缺失後導致 rRNA 成熟不完全才會造成菌體死亡。此外有研究指出 tRNA 成熟不完全才是 主因 (Ow and Kushner, 2002)。
（2）RNase III（rnc）
用受質為雙股 RNA (Robertson et al., 1968)，切割 phosphodiester bond 產生 5’-phosphate 與 3’-hydroxyl termini，其切割位置的保留序列 （consensus sequences）為 A/U N A G A/U G N N C A/U U N N，需鎂離子等正電荷活化。目 前已知 RNase III 的功能為參與 rRNA 的成熟和起始某些 mRNA 的降解。
RNase III 可以切割 rRNA 的 primary transcript，產生 16S rRNA 與 23S rRNA 的前驅物，再和其他核糖核酸酶繼續進行 processing。RNase III 對細胞 而言並非必須的，當 RNaseIII 缺失細胞仍可存活，可是生長速率會下降，推測 是因為 rRNA 成熟過程不完全，使蛋白質合成過程有缺失導致的結果 (Talkad et
al., 1978)。在細菌、噬菌體與質體中，RNase III 可藉由對 mRNA 專一性的結
合與切割，改變 mRNA 的穩定性或構形，使得轉譯效率改變，導致基因表現改 變 （Court, 1993）。如 RNase III 可以切割 phage lambda integrase mRNA 3’-UTR 的 stem-loop 結構，使由 3’ 端往 5’ 端進行切割作用的核糖核酸外切酶得以進 行降解作用 (Gottesman et al., 1982)。
此外 RNase III 可以幫助 PNPase（polynucleotide phosphorylase）進行自我調 控，也可進行本身調控，RNase III 會切割自身 5’-UTR 處的 stem-loop 結構， 如此 RNase III mRNA 就會變得不穩定，容易於被降解 (Matsunaga et al., 1996)。
2.5.2 核糖核酸外切酶
實驗證實，在大腸桿菌中至少有八種核糖核酸外切酶，都是由 RNA 的 3’ 端往 5’ 端進行降解 (Deutscher and Li, 2001)，其中只有 PNPase、 RNase II 與 oligoribonuclease 直接和 mRNA 的降解有關 (Donovan and Kushner, 1986; Ghosh and Deutscher, 1999)。
PNPase 由 pnp 基因產生，位於基因圖譜 69 分鐘的位置，由三個分子量 為 78 kDa 的單體組成 (Regnier et al., 1987)。RNase II 由 rnb 基因產生，位於 基因圖譜 29 分鐘的位置 (Zilhao et al., 1995)，分子量為 72 kDa (Donovan and Kushner, 1983)，RNase II 需要鎂離子與鉀離子來活化它 (Gupta et al., 1977)。
PNPase 與 RNase II 皆作用於單股 RNA，從 3’ 端往 5’ 端進行降解。 PNPase 利用 phosphorolytic mechanism 一次移去 1 個核苷酸，釋放出雙磷酸核 苷酸，RNase II 則是利用 hydrolytic mechanism 一次移去 1 個核苷酸，釋放出 單磷酸核苷酸 (Deutscher, 1993)。兩者皆對 RNA 的二級結構敏感，且無法有效 率與短鏈單股核苷酸結合 (Spickler and Mackie, 2000)，所以短鏈單股核苷酸（3-5 nucleotide）由 oligoribonuclease 進行降解 (Ghosh and Deutscher, 1999)。
分析 E. coli 細胞萃取物發現，由 RNase II 進行的 hydrolytic nuclease activity 佔了 90%，由 PNPase 進行的 phosphorolytic nuclease activity 只佔了 10% (Deutscher and Reuven, 1991)，在兩者同時缺失的情況下，菌體會死亡 (Donovan and Kushner, 1986)。利用 microarray 的實驗發現，雖然 PNPase 只有 10% 的活性，但 PNPase 與其他參與 mRNA 降解的蛋白質會形成一複合體， 稱為 degradosom，其中一個成員 RNA 解旋酶（RNA helicase）可以解開 RNA 的 二級結構，使 PNPase 容易發揮作用 (Py et al., 1996; Liou et al., 2002) ，而 RNase II 並無其他輔助蛋白質，二級結構的阻礙會使 RNase II 的能力大幅下降 (Mohanty and Kushner, 2003)。
在 in vivo 與 in vitro 實驗證實，RNase II 可以穩定某些 mRNA，如： ribosomal protein mRNAs (Pepe et al., 1994; Coburn and Mackie, 1998)，其可能機制 是透過抑制 PNPase 的降解作用。當 RNase II 結合上 mRNA 3’ 端，若此 3’ 端 具有二級結構，則 RNase II 無法進行降解，而 PNPase 或 poly(A) 聚合酶 （poly(A) polymerase）又無法結合上 mRNA，故此 mRNA 獲得保護，不被降解 (Mohanty and Kushner, 2000)。
pnp mRNA 具有自我調控機制且需 RNase III 的參與。首先 RNase III 會在 pnp mRNA 5’-UTR 的 stem-loop 處進行切割，結果仍剩下雙股，接著 PNPase
再進行 3’ 端往 5’ 端的單股切割作用，最後剩下 5’-單股 mRNA，此單股 mRNA 變得不穩定，很快的被其他酵素降解掉 (Jarrige et al., 2001)。
此外，大腸桿菌中還有 RNase R、 RNase BN、 RNase PH、 RNase D 及 RNase T 等核糖核酸外切酶，與 tRNA 的 3’ 端成熟有關 (Li and Deutscher, 1996)。
2.6 mRNA 結構對其穩定性之影響
結構對 mRNA 穩定性的影響可由 mRNA 的 5’ 端和 3’ 端序列分別來討 論。
2.6.1 5’ 端結構對 mRNA 降解之影響
以 out membrane protein A (omp A) 的 mRNA 為例，在菌體內 omp A 的 5’-UTR 會形成兩個髮夾結構，阻止核糖核酸內切酶（如：RNase E）和 mRNA 結合，藉此增加 mRNA 的穩定性 (Emory and Belasco, 1990; Arnold et al., 1998) 。5’-UTR 抑制 mRNA 降解的現象在 RNA I 也得到證實 (Bouvet and Belasco, 1992)。此外 RNase E 比較容易切割具單磷酸 5’ 端的 mRNA (Mackie, 1998) ，故細胞內的 5’ 端三磷酸結構可減慢 RNase E 對 mRNA 最初的降解能力， 使 mRNA 穩定性增加。
2.6.2 3’ 端結構對 mRNA 降解之影響
