一、試驗材料 (一) 發酵菌種
本實驗菌種是在台灣大學園藝學系加工館第三研究室 (以下簡 稱本實驗室)在蘋果切片浸漬醋的加工製作過程中，發現部分樣品有 那塔的生成，為了探討造成蘋果切片浸漬醋生成那塔的原因，因此由 生成那塔的蘋果浸漬醋作為取樣樣本，再經過集殖培養與分離純化後 所得之菌體，為發酵菌酛。
(二) 樣品原料
1. 商用糯米醋：4oBrix 之糯米醋，可滴定酸含量 3.7%；購自大安工 研食品工廠股份有限公司。
2. 濃縮蘋果汁：70.2oBrix 之凍藏濃縮蘋果汁，可滴定酸含量 1.3%；
購自佳美食品工業股份有限公司。
3. 新鮮蘋果：浸漬 30 天的蘋果，是 11.4oBrix 之新鮮蘋果，品種為紐 西蘭 ROYAL GALA 蘋果，可滴定酸含量 0.25%；購自 水源果菜市場。
浸漬60 天的蘋果，是 13.8oBrix 之新鮮蘋果，品種為青 津、富士與德國，來自台灣大學山地農場。
2. 磷酸二氫銨 (Ammonium dihydrogen phosphoate)：日本林純公司出 品。
3. 氫氧化鈉 (Sodium hydroxide)：日本林純公司出品。
4. 洋菜 (Agar)：美國 Becton Drive 公司出品。
5. 酵母萃取物 (Yeast extract)：美國 Becton Drive 公司出品。
6. 蛋白腖 (Peptone)：美國 Becton Drive 公司出品。
7. 醋酸 (Acetic acid)：日本片山試藥株式會社出品。
8. 蘋果酸 (Malic acid)：Sigma 公司出品。
9. 葡萄糖酸 (Gluconic acid)：Merck 公司出品。
10. 硫酸 (Sulfuric acid)：日本 Nacalai tesque 公司出品。
11. 磷酸 (Phosphoric acid)：日本 Nacalai tesque 公司出品。
12. 甲醛 (Formaldehyde 37% solution)：美國 J. T. Baker 公司出品。
13. 甲醇 (Methanol)：美國 J. T. Baker 公司出品。
14. 次氯酸鈉 (Sodium hypochlorite)：台灣鴻益化工原料公司出品。
(四) 培養容器
1. 血清瓶 (Serum Bottles)：1000mL，德國 Schoot 公司出品。
2. 有桶蓋之透明 PET 桶 (直徑：15.5 cm；高度：22.1 cm)。
二、儀器設備
(一) 酸鹼度計 ( pH meter)：PHEP2 型，美國 HANNA 公司出品。
(二) 糖度曲折計： Abbe-3L 型，美國 Baush & Lomb 公司出品。
(三) 高效率液相層析儀 HPLC：日本 JASCO 公司出品。
(四) 氣相層析儀 (GC)：Model 6890 GC，美國 Angilent 公司出品。
(五) 氣相層析質譜儀 (GC/MS)：Model 5973N 四極桿式質譜儀 (MS
D)，美國 Angilent 公司出品。
(六) 培養箱： Eectric incubator KS31， Kwang Shen 公司出品。
三、實驗方法
(一) 蘋果浸漬醋之製備 1. 蘋果浸漬醋
參考林 (2007)的研究結果，以及本實驗室製作蘋果切片浸漬醋時 所使用之條件，清洗蘋果時分為蘋果十倍重量之自來水浸泡 10 分 鐘，與蘋果十倍重量之 100ppm (mg/kg)次氯酸水浸泡 10 分鐘二組別。
蘋果清洗後分為切片 (以切片機切成厚度 3 mm )與打漿 (以果汁機打 碎至果肉顆粒直徑小於 1 mm)兩組，與商用糯米醋以重量比，3：7 (0.6kg：1.4kg )的比例置於有桶蓋之透明 PET 圓桶 (直徑：15.5 cm；
高度：22.1 cm)內浸泡 30 天。分為兩種清洗方法之目的，為欲鑑定造 成蘋果浸漬醋生成那塔之菌種，是否來自於蘋果表皮；蘋果以切片處 理之目的，為模擬製作時之條件；蘋果以打漿處理則是為了與還原蘋 果汁浸漬醋做比較，觀察同重量的還原果汁與新鮮蘋果經過 30 天的 浸漬之後，成分上的差異。
2. 還原蘋果汁浸漬醋
將濃縮蘋果汁加蒸餾水稀釋至 14 oBrix，與商用糯米醋以重量 比，3：7 (0.6kg：1.4kg )的比例置於有桶蓋之透明 PET 桶內浸泡 30
培養那塔生成所添加於蘋果浸漬醋液之菌酛，是將分離純化自生 Apple slice infused vinegar APV 水洗蘋果漿浸漬醋
Apple puree infused vinegar
ASVCl 100ppm 次氯酸水洗蘋果切片浸漬醋
100ppm HClO3 washed apple slice infused vinegar APVCl 100ppm 次氯酸水洗蘋果漿浸漬醋
100ppm HClO3 washed apple puree infused vinegar RAJV 還原蘋果汁浸漬醋
Reconstituted apple juice infused vinegar NASV 生成那塔之水洗蘋果切片浸漬醋
(三) 調整糖度之抑菌試驗
將濃縮蘋果汁以蒸餾水稀釋至 14 oBrix，與商用糯米醋以重量 比，3：7 (1.5kg：3.5kg )的比例調配完成後，分置於血清瓶內並加入 10% (v/v)比例的菌液，再添加蔗糖調整至不同可溶性固形物濃度後，
在培養箱內以30oC 靜置培養 30 天。
(四) 微生物之鑑定
取商用糯米醋、ASV 與 NASV，以醋酸菌選擇性培養基進行分 離純化，再次培養活化之後進行菌種鑑定。並以 LA (Luria –Bertani agar)與 NA (Nutrient agar)培養基培養，鑑定其生成菌落。
LA 的成分： NA 的成分：
Tryptone 10g Beef extract 5g Yeast extract 5g Peptone 10g
NaCl 10g NaCl 2g
Agar 15g Distilled water 1.0L Nata formation apple slice infused vinegar NAPV 生成那塔之水洗蘋果漿浸漬醋
Nata formation apple puree infused vinegar NRAJV 生成那塔之還原蘋果汁浸漬醋
Nata formation reconstituted apple juice infused vinegar CRV 商用糯米醋
Commercial rice vinegar
四、試驗設計