細胞內的 PNPase 和 RNase II 為核糖核酸外切酶，會從 mRNA 3’ 端往 5’ 端進行降解，其作用受到 mRNA 本身 3’ 端有無二級結構的影響。當 mRNA 3’ 端 形 成 stem-loop 結 構 ， PNPase 和 RNase II 將 無 法 與 mRNA 結 合 ， 且 stem-loop 結構也會阻礙 PNPase 和 RNase II 在 mRNA 上的移動，所以 3’ 端 二級結構可保護上游 mRNA 的穩定性（Belasco et al., 1993）。
近年來發現大腸桿菌中某些 mRNA 轉錄出來後，在 3’ 尾端會再連接一段 poly(A)，稱為 poly(A) tail，合成 poly(A) tail 的酵素為 poly(A) 聚合酶。在真 核生物 3’ 端的 poly(A) tail 會增加 mRNA 的穩定性，但在原核生物中，mRNA
的 3’端有 poly(A) tail 反而會加速降解作用。poly(A) tail 對 mRNA 降解的影 響詳見 2.8。
2.7 核糖體對 mRNA 穩定性之影響
早期的研究指出，利用抗生素抑制轉譯作用會影響 mRNA 的穩定性 (Pato
et al., 1973)。在大腸桿菌中當核糖體與 ompA mRNA 結合後，其 mRNA 降解速
率就會下降 (Lundberg et al., 1988)，RNase E 也會因為 mRNA 特殊切割位置被 核糖體佔住而無法作用，因此增加 mRNA 的穩定性 (Iost and Dreyfus, 1995)。 如此看來，當核糖體附著於 mRNA 上，能延緩 mRNA 被核糖核酸酶降解的速 率，但也有可能在進行轉譯的過程中，mRNA 的二級結構被核糖體解開，導致 PNPase、RNase II 能夠更順利的從 3’ 端開始分解 mRNA，此時核糖體所扮演 的角色則轉為加速 mRNA 的降解（Belasco et al., 1993）。
2.8 其他修飾或輔助之蛋白質
除了核糖核酸酶，另有一些修飾或輔助蛋白質和 mRNA 的降解有關，如 poly(A) 聚合酶、RNA 解旋酶等。
大腸桿菌 poly(A) 聚合酶有兩種，poly(A) 聚合酶 I （pcnB）及 poly(A) 聚 合酶 II (Cao et al., 1996)，細胞中 90% 的 polyadenylation 是由 poly(A) 聚合酶 I 完成的 (O'Hara et al., 1995)。大腸桿菌與真核生物的 polyadenylation 有很大的 不同，大腸桿菌中被加上 poly(A) tail 的 RNA 不到 2% (Cao et al., 1996)，而且 poly(A) tail 的長度通常只有 10-40 個核苷酸 (O'Hara et al., 1995)，在脊椎動物可 超過 200 個核苷酸 (Brawerman, 1973)。更重要的是，在大腸桿菌中，加上 poly(A) tail 通常是標示此 RNA 將被降解 (Xu et al., 1993; Kushner, 2002)。
Poly (A) tail 加速 mRNA 降解的原因目前認為是 poly (A) 提供一段單股核 糖核酸序列，它會提高核糖核酸外切酶（RNase II 或 PNPase）與 mRNA 3’ 端 的 結 合 力 ， 加 速 mRNA 降 解 作 用 (Cohen, 1995) 。 已 知 細 胞 中 會 進 行
polyadenylation 的 mRNA 有 rpsO、 trxA、 lpp、 ompA 等。誘導增加細胞中 的 polyadenylation，會使這些 mRNA 的半衰期顯著減短，但卻會穩定 RNase E 及 PNPase 的 mRNA，也增加了蛋白質產量，對 RNase II 及 RNase III 的 mRNA 則沒有影響 (Mohanty and Kushner, 1999, 2000)。
增加 polyadenylation 會穩定 RNase E 及 PNPase 的 mRNA，解釋這個現 象的說法有二 ：
(1) 一般而言，在大腸桿菌中，polyadenylation 可以增加 mRNA 被降解的 速率，但也有可能 polyadenylation 會穩定某些特定的 RNA (Sarkar, 1997)。
(2) 已 知 RNase E 及 PNPase 皆 具 有 自 我 調 控 機 制 。 當 細 胞 中 的 polyadenylation 增加，表示被標示將要降解的 RNA 增加了，需要更多核糖核酸 酶來進行降解作用，故 RNase E 與 PNPase 進行自我調控，使其 mRNA 穩定 且使得蛋白質產量增多 (Mohanty and Kushner, 2002)。
poly(A) 聚合酶會受到細胞生長速率的調控，當細胞生長速率較慢，pcnB 表 現效率較高，使得細胞內被 adenylated 的 RNA 較多 (Jasiecki and Wegrzyn, 2003)，當 polyadenylation 增加時，mRNA 的降解速率也增加 (Mohanty and Kushner, 1999)。理論上所有 RNA 的 3’ 端皆是 poly(A) 聚合酶的受質，但實際 上效率各有不同。23S rRNA 是很好的受質，而 16S rRNA、 tRNA、 5S rRNA 與 無二級結構的 mRNA 接上 poly(A) tail 的效率並不高 (Mohanty and Kushner, 2000)。
RNA 解旋酶（rhlB）是 DEAD box proteins 之中的一員，DEAD 為 Asp-Glu-Ala-Asp 四個氨基酸的縮寫，因為這類的蛋白質在序列中皆有一段 DEAD 高度保留區，所以稱為 DEAD box proteins。此酵素活性是將 mRNA 上 的雙股結構打開，形成單股 RNA 結構，以促進 RNA 的降解。此過程需要 ATP 參與 (Py et al., 1996)。不論是在 in vivo 或 in vitro 的情況下，RNA 解旋酶可 以單獨和 PNPase 結合，並進行降解作用。這提供了一個可能性，也許不需要
組成複雜的 degradosome，也可以進行 mRNA 的降解 (Liou et al., 2002)。但當 RNA 解旋酶和 RNase E 的 C’ 端結合時，解旋酶的活性會大幅提昇 (Vanzo et
al., 1998)。
2.9 Degradosome
在純化 RNase E 的過程中，科學家發現與 RNA 降解有關的蛋白質會形成 一複合體，稱為 degradosome。其主要組成包括 RNase E、 PNPase、 RNA 解 旋酶、 enolase，此外還有少量的 polyphosphate kinase （PPK）、 GroEL 及 DnaK (Miczak et al., 1996; Py et al., 1996; Blum et al., 1997)。
RNase E 是 degradosome 中最主要的酵素，其 N’ 端為酵素催化的區域， 並且附著於細胞膜上進行降解作用 (Liou et al., 2001)。 C’ 端為與其他成員結合 的區域，將 C’ 端突變後，並不影響細胞的生存，剩下的 RNase E 蛋白質仍有 活性 (Taraseviciene et al., 1995; McDowall and Cohen, 1996)。RNase E 與 PNPase 分別為 degradosome 中的內切酶與外切酶，具有分解 RNA 的功能，RNA 解旋 酶可以解開 RNA 的二級結構，幫助 PNPase 進行降解。
PPK 能可逆性地催化 ATP 上 γ-phosphate 形成 polyphosphate（poly (P) ）。在 in vitro 實驗中，poly(P) 會強烈抑制 RNA 降解。但是在加入 ADP 後， 抑制效果就消失了，因為此時的 PPK 又會將 poly(P) 分解，與 ADP 合成 ATP 。因此 PPK 在 degradosome 內的功用可能是分解 poly(P)，再與 RNA 解旋酶 水解 ATP 後所產生的 ADP 結合，製造 ATP 提供給 RNA 解旋酶重複使用 （ Binnie et al., 1999）。
enolase 為參與醣解反應中的一個酵素，從 2-phosphoglycerate 移走一個水 分子而產生 phosphoenolpyruvate，enolase 在 degradosome 中的角色仍不清楚。 DnaK 是一種熱休克蛋白 (heat shock protein)，GroEL 則是一種 chaperonin 蛋 白，可以幫助蛋白質摺疊（protein folding），具有與 RNA 結合的能力。
，但在細胞中 mRNA 的降解是否必須依靠 degradosome 的形成，仍不清楚。 2004 年，Bernstein 等人利用 microarray 做整體性的觀察，將組成 degradosome 的四個主要蛋白質： RNase E、 PNPase、 RNA 解旋酶與 enolase 分別做突變 ，結果顯示此四個蛋白質對於正常的 RNA 降解都是必須的。並且進一步推測 ， degradosome 會 參 與 某 些 RNA 的 降 解 ， 而 有 些 RNA 的 降 解 則 是 degradosome-independent（Bernstein et al, 2004）。
三、材料與原理方法
3.1 材料 3.1.1 菌種
Escherichia coli K12 (W3110)、N3433、N3431、YHC3393、LK01
（1）K12-W3110：為大腸桿菌野生菌株。
（2）N3433：為 N3431 與 YHC3393 的 isogenic strain（野生菌株）。 （3）N3431：為 rne 基因缺失的突變株，以溫度敏感（temperature sensitive）
形式來調控 rne 基因表現與否，培養於 33。 C 時為野生株， 44。C 處理 30 分鐘則轉換為 rne 基因缺失的突變株。 （4）YHC3393：為 pcnB 基因缺失的突變株，篩選菌株之抗生素為 tetracycline （5）LK01：為 pcnB 基因與 rne 基因雙重缺失的突變株。 K12 -W3110 由 Yale. E. coli 遺傳中心取得，其他菌種皆由中研院分子生 物所林淑端老師所提供。N3433 是 N3431 與 YHC3393 的 isogenic strain， LK01 則是利用 P1 transduction 將 pcnB allele 送入N3431 中。
3.1.2 藥品與試劑
藥品
Difco：yeast extract, tryptone, agar, casamino acid
J. T. Baker：citric acid (monohydrate), glycerol, dextrose (glucose), sodium acetate
Sigma：ampicillin, tetracycline, antiform C 培養液(基)
LB (Luria-Bertani) 培養液：1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl LB 培養基：1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar
Vogel-Bonner 培 養 液 ： 10g/l K2HPO4, 3.5g/l Na(NH4)HPO4⋅4H2O, 0.2g/l
MgSO4⋅7H2O 0.25g/l casamino acid, 2g/l citric acid(monohydrate)
DNA 電泳分析： 藥品
Promega：agarose
J. T. Baker：Tris-HCl , EDTA Viogene：DNA gel extraction kit 緩衝液
TAE electrophoresis buffer：40 mM Tris-HCl, 40mM acetate, 1 mM EDTA 6X DNA gel loading dye (PROtech Lot#AL24)
電泳膠體
1.0 % agarose 溶於 1 X TAE buffer 中
RNA 萃取、電泳及北方墨點分析： 藥品
BDH：chloroform MRC：TRI reagent
Merck ： formamide, formaldehyde, ammonium acetate, ethanol, 3-(N-Morpholino propanesulfonic acid) (MOPS), sodium acetate,
sodium citrate, Denhardt's solution
Roche：Anti-DIG-AP, positively charged nylon membrane, CSPD®, Sigma：diethyl pyrocarbonate(DEPC), rifampincin, Dextran sulfate
J. T. Baker : HCl, NaCl, NH4Cl,(NH4)2SO4, CaCl2, MgCl2⋅6H2O, 2-propanol,
Tris-HCl, sodium dodecyl sulfate (SDS), dimethyl sulfoxide (DMSO)
緩衝液
PCR DIG Peobe Synthesis Kit (Roche 1 636 090) DIG Wash and Block Buffer set (Roche 1 585 762)
10X formaldehyde gel running buffer：0.2 M MOPS, 80 mM sodium acetate, 10 mM EDTA (pH 7.0)
RNA gel loding dye (Ambion cat#8552)
20X SSC, pH 7.0：3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
20X SSPE, pH 7.0：3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4⋅H2O, 0.02 mM EDTA (pH 7.4)
Hybridization buffer：5X Denhardt's solution, 33% formamide, 6.6X SSPE, 1% SDS, 50﹪Dextran sulfate, filtrated
Tris-glycine electrophoresis buffer：25 mM Tris-base, 250 mM glycine (pH 8.3), 0.1% SDS
rifampicin solution：1g rifampicin in 10 ml DMSO, filtrated
DEPC treated water：1 ml DEPC in 1 L ddH2O, shook 2 min, reacted 10 hrs, then autoclaved
5X protein loading dye：100mM Tris-HCl (pH6.8), 200mM Dithoiotreitol, 4% SDS, 0.2% Bromophenol blue, 20% glycerol
電泳膠體
formaldehyde
蛋白質萃取、電泳及西方墨點分析 緩衝液
Lysis buffer：KH2PO4，100mM，pH7
Bio-Rad Protein Assay kit II (Bio-Rad, Cat: No. 500-0002)
1X SDS running buffer：Tris base 1.51g, glycine 9.4g, 10%SDS 5ml in 500ml dH2O
Transfer buffer：glycine 2.93g, Tris base 5.82g, SDS 0.37g in 800 ml dH2O +
200ml methanol
Blocking solution：skim milk 5g, 1X PBS 100ml, Tween20 200µl
1X PBS：NaCl 8g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, PH7.4 in 1L dH2O PBST：0.05% Tween20 + 1X PBS
ECL Western Blotting Detection Reagent (Amersham pharmacia, Cat: RPN2106)
電泳膠體
SDS-PAGE gel (10% polyacrylamide gel) 10% resolving polyacrylamide gel
5.9ml ddH2O, 5.0ml 30% acrylamide mix, 3.8ml 1.5M Tris(pH8.8), 1.5 ml 10% SDS, 0.15 ml 10% ammonium persulfate, 6ul TEMED
5% stacking gel
2.7ml ddH2O, 0.67 ml 30% acrylamide mix, 0.5ml 1.0M Tris(pH6.8), 40ul 10% SDS, 40ul 10% ammonium persulfate, 4ul TEMED
3.2.1 批次式培養（batch culture）之細胞生長模式 批次式培養是指在細胞的培養過程中不再添加任何新鮮的培養液，僅於開 始時提供一定量的培養液供細胞生長所需。由於細胞的生理狀況、培養液的組 成及細胞代謝產物等因素均會影響細胞生長，因此批次式培養時，依細胞生長 濃度與所需時間可作出一條生長曲線 （growth curve）。 在批次式培養過程中，細菌的生長可分為以下六個時期： （1）遲滯期（lag phase） 細菌開始適應新的環境，菌體的重量增加，但不會分裂繁殖。 （2）加速生長期（accelerated growth phase）
菌體開始進行分裂，細胞數目增加，且細菌的生長速率逐漸增加而達 到最高生長速率。
（3）對數生長期（exponential growth phase）
細胞以最高生長速率進行分裂，在一定的時間內分裂一次，此時期菌 體的數目會隨著時間呈對數比例增加。
（4）減速生長期（decelerated growth phase） 菌體生長及分裂速率均降低。 （5）平原期（stationary phase） 細菌的增殖速率與死亡速率相等，細胞數目維持一定。 （6）死亡期（death phase） 因養分已被細菌耗盡，而過量代謝產物的累積導致菌體的毒害作用。 若細菌的死亡速率較其增殖速率快，則細胞數目會開始降低。 本實驗中對細菌生理及生長速率的研究均取對數生長時期的菌體加以分 析。
3.2.2 連續式培養之動力學模式 基於研究或工業所需，可利用連續式培養法將菌體維持在對數生長期。連 續式培養法是藉由控制無菌培養液流入醱酵槽之流速，並以相同的速率將醱酵 槽內的含菌培養液排出，藉此將醱酵槽內菌體維持在對數生長期。 連續式培養法依流量控制方式之不同可分成兩種形式。 （1）化學恆定（chemostat）之連續式培養 利用可調式幫浦直接控制流速，同時由醱酵槽內移除等體積的菌液，維持 槽中菌體處於恆定狀態。流進的無菌培養液中，除了限制生長所需之單一營養 因子（growth-limiting nutrient）外，其餘養份皆足以供應細菌生長所需。此法可 控制菌數處於穩定狀態（steady state），這種在菌數穩定狀態下，培養液養分維 持一定的方法稱為化學恆定連續式培養。本實驗即採用此法。 （2）濁度恆定（turbidostat）之連續式培養 以光電管來控制無菌培養液之流量，此法可以很敏銳地偵測醱酵槽中細胞 濃度的變化。一旦槽體中菌體的吸光度異於設定值，光電管將發出訊號來調控 無菌培養液之流量，藉以維持菌數恆定。 連續式培養之動力學模式如下： 當連續式培養達到穩定狀態時，對反應槽中細胞質量作質量平衡
cell in - cell out + cell growth - cell death = cell accumulation
FX0 / V － FX / V ＋ µX － αX = dX / dt ---（3-1）
其中 X0 ：進料時的細胞質量 X ：細胞質量
μ ：比生長速率（1/hr） α ：比死亡速率（1/hr） F ：流量（l/hr） V ：培養液體積（l）
T ：時間（hr） 由於進料是滅菌後之培養液，為無菌狀態（即 X0 = 0），再者於連續式培養 中，比生長速率遠大於死亡速率（μ>>α），因此（3-1） 式可以簡化如下: （μ- F/V）X = dX / dt ---（3-2） 當反應槽達穩定狀態時，單位時間內菌體質量的變化為零，即 dX / dt ＝ 0 因此由（3-2） 式可得 μ = F / V ---（3-3） 又（3-3） 式中 F/V 可定義為 D = F / V ， 且 D = 1 /τ 其中 D：稀釋速率 τ：培養液流經醱酵槽體的平均滯留時間（residence time，hr） 因此在化學恆定之連續式培養中，僅需決定進料流量（F）或稀釋率（D） 便可以控制細菌的比生長速率（μ）。
3.2.3 聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction，PCR）之原理
聚合酶連鎖反應是在活體外，以基因組 DNA 當模板（template），將某段 特定序列之套數擴增至數百萬倍，利於實驗進行分析。PCR 原理係利用高溫將 雙股基因組 DNA 分成單股（denature），並以兩段單股的引子（primer）與單股 基 因 組 DNA 互 補 接 合 （ primer annealing ）， 經 由 耐 熱 性 高 的 Taq DNA polymerase 產生聚合反應，進行引子下游的序列合成（extention），至此稱為一 個週期。之後重新進行 DNA 分股的步驟，依序進行多個週期。當進行 n 個週 期時，便產生 2n 條特定序列雙股 DNA，藉此達到擴增大量特定序列之目的。
3.2.4 mRNA 半衰期計算原理 mRNA 自 N0 開始降解，最後殘餘數值為 N 時，依下列公式表示： N = N0 / 2n ---（3-4） N0 ： mRNA 最初表現量 N ：一段時間（t）後， mRNA 殘餘表現量 n ：降解半衰期次數 （3-4） 式兩邊取自然對數 ln N0 = ln N ＋ n ln 2 ↓ n = ln（N0 / N）/ ln 2---（3-5） ln 2 = 0.693 代入（3-5）式 n = ln（N0 / N）/ 0.693 ↓ n = 1.443 × ln（N0 / N） ---（3-6） 經由測量 N0 與 N 的量，得到 ln（N0 / N） 代入（3-6）式，可求得 n 。 半衰期（T1/2）即 T1/2 ＝ t / n ，此時 N ＝ 1/2 N0 。 3.3 方法
3.3.1 大腸桿菌生長條件控制與培養方法 （1）菌種活化 挑單一菌落接種於 LB 培養液以活化菌株，於 37℃ 恆溫震盪箱以轉速 200 rpm 進行批次培養。菌株活化後則以 LB 培養基做為繼代保存培養基, 利用 劃線法接種於平板培養基上，於 37℃ 恆溫箱培養到適當大小的菌落,置於 4℃ 冰箱保存。 （2）批次式培養法 將活化後的菌株於三角錐形瓶內，以 100 ml VB 為基礎培養液，葡萄糖或 醋酸為碳源 (10 mM)，在 37℃ 恆溫水浴槽中，轉速 150 rpm 進行批次培養， 培養至 OD600 = 0.3 ~ 0.4 ，抽取 mRNA 進行實驗。 （3）連續式培養法 本實驗所採用的是化學恆定之連續式培養，以稀釋速率 (D) 控制比生長速 率 (µ)，藉此來控制細菌的不同比生長速率。 （i）培養液之製備方法 連續式培養是利用 Vogel-Bonner 培養液作為基礎培養液，加入葡萄糖作為 碳源，使培養液僅有 2.25 mM 的限量碳源（carbon limited）。利用 20 公升的 儲水桶（Nalgene cat No. 2250-0050），每桶裝 17 公升的 Vogel-Bonner 培養液， 同時加入 2 ml 消泡劑 (antifoam C)，配製後於 121℃ ，1 大氣壓下滅菌 100 分 鐘，滅菌後於 4℃ 保存備用，欲使用前再添加已滅菌之所需碳源。 （ii）連續式培養系統之裝置 連續式培養系統可分為四個部份: 醱酵槽體、流速測定管、培養液供應桶、 廢液收集桶，分述如下。 （a）醱酵槽體之組裝 醱酵槽體為連續式培養系統之主體。將槽身及其上的進料管與出料管洗淨 後，加入 1 公升的一次逆滲透水於槽內，將頭蓋板（headplate）安置於槽身。 滅菌前，先用空氣幫浦測試槽體是否密閉，再將冷凝管上的矽膠管開口接上過
濾器（0.22 µm），除冷凝管之開口不得封閉外，其餘各開口及接頭均用鐵夾封閉 並在接頭處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污染。 （b）流速測定管 將測定管上方開口用棉花塞住，然後在接頭處包上錫箔紙，測定管尾端接 上三叉管，三叉管兩端分別接上矽膠管而分成兩條通路，兩端開口各接上一個 接頭。一個接頭與醱酵槽體進料管相接，另一個接頭則與培養液供應桶進料管 相接。 （c）培養液供應桶 利用每桶裝 17 公升之 Vogel-Bonner 培養液的儲水桶作為培養液供應 桶，桶蓋上的兩個接頭，各連接著矽膠管，各矽膠管開口均接上一個接頭，其 中一個接頭與流速測定管相接；另一個接頭則與過濾器（0.22 µm）相接，目的 在於平衡儲水桶內外壓差並過濾空氣，所有開口及接頭均用鐵夾封閉並在接頭 處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污染。 （d）廢液收集桶 廢液收集桶為一個空的 20 公升儲水桶。桶蓋上亦有兩個接頭，各連接著 矽膠管，各矽膠管開口均接上一個接頭，一個接頭與醱酵槽體出料管相接以收 集廢液，另一個接頭與裝有棉花之注射針筒的筒身相接，筒身開口以錫箔紙封 閉，目的也在於平衡桶子內外壓差並過濾空氣，所有開口及接頭均用鐵夾封閉 並在接頭處包上錫箔紙，以防止滅菌後的污染。 醱酵槽體、流速測定管、廢液收集桶三者可同時置於 121 o C，1 大氣壓下 滅菌 30 分鐘。滅菌後將此三部份及培養液供應桶的接頭相連接，於連接過程 皆需過火且快速完成，各連接處包上錫箔紙以避免整個連續式培養系統污染。 （iii）接菌 連續式培養系統於裝置完成後，安裝於蠕動幫浦之進料管管徑大小不一， 須於實驗前利用流速測定管測定蠕動幫浦所控制之實際流速，以視為設定培養 液流速的依據。接菌前需將槽體內裝的一次逆滲透水全部置換成培養液，所需
培養液約為 1 公升，而槽體通氣量則是以氣體流量計來控制。菌株欲進行連續 式培養前，需先於 37 o C 之恆溫振盪培養箱內，以 20ml LB 培養液培養至對數 生長期，作為接菌用母菌。接菌前須在無菌操作台內，將母菌菌液吸入於 20 ml 無菌注射針筒內，接著以 70 ﹪ 酒精消毒醱酵槽體的接菌口後，迅速將菌液注 入槽體內。接菌完成後，先進行批次培養，菌體到達對數生長期後，再啟動已 設定好之蠕動幫浦以控制培養液流速，進而控制細菌的生長速率。 （iv）連續式培養法的條件設定
BIOFLO ΙΙΙ （New Brunswick Scientific Co.） 醱酵槽體的體積為 1.5 公升， 實驗條件為培養液體積 1 公升，培養溫度為 37℃，槽體內葉片攪拌速率為 500 rpm，低溫冷卻槽的溫度控制在 10 ℃。槽體內通氣量則控制於每分鐘 2 公升， 屬於高通氣量。 （v）細菌生長速率之控制 欲控制槽體內的細菌生長速率，可藉由控制菌體之稀釋速率而達到此目 的。而調整蠕動幫浦的設定值可以調控培養液流入槽體之流速，間接調控菌體 之稀釋速率，進而控制槽體內細菌生長速率。欲培養細菌處於某一特定生長速 率之狀態，至少須在改變培養液流速後，相隔 6 倍體積的反應槽內培養液滯留 時間（reactor residence time, τ）才收取菌液，此舉可確保菌體完全處於穩定狀態。 本實驗皆在菌體達到穩定狀態後才收集樣本。 3.3.2 大腸桿菌總 RNA 製備方法 收集 10 ml 菌液 （OD600 = 0.3 ~ 0.4） 置於離心管內，迅速插於 -80℃ 的 酒精桶內冰浴 10 秒鐘後迅速插於冰上，並立刻以 6,000 rpm 在 4℃ 下離心 10 分鐘。去除上清液，以 0.75 ml TRI reagent 將菌塊震盪溶解，將溶液轉置於 微量離心管內，於 65 ℃ 水浴槽內水浴 10 分鐘 (每隔 2.5 分鐘取出，以手搖 方式溫和混合均勻，重複 4 次)，然後在室溫下加入 150μl chloroform，以溫和 手搖方式充份混合均勻，於室溫下靜置 15 分鐘後，在 4℃ 下以 12,000 rpm 離
心 12 分鐘，丟棄下層液，將上清液吸取到另一乾淨離心管內，加入 400 μl 2-propanol 及 40 μl 3 M sodium acetate（pH 5.2），置於 -20 ℃ 冰箱內 30 分 鐘，沉澱 RNA。然後於 4℃，12,000 rpm 離心 12 分鐘，丟棄上清液後留下 RNA 沉澱物，加入 75%乙醇 1 ml 清洗一次，再於 4℃，12,000 rpm 離心 10 分鐘， 完全吸乾上清液後將沉澱之 RNA，進行真空乾燥 10 分鐘，待沉澱物成半溶解 狀時加入適量 DEPC 處理過的二次逆滲透水將其溶解，測定 OD 260 及 OD 280 吸光比值，確定 RNA 的濃度及純度。剩餘之 RNA 樣本則須立刻置於 –80 ℃ 冰箱內保存。 3.3.3 mRNA 穩定性測定方法 收集 100 ml ( OD600 = 0.3 ~ 0.4 ) 菌液，將菌液置於 37℃ 返復式循環水浴 槽內持續震盪培養，先取 10 ml 菌液做為第 0 點的樣品，之後立即將濃度為 0.1g/ml 的 rifampicin 溶液取 500 μl 加入剩餘菌液中混合均勻後，依據不同 時間點分別收取樣品。每次取完後立刻置於 -80℃ 酒精桶內冰浴 10 秒鐘，迅 速插於冰上。其他 RNA 萃取步驟請參照大腸桿菌總 RNA 製備方法（4.2.2）。
3.3.4 北方墨點法（Northern blotting analysis）
（1）RNA 電泳分析
（i）1.2 ％ 洋菜膠（agarose gel）配製
取洋菜膠 0.55 g 加入 29.4 ml DEPC 處理過後的水，加熱溶解並混合均 勻，待稍冷卻後即加入 5 倍濃度的 formaldehyde gel running buffer 9 ml 及甲醛 （formaldehyde） 7.4 ml，再次混和均勻並製成膠體。
（ii）樣品製備
取出下列試劑分別加入微量離心管內並充份混合均勻：8 μg RNA， 2 μl 之 5 倍濃度的 formaldehyde gel running buffer，3.5μl 的 formadehyde (37％)， 10 μl 的 formamid。
（iii） 樣品變性（denature）及電泳處理
將樣本置於 65 ℃ 水浴 10 分鐘後，取出插至冰上，加入 5 μl 染劑 (6X RNA loading dye)，充份混合均勻後於室溫下，60 伏特電壓進行 RNA 電泳 2.5 小時。
（iv）膠體染色
電泳完成後，將膠體浸泡於 150 ml EtBr（Ethidum bromide）染液（0.5 μ g/ml EtBr 溶於 0.1 M ammonium acetate）染色 8 分鐘，接著以 DEPC 處理過 的水進行退染 3 小時後，利用 UV 燈箱即可觀察到 rRNA，之後進行照相。
（2）RNA 轉漬
此轉漬原理係利用厚濾紙產生的毛細現象，引導 20X SSC 溶液向上流動， 進而帶動膠體中的 RNA 脫離膠體，吸附於 nylon membrane。
退染後若看到的 rRNA 非常明顯（sharp），則進行 RNA 轉漬。剪裁與膠 體面積相同之 8 × 7 cm 的 nylon membrane，轉漬前先將與膠體面積相同的 nylon membrane，以 20 X SSC 溶液浸溼。取一方形容器，其內放置一個 2 ~ 4 cm 高的方形塑膠盒，此塑膠盒表面需平整，且略大於膠體。倒入適量的 20X SSC 溶 液於方形容器內，於塑膠盒表面鋪上一張 7 ×22 cm 長方形的 Whatman 3MM 濾紙，濾紙二端需浸到 20X SSC 溶液。然後濾紙上層再鋪一張 8 × 7 cm 的 Whatman 3MM 濾紙，此濾紙長寬與膠體相同，並用 20X SSC 溶液使其潤濕。 將膠體反轉（原來電泳時朝下的一面朝上），置於已經溼潤的濾紙上，接著把濕 潤的 nylon membrane 置於膠體上，再放一張 8 × 7 cm 的 Whatman 3MM 濾紙 於 nylon membrane 上方，在濾紙、膠體、 nylon membrane 與濾紙相互之間必 須把氣泡完全趕出，避免 RNA 轉漬不完全。最後放一疊 6 ~ 7 cm 高的厚濾紙 ( 長寬約為 8 × 7 cm )在 Whatman 3MM 濾紙上，厚濾紙最上層置一塑膠板並用 500 公克重的血清瓶壓住。
轉漬過程進行 12 ~ 16 小時後，取出 nylon membrane，置於核酸快速固定 儀中，利用 UV 光（254 nm）照射 2 分鐘使 RNA 固定於 nylon membrane 上
以進行雜交反應。 （3）核酸探針製備
本實驗我們利用聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction；PCR）來擴 增一段序列上含有 DIG-11-dUTP ( Roche PCR DIG Probe Synthesis Kit Cat. No. 1 636 090 ) 的 DNA，用此段 DNA 來做為核酸探針，其做法敘述如下：將 63 μl 滅菌二次逆滲透水，10 μl 10X PCR reaction buffer，10 μl DIG-labeling mixture， 8 μl(25 ng/μl) DNA 模版，4 μl(20 μM ) primer 1 與 primer 2， 5 units Taq DNA polymerase，依序放入 0.5 ml 的微量離心管內（eppendorff tube），最終体積為 100 μl。混合均勻後放入聚合酶溫度循環機進行反應。
PCR 設定溫度如下：
將上述微量離心管內混合液先於 95℃ 下反應 5 分鐘，分開所有 DNA 模 板，再進行以下之溫度循環步驟：
(i) 95℃，1 分鐘：使兩股 DNA 模板分開。 (ii) 60℃，1 分鐘： primer 與 DNA 模板結合。
(iii) 72℃，1 分鐘： DNA polymerase 合成新股 DNA。
重覆上列溫度循環 30 次，之後進行 72℃，反應 10 分鐘，使最後一次合 成未完全的 PCR 產物合成完全，最終保存溫度設定為 4℃。
本實驗 fumA 核酸探針的 primer A1 及 primer A2 的序列如下： primer A1：5’– GTTACTGACGCCGGGGAAACTG – 3’ (22 mer) primer A2：5’– CCAAGATTTTGCGCTTCGATCA – 3’ (22 mer)
fumA 核酸探針的預期長度為 250 bp，但由於在 dUTP 上接有 DIG 的關
係，在電泳膠上的位置會略高於 250 bp，約在 300 bp ~ 400 bp 之間。
fumC 核酸探針的 primer C1 及 primer C2 的序列如下：
primer C2：5’– CGACGAATTCCCGCTGGCTATCTGGCA –3’ (27 mer)
（4）雜交反應（hybridization）
將 RNA 固定在上面的 nylon membrane 放入玻璃雜交管內，加入 15ml 的 hybridization buffer，於 42℃ 核酸雜交烘箱旋轉反應 30 分鐘，轉速設定為 30 rpm，此過程稱為 Pre-hybridization。之後加入 150 ng 的核酸探針 (核酸探針需 先以 100℃ 煮沸 10 分鐘後，置於冰上 10 分鐘)，繼續進行 42℃ 的核酸雜交 烘箱旋轉反應，反應時間為 14 ~ 18 小時。反應結束後將 nylon membrane 自玻 璃雜交管取出，平放於微免疫偵測反應盒內，加入含 2 X SSC， 0.1 ％ SDS 的 洗滌液 50 ml，在室溫下以平面震盪的方式清洗 5 分鐘，震盪速度為 25 rpm， 共洗二次；再用含 0.1 X SSC， 0.1 ％ SDS 的洗滌液 50 ml 清洗 15 分鐘， 共洗 三 次。 （5）免疫偵測（immunological detection）
本實驗所採用的是 Roche 公司所生產的 DIG Wash and Block Buffer Set (Cat. No. 1 585 762)，內含有 10 倍濃度的 buffer 1、2、3 和 4。將 nylon membrane 用洗滌液清洗完畢後，用 30 ml 的 1X buffer 1 清洗 5 分鐘，倒掉 1X buffer 1 後， 加入 30 ml 的 1X buffer 2 與 1X buffer 3 混和液，於室溫下， 以平面震盪的方式搖動 40 分鐘，震盪速率為 25 rpm 。目的在於使 buffer 3 中 的 Brovine Serium Albumin (BSA) 均勻佈滿整張 nylon membrane 表面，避免 anti-DIG-AP 直接與 nylon membran 結合，此舉可以減少大量非專一性之鍵結 （non-specific binding），這個步驟稱為 blocking 。反應結束後將 3 μl 的 anti-DIG-AP( Roche Cat. No. 1 093 274 ) 加入 30 ml 的 1X buffer 2 與 1X buffer 3 混和液，於室溫下搖動 40 分鐘，使 anti-DIG-AP 與核酸探針上的 DIG 形成專一性之鍵結。之後於室溫下，用 30 ml 的 1X buffer 1 清洗兩次，每次 15 分鐘。倒掉 1X buffer 1 後，加入 15 ml 的 1X buffer 4 清洗 5 分鐘，之後把 nylon membrane 平放於投影片夾層內，將 10 μl 的 CSPD® 溶於 1 ml 的 1X
buffer 4 內，均勻灑佈於 membrane 上，蓋上投影片，立刻置於底片夾內，於室 溫下避光進行反應 15 分鐘。反應後於暗房內以 X 光底片（Kodak XAR-5）進 行壓片，感光適當時間後沖洗底片。
（6）訊號分析
利用掃描器（Microteck）將底片掃成 .tif 圖檔，存進電腦中，再利用 Zero-Dscan Quantitative Gel and Blot Analysis (Scannalytics) 軟體偵測每一個雜交 訊號（hybridization signal）的強度，並將所測得的數值與不同的採樣時間點做 一關係圖，利用線性回歸分析在不同時間點所得的雜交訊號強度，可算得 mRNA 的半衰期。 3.3.5 蛋白質上清液之製備 以批次式培養法進行不同碳源的培養，待細胞生長達對數期便可收集樣 本，樣本一收集後需立刻置於冰上 10 分鐘，目的在停止菌體的生長。然後於 4 o C， 6,000 rpm 離心 10 分鐘。將沉澱菌塊溶於 1ml 100mM phosphate buffer（pH 7.6），再利用超音波震盪器於冰塊中打破細胞。調整超音波以 2 分鐘為一個週 期 ， 其 中 10 秒 超 音 波 震 盪 ，10 秒 停 止 ， 可 以 得 到 打 破 細 胞 的 溶 胞 產 物 （lysate）。溶胞產物於 4 oC，12,000 rpm 離心 30 分鐘，離心後取出上清液即 為蛋白質上清液，樣本可置於 – 20 ℃保存。 3.3.6 蛋白質濃度測定 上清液中蛋白質的定量係採用 Bradford 於 1976 年所發表的原理。利用 Coomassie Blue G-250 在酸性溶液下為紅棕色，當它與帶正電的蛋白質相鍵結後 會變成藍色，而因蛋白質濃度的不同而反應後所生的顏色也有程度上的變化， 再利用分光光度計於 OD595 測定吸光值，經由標準溶液內蛋白質的量與吸光值 作關係圖，即可換算出上清液蛋白質的含量。
液稀釋 10 倍，再依序取不同體積的 BSA 溶液 (10、20、40、60、80、100、120 µl ) 加入 200µl 的染劑（Coomassie Brilliant Blue G-250 dye），並加無菌水至總 體積為 1 ml，以分光光度計（spectrophotometer）測量 OD595的吸光值，作出吸 光值與濃度關係的標準曲線。之後取適當體積的蛋白質上清液（約 5µl）， 加 入 200µl 的染劑，並加無菌水至總體積為 1ml，以分光光度計測量 OD595 的吸 光值，將吸光值與標準曲線比較並換算出蛋白質濃度，以得知細胞萃取液內總 蛋白質濃度。 3.3.7 蛋白質凝膠電泳法 首先以酒精擦拭組成鑄膠器的各部分，將鑄膠器架設好，依照配方配製 12% 下層的 resolving gel 溶液，注入鑄膠器內至距離上方約 2.5 cm，再小心加上一 層水層使凝膠水平，在室溫下靜置約 30 分鐘後將水層倒掉，配製 5% stacking gel 溶液，注入鑄膠器內並插入齒梳 (comb)，在室溫下靜置約 30 分鐘待膠完 全凝固，將作好的膠體移至電泳槽中，拿掉齒梳並加入電泳緩衝液 (Tris-glycine running buffer) (5mM Tris-base, 50mM glycine, 0.1﹪SDS)。將細胞萃取液依照定 量結果取出適量蛋白質樣品 (10 µg)，依照樣本體積加入 5X loading dye (300mM Tris-Cl, pH6.8, 10% SDS, 0.125% bromophenol blue, 50% glycerol, 25% 2-mercaptoethanol)，於沸水中加熱 5 分鐘後置於冰上，之後於電泳膠體的 well 中依序置入 marker 及樣本，以電壓 80 伏特 進行電泳，直到樣本由 stacking gel 移至 resolving gel 中，改變電壓為 100 伏特，持續進行電泳直到所有染劑 皆由膠體底部跑出為止。
3.3.8 西方墨點法 (Western blotting analysis)
預 先 浸 泡 數 張 3MM paper 在 transfer buffer (39mM glycine, 48mM Tris-base, 0.037﹪SDS, 20﹪methanol) 中約 10 分鐘，此外將 PVDF membrane 以甲醇 (methanol) 浸泡約 5 分鐘後，也浸泡在 transfer buffer 中備用。在蛋白
質凝膠電泳完成之後，將膠體由電泳裝置中取出，在膠體右上方作記號，浸泡 在 transfer buffer 約 5 分鐘，之後依序將 3MM paper、膠體、 PVDF 膜、 3MM paper 由負極至正極在 gel holder cassette 裝置上排列好，並確認無氣泡產生，放 入裝有 transfer buffer 的直立電泳槽中，確認擺放及電流方向，並放入一個低溫 的冰寶以維持電泳時的低溫。以 200 毫安培定電流電泳 2 小時，轉移完成後 將 membrane 取出，把含有蛋白質樣本的那一面朝上，放在保鮮盒內並加入 blocking reagent (5﹪skim milk, 0.2﹪Tween-20) 進行 blocking，放置在 shaker 上 輕搖，室溫下 1 小時或 4℃ 下過夜。之後將溶液倒出，加入含有一級抗體的溶 液，放置在 shaker 上輕搖，室溫下 1 小時，倒出含有一級抗體的溶液後以 PBST (1X PBS, 0.05﹪Tween 20) 溶液清洗 3 次，每次 5 分鐘，再加入含有二 級抗體的溶液，放置在 shaker 上輕搖，室溫下 1 小時，再以 PBST 溶液清洗 3 次，每次 5 分鐘。清洗完畢後將溶液完全取出，在 membrane 上加入混合好 的 ECL 溶液，使溶液完全覆蓋在 membrane 上作用約 2 分鐘，將多餘的溶液 去除，把 membrane 移至壓片裝置中，於暗房進行壓片及沖洗底片以觀察結果， 之後將 PVDF 膜以 amido black (0.1% amido black, 40% methanol, 10% acetic acid) 染色以確認 loading 蛋白質總量。
利用掃描器將底片掃成 .tif 圖檔存進電腦中，再利用 Zero-Dscan 軟體偵測 每一個訊號帶的強度，即可得到不同碳源生長條件下蛋白質量的變化情形。
四、結果
4.1 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因表現之影響
本實驗為批次式培養條件下，碳源為 10mM 葡萄糖或 10mM 醋酸，探討 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄、轉錄後及轉譯三個層次的影響。所利 用的菌株為野生株（K12-W3110）、N3431 的 isogenic strain（N3433）及 RNase E 單基因突變株（N3431）（見表一）。RNase E（rne） 是近年來研究大腸桿菌 mRNA 降解的重要酵素，RNase E 對許多 RNA 都有切割的活性，一旦 RNase E 缺 失 會 導 致 菌 體 死 亡 。 因 此 利 用 溫 度 敏 感 的 方 式 來 構 築 rne- 突 變 株 (N3431)。當 N3431 培養於 33。C 時，RNase E 正常表現，一旦轉置於 44。C 恆 溫水浴槽 30 分鐘後，rne 完全不轉錄，成為 rne- 突變株。 4.1.1 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄層次之影響 將大腸桿菌 K12-W3110、 N3433 及 N3431 分別培養於 10mM 葡萄糖或 10mM 醋酸的生長基質中，當細胞處於對數生長期且 N3431 經 44℃、 30 分 鐘誘導 rne 基因突變後，萃取大腸桿菌的總 RNA，取定量的總 RNA 進行膠體 電泳。經由 EtBr 染色後可以得到（圖一 B）的電泳圖，其中兩條亮帶分別為 23S rRNA 與 16S rRNA。23S rRNA 為 2904 個核苷酸，16S rRNA 為 1541 個核 苷酸。可經由兩亮帶的訊號強度作為 internal control，重複確認定量之正確與 否，之後再以我們所製備的 fumA 基因單股 DNA 作為探針，進行北方墨點分 析，得到（圖一 A）的結果。將所得的結果利用 Zero-Dscan 軟體測定各訊號的 強度，可知不同條件下 fumA mRNA 表現量的變化。 實驗結果發現，無論是 K12-W3110、N3433 或 N3431，菌株以醋酸為碳源 時，fumA mRNA 表現量皆大於以葡萄糖為碳源時 (見圖一)。在 K12-W3110 中，以醋酸為碳源時，fumA mRNA 表現量較以葡萄糖為碳源時上升了 4 倍，在
N3433 中則上升 23 倍，在 N3431 中上升 21 倍。
4.1.2 不同碳源對大腸桿菌 fumA 基因在轉錄後層次之影響
將大腸桿菌 K12-W3110、 N3433 及 N3431 培養於 10mM 葡萄糖或 10mM 醋酸的生長基質中，當細胞處於對數生長期且 N3431 經 44℃、30 分鐘 誘導 rne 基因突變後，加入 rifampicin 停止 mRNA 的新合成。rifampicin 會與 大腸桿菌 RNA polymerase 的 α subunit 形成鍵結而抑制轉錄的啟動，如此可使 mRNA 停止生成，細胞中僅會進行降解反應。在加入 rifampicin 後的不同時間 點 抽 取 菌 體 總 RNA ， 取 定 量 總 RNA 進 行 北 方 墨 點 法 ， 所 得 結 果 利 用 Zero-Dscan 軟體測定各訊號的強度，並以 mRNA 半衰期計算公式加以計算（請 參考 3.2.4 mRNA 半衰期計算原理），即可測定大腸桿菌 fumA mRNA 的半衰期。
實驗結果發現，無論是 K12-W3110、 N3433 或 N3431，在細胞以葡萄糖 為碳源時，fumA mRNA 的半衰期皆大於以醋酸為碳源時 (見圖二)。K12-W3110 以葡萄糖為碳源時，fumA mRNA 半衰期為 2.5 分鐘，以醋酸為碳源時則為 1.5 分鐘。N3433 以葡萄糖為碳源時，fumA mRNA 半衰期為 3.2 分鐘，以醋酸為碳 源時則為 2.1 分鐘。N3431 以葡萄糖為碳源時，fumA mRNA 半衰期為 9.8 分 鐘，以醋酸為碳源時則為 3.8 分鐘 (見表二)。 4.1.3 不同碳源對大腸桿菌 FumA 蛋白質在轉譯層次之影響 利用批次式培養，將大腸桿菌 K12-W3110、 N3433、 N3431 培養於 10mM 葡萄糖或 10mM 醋酸的生長基質中，當細胞處於對數生長期且 N3431 經 44 ℃、 30 分鐘誘導 rne 基因突變後，將菌體立刻放在冰上 10 分鐘，終止細胞 所有反應。之後低溫離心蒐集菌體，並以超音波震盪的方式打破細胞，抽取菌 體總蛋白質，取定量總蛋白質進行膠體電泳，再以 FumA 的抗體進行西方墨點 法，所得結果利用 Zero-Dscan 軟體測定各訊號的強度，即可知在不同碳源下 FumA 蛋白質的變化量。
實 驗 發 現 細 胞 以 葡 萄 糖 為 碳 源 時 ， 無 論 是 K12-W3110 、 N3433 或 N3431，FumA 蛋白質表現量皆大於以醋酸為碳源時。K12-W3110 以葡萄糖為碳 源時，FumA 蛋白質表現量較醋酸為碳源時上升 0.1 倍，在 N3433 中則上升 0.2 倍，在 N343 1 中上升 1.1 倍 (見圖三)。
4.2 影響 fumA 與 fumC mRNA 穩定性的因素
由前述結果可發現，大腸桿菌培養在不同碳源下，fumA mRNA 的穩定性也 有所不同。目前認為影響 mRNA 穩定性的因素有四大類：(1)核糖核酸酶，(2) mRNA 的結構，(3)核糖體與 mRNA 結合的數目，(4)其他修飾或結合上 mRNA 的蛋白質。
近年來發現一些參與大腸桿菌 mRNA 降解的酵素會以 degradosome 的複 合體存在，其組成有 RNase E、 PNPase、 RNA 解旋酶與 enolase，而 RNase E 是 degradosome 中最主要的酵素 (Miczak et al., 1996; Py et al., 1996; Blum et al., 1997)。此外，大腸桿菌中某些 mRNA 轉錄出來後，在 3’ 尾端會再連接一段 poly(A) tail，合成 poly(A) tail 的酵素為 poly(A) 聚合酶（pcnB）。目前認為 poly (A) tail 提供了一段單股核糖核酸序列，可以提高核糖核酸外切酶 (RNase II 或 PNPase) 與 mRNA 3’ 端的結合力，進而加速 mRNA 降解作用 (Xu et al.,1993; Kushner, 2002)。 本實驗是利用醱酵槽進行連續式培養，藉由控制培養液的稀釋倍數來控制 細 胞 生 長 速 率 。 條 件 設 定 為 葉 片 轉 速 500 rpm ， 通 氣 量 為 2L/min ， 以 Vogel-Bonner (VB) 培養液作為基礎培養液，加入葡萄糖作為碳源，使培養液僅 含 2.25 mM 的限量碳源，培養液流速分別控制在 4 ml/min、 8 ml/min、 12 ml/min 及 16 ml/min （比生長速率各為 0.24/h、 0.48/h、 0.72/h、 0.96/h）， 藉此控制細胞的生長速率。利用 N3431 的 isogenic strain （N3433）、 rne
突變
株 （N3431）、 pcnB - 突變株 （YHC3393）及 rne-、 pcnB - 雙突變株 （LK01）